具有抗腫瘤活性的PD-L1 IgV親和肽S10的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的靶向PD-L1?IgV的親和肽S10產(chǎn)品及其制備和應用。該親和肽S10特異性結(jié)合于PD-L1?IgV區(qū)，其氨基酸序列為WSHGGHQHFIRF，分子量為1507.7。親和肽S10通過Fomc固相多肽合成法制備，在制備抗結(jié)腸癌藥物中作為主要活性成分發(fā)揮作用。本發(fā)明所提供的親和肽S10通過利用噬菌體展示肽庫篩選技術，以PD-L1?IgV為靶點進行高通量篩選獲得。發(fā)明人通過小鼠體內(nèi)荷瘤實驗，證明了親和肽S10具有較好的抗腫瘤活性，能明顯抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的增長，從而為基于PD-L1的藥物研究和開發(fā)提供新的思路和理論基礎。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的PD-L1 IgV親和肽S10

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種具有抗腫瘤活性多肽產(chǎn)品的篩選、 制備及應用，更具體的，本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的靶向ro-Li igv的親和肽sio產(chǎn) 品及其制備和應用。

【背景技術】
[0002] 近年來，腫瘤的防控形勢非常嚴峻。隨著臨床診斷、手術治療、化療和放療等水平 的提高，使得一部分病人能夠得到早發(fā)現(xiàn)、早治療，并且獲得較好的預后，但是，尋找新的治 療手段和治療藥物一直是全球范圍內(nèi)的研究熱點。與傳統(tǒng)的治療方法相比，腫瘤免疫治療 能夠激活或者誘導腫瘤患者建立起對腫瘤抗原的特異性免疫應答，清除原發(fā)的腫瘤細胞， 并且建立免疫記憶，阻止腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003] 在腫瘤免疫治療過程中，負性共刺激分子主要介導免疫耐受和逃逸，而前人在腫 瘤免疫治療過程中遇到的最大挑戰(zhàn)就是由于腫瘤免疫耐受和逃逸所導致的療效不佳。因 此，探討通過抑制負性共刺激分子所介導的信號通路以打破機體已經(jīng)建立的對腫瘤細胞的 免疫耐受具有重要的理論意義和應用價值。
[0004] T細胞的激活需兩個來自細胞外的信號刺激，即淋巴細胞活化的雙信號作用。細胞 活化的第一信號主要來自細胞抗原識別受體（TCR )與MHC分子抗原肽復合物的特異性結(jié) 合，此過程為抗原識別。細胞活化的第二信號又稱共刺激信號，是由抗原遞呈細胞（APC)和 細胞表面的粘附分子對提供。這些粘附分子被稱為共刺激分子，是一類細胞膜表面分子，可 為T、B細胞的活化提供輔助信號，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、活化及分化。根據(jù)產(chǎn)生的效應不 同，可將共刺激分子分為正性共刺激分子和負性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、 IC0S、4-1BB等分子，而負性共刺激分子則包括CTLA-4、PD-1、--Μ-3等分子。
[0005] Η)-1 /PD-L1作為B7/⑶28家族成員，已被證實通過抑制T細胞的活化和增殖來 負調(diào)控免疫應答，并在調(diào)節(jié)免疫耐受、腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。因而利用H)-L1的阻 斷劑作為腫瘤免疫治療藥物或佐劑具有很好的應用前景和安全性，而現(xiàn)有技術中，尚缺少 較好的ro-Li的阻斷劑產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種具有較好抗腫瘤活性的靶向ro-Ll IgV的親和肽S10產(chǎn) 品，可以特異性利用PD-L1蛋白IgV區(qū)（PD-L1 IgV)作為結(jié)合靶點，從而最終阻斷ro-Ι / PD-L1的活化，解除對T細胞的活化和增殖的抑制作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0007] 具體而言，本發(fā)明采用的技術方案如下： 一種具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll Igv親和肽S10,特異性結(jié)合于ro-Ll Igv 區(qū)，其氨基酸序列為：Trp-Ser-His-Gly-Gly-His-Gln-His-Phe-Ile-Arg-Phe,即 W-S-H-G-G-H-Q-H-F-I-R-F，分子量為 1507. 7。
[0008] 所述具有抗腫瘤活性靶向H)-L1 IgV親和肽S10,添加藥學上可接受的載體或/和 添加劑后，在制備抗結(jié)腸癌（CT26)藥物中作為主要活性成分發(fā)揮作用。
[0009] 所述具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll IgV親和肽S10,通過Fomc固相多肽合成法人工 合成制備。
[0010] 在對靶點進行高通量篩選親和肽過程中，發(fā)明人采用了庫容量大、操作簡便的噬 菌體展示肽庫技術進行了篩選。噬菌體展示肽庫技術是將外源蛋白或多肽序列插入在M13 喔囷體衣殼蛋白P III的N末端，通過蛋白的融合表達將插入的隨機多膚序列展不在喔囷體 表面。由于展示多肽位于P III的N末端，這些小肽通常能夠保持較為獨立的空間結(jié)構(gòu)，從而 能夠模擬配體與特異性受體靶標相互作用。
[0011] 本發(fā)明通過利用噬菌體展示肽庫篩選技術，以ro-Ll IgV為靶點進行高通量的篩 選，人工合成了具有抗腫瘤活性的親和肽S10。發(fā)明人進一步通過小鼠體內(nèi)荷瘤實驗，證明 了本發(fā)明所提供的靶向ro-Ll IgV親和肽S10具有較好的抗腫瘤活性，能明顯抑制小鼠體 內(nèi)腫瘤的增長，從而為基于ro-Li的藥物研究和開發(fā)提供新的思路和理論基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是ELISA鑒定親和肽S10噬菌體單克隆與ro-Ll IgV蛋白的親和力結(jié)果圖； 圖2是親和肽S10的質(zhì)譜鑒定圖； 圖3是親和肽S10對荷CT26結(jié)腸癌小鼠體重變化的影響結(jié)果圖； 圖4是親和肽S10對荷CT26結(jié)腸癌小鼠瘤體積變化的影響結(jié)果圖； 圖5是親和肽S10對荷CT26結(jié)腸癌小鼠生存期實驗結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0014] 實施例1 本發(fā)明所提供的具有抗腫瘤活性靶向ro-Li igv親和肽sio,特異性結(jié)合于ro-Li igv 區(qū)，是利用噬菌體展示肽庫技術篩選得到的，其氨基酸序列為： Trp-Ser-His-Gly-Gly-His-Gln-His-Phe-Ile-Arg-Phe，即W-S-H-G-G-H-Q-H-FI-R-F， 分子量為1507. 7。
[0015] 由于單抗藥物的成本高昂，且不能大規(guī)模生產(chǎn)，因此，我們選用由原核表達純化的 PD-L1 IgV區(qū)蛋白作為靶點，通過噬菌體展示技術來篩選得到能與ro-Ll IgV特異性結(jié)合的 多肽，用以阻斷ro-1/PD-Ll信號通路。為便于本領域技術人員實施本發(fā)明，對其篩選過程 簡要說明如下： 篩選過程中所用培養(yǎng)基和主要溶液的配制說明如下： LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，加超純水定容至1 L， 121°C高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后室溫貯存?zhèn)溆谩?br> [0016] LB固體培養(yǎng)基：1 L LB液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂粉，加熱使瓊脂粉充分溶解， 攪拌均勻并分裝為1〇〇 mL/瓶，121°C滅菌20 min，冷卻至室溫后貯存?zhèn)溆谩?br> [0017] LB/IPTG/Xgal平板：將100 mL LB固體培養(yǎng)基用微波爐加熱溶解，冷卻至60°C左 右時，加入75 μ L IPTG/Xgal，小心混勻，避免產(chǎn)生氣泡，傾倒入六孔板。平板于4°C冰箱避 光貯存?zhèn)溆?。IPTG/Xgal按以下配方制備：稱取0.5 g IPTG和0.2g Xgal溶于5 mL DMF (N，N-二甲基甲酰胺）中，混勻后分裝為300 μ L小份，于-20°C避光貯存。
[0018] 上層瓊脂：稱取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，MgCl2 · 6H20 1 g，瓊脂糖 7 g，加超純水定容至1L，微波爐煮沸3次，使瓊脂糖充分溶解，冷卻至60°C左右，分裝成60 mL的小份，121°C高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后室溫存放備用。
[0019] LB-Tet (四環(huán)素）平板：微波爐加熱溶解100mL LB固體培養(yǎng)基，冷卻至60°C左右 時，加入100 μ L Tet貯液，混勻后傾倒六平板，待冷卻凝固后4°C避光貯存，一周內(nèi)使用完。 四環(huán)素（Tet)貯液按以下配方制備：稱取200 mg鹽酸四環(huán)素，溶于10 mL的無水乙醇中，分 裝為300 μ L小份，于-20°C避光貯存。
[0020] 包被液-0· 1 M NaHC03緩沖液（pH 8. 6):稱取NaHC03 0· 84g用80mL三蒸水溶解 后用似0!1調(diào)？!1至8.6，定容至10〇1^，1211：高壓蒸汽滅菌2〇1^11，冷卻后41：存放備用。
[0021] 封閉液-0· 1M NaHC03 (pH8. 6)、5 mg/mL BSA :稱取 NaHC03 0· 84 g、BSA 0· 5 g 用 80mL三蒸水溶解后用NaOH調(diào)pH至8. 6,定容至100mL，過濾除菌，分裝為5 mL小份，4°C貯 存?zhèn)溆谩?br> [0022] 洗脫液-0· 2 Μ 甘氨酸-HC1 緩沖液（pH 2. 2)、1 mg/mL BSA :量取 50mL (λ 2M 甘氨 酸溶液和44 mL 0. 2Μ HC1溶液，加入200 mg BSA，加水定容至200 mL，過濾除菌，4°C備用。
[0023] 中和液-1M Tris-HCl緩沖液（pH 9. 1):稱取12. 114 g Tris堿，適量超純水溶解， HC1調(diào)pH至9. 1，定容、過濾除菌，分裝備用。
[0024] TBS緩沖液-50 mM Tris-HCL(PH7. 5)、150mM NaCl :按以下步驟制備，第一步先稱 取6. 055 g Trisbase，用少量雙蒸水（30(T500ml)溶解，再用濃HC1將pH調(diào)至7. 5，最后加 雙蒸水至1000 ml，此步驟制備得Tris緩沖液（50 mM，PH7. 5);第二步稱取NaCl 8. 766g， 先以少量雙蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制備的Tris緩沖液（50 mM，pH7. 5)100ml，最后 加雙蒸水至l〇〇〇ml，充分搖勻，高壓滅菌即得。
[0025] 洗滌液（TBST) :0· 1% (v/v) Tween-20 TBS，TBS 即前述 TBS 緩沖液。
[0026] PEG/NaCl :稱取 PEG-8000 20 g，NaCl 14. 61 g，加超純水定容至 100 mL，121°C 高 壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0027] TMB儲存液：稱取10 mg TMB溶于1 mL DMS0,4°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0028] TMB底物緩沖液-磷酸-檸檬酸緩沖液（pH 5. 0):按以下步驟制備：首先制備0. 1 M/L檸檬酸液，即稱取檸檬酸（C6H807 *H20)19. 2g，加水至1000 mL，為甲液；然后制備0. 2 M/L磷酸氫二鈉液體，即稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04)71. 7 g，加水至1000 mL，為乙液；最后取 甲液24. 3 mL，乙液25. 7 mL，加水定容至100 mL，即為TMB底物緩沖液-磷酸-檸檬酸緩沖 液（pH 5.0)。
[0029] TMB底物顯色液：取100 μ L TMB貯存液于溶于上述10 mL TMB底物緩沖液-磷 酸-檸檬酸緩沖液（pH 5.0)中，再加入體積分數(shù)為30% H202 10 μ L，混勻即可，需要注意的 是ΤΜΒ底物顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0030] 終止液：為濃度為2 M/L的硫酸液。
[0031] 篩選步驟： (1)包被：將原核表達并純化的ro-Li蛋白的Igv區(qū)，經(jīng)過尿素濃度梯度復性后得到目 的蛋白ro-LlIgV(溶于0· 1M pH 8. 6的NaHC03溶液)。用目的蛋白包被96孔板，15 μ g/ 孔（150μ?，100μ g/mL)，密閉濕盒4°C孵育過夜； (2) 封閉：棄去包被液，用槍頭吸出剩余殘液并迅速加滿封閉液，密閉濕盒4°C孵育3 h ； (3) 洗滌：TBST洗滌6次，每次不少于2 min，注意無菌操作，動作要快以免微孔板干 燥； (4) 結(jié)合：快速加入預先用TBST稀釋至滴度為2X1011的文庫的噬菌體100 μ L/孔，室 溫溫和搖動lh ;在這個過程中，與靶蛋白具有親和力的噬菌體會結(jié)合在蛋白上； (5) 洗滌：TBST洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體； (6) 洗脫：每孔加入100 μ L洗脫液，室溫溫和搖動20min ; (7) 中和：用移液槍小心吸出洗脫的噬菌體，轉(zhuǎn)移至預先已加好15 μ L中和液的滅菌 離心管中，溫和吹打混勻； (8) 擴增：把第一輪篩選得到的噬菌體與大腸桿菌ER2738加入LB液體培養(yǎng)基（Tet+) 中共同培養(yǎng)，進行擴增和純化，得到次級肽庫； (9) 滴度測定：分別對各輪篩選得到的噬菌體以及擴增后的次級肽庫在LB/IPTG/Xgal 平板上進行噬菌體滴度測定，并進行回收率計算，噬菌體回收率=[洗脫噬菌體數(shù)/投入噬 菌體數(shù)]X 100% ; (10) 重復篩選：將擴增得到的噬菌體投入下一輪篩選，重復上述篩選過程。經(jīng)5輪親 和篩選，即可使得含目的多肽的噬菌體得到高度富集； (11) 測序：挑取第五輪篩選后的滴度測定平板上的噬菌斑進行擴增，取200 μ L新鮮 擴增的噬菌體貯存液送往金唯智測序公司進行全自動測序，測序引物為-96 gIII測序引物： 5' -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。
[0032] 多肽序列分析：根據(jù)DNA測序結(jié)果推導其所編碼的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨 基酸序列。
[0033] 篩選結(jié)果： (1)分別對各輪篩選得到的噬菌體洗脫液進行滴度測定，并計算投入噬菌體回收率，結(jié) 果見下表。

【權(quán)利要求】
1. 一種具有抗腫瘤活性靶向ro-Li igV親和肽S10,其特征在于，該親和肽S10能特異 性結(jié)合于 F*D-L1 IgV 區(qū)，其氛基酸序列為：Trp-Ser-His-Gly-Gly-His-Gln-His-Phe-Ile-A rg-Phe,即 W-S-H-G-G-H-Q-H-F-I-R-F，分子量為 1507. 7。
2. 權(quán)利要求1所述具有抗腫瘤活性靶向H)-L1 IgV親和肽S10在制備抗結(jié)腸癌藥物中 的應用。
3. 權(quán)利要求1所述具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll IgV親和肽S10的制備方法，其特征在 于，通過Fomc固相多肽合成法制備。
【文檔編號】A61P35/00GK104086627SQ201410233473
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】高艷鋒, 劉蓓媛, 祁元明, 李國棟, 周秀曼, 李雯雯, 周楊 申請人:鄭州大學