一種多糖-多巴胺復合生物膠及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多糖-多巴胺復合生物膠及應用，所述生物膠按如下方法制備：在惰性氣體氛圍中，將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺鈉溶于pH值5～6的MES緩沖液，制成EDC混合液，然后將該EDC混合液加入多糖溶液中，在20～30℃反應0.5～1小時，再加入多巴胺溶液，20～30℃繼續(xù)反應1～4小時，反應物以蒸餾水為透析液透析1～3天，取截留液冷凍干燥，獲得多糖-多巴胺復合生物膠；本發(fā)明修飾方法簡便有效，可增加軟骨組織的表面粘性，減少治療藥物或植入細胞的流失，促進軟骨損傷的修復。
【專利說明】-種多糖-多巴胺復合生物膠及應用 (一）
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物膠，特別涉及一種可直接粘附于受損軟骨表面，促進其他生 物活性物質(zhì)或細胞粘附的生物膠的制備以及其在軟骨表面的涂覆方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 軟骨由軟骨細胞產(chǎn)生的一種特殊的細胞外基質(zhì)構成，無血液供應，其組成成分主 要有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、II型膠原等。而軟骨細胞通常處于骨軟骨交界處，數(shù)量有限且 因細胞外基質(zhì)的限制，遷移能力很弱。由于軟骨的這些特征，導致其在損傷后較難治愈。近 年來發(fā)展出的"自體軟骨細胞移植"（ACI)技術，即提取患者體內(nèi)的健康軟骨細胞經(jīng)體外培 養(yǎng)大量擴增后植入病變區(qū)修復病變軟骨，其有療效率在70?85%。但在軟骨淺層損傷的治 療中，由于原生軟骨表面較差的細胞粘附能力，若直接將種子細胞注射入損傷處，會導致種 子細胞大量流失。隨著組織工程的發(fā)展，多種支架被研發(fā)，其可為種子細胞提供良好的生存 環(huán)境，促進組織修復。但在軟骨淺表層損傷中，支架也難以與周圍的組織良好的整合，從而 導致新生組織與原組織分離，嚴重影響修復效果。因此，對于淺表層軟骨損傷的修復，需要 研發(fā)一種新的材料，能良好連接軟骨組織與植入細胞或生物活性分子。
[0003] 在此，本發(fā)明提供了一種生物相容性良好的生物膠對軟骨表面進行改性，增加其 對于細胞或其他生物活性分子的粘附能力，從而有效提高修復效果。該生物膠使用軟骨細 胞外基質(zhì)中的主要組成成分硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸作為主要原料，通過接枝多巴胺增加其 組織粘性。硫酸軟骨素與透明質(zhì)酸均為天然多糖，均具有良好的生物相容性、生物可降解 性、吸收水分和養(yǎng)分的能力、促進軟骨細胞增殖等特性；而多巴胺分子中的兒茶酚基團與氨 基團易發(fā)生氧化而自聚，可在幾乎任何材料表面形成緊密附著的聚多巴胺涂層；同時，其也 是體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的一種，具有良好的生物相容性。因此，可以利用多巴胺的組織粘性制備適 用于軟骨組織的生物膠，修復淺表層軟骨損傷。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明目的是提供一種多糖-多巴胺復合生物膠及修復淺表層軟骨缺損中的應 用，具體是通過化學合成方法成功地在多糖分子上修飾多巴胺，制備出多糖-多巴胺復合 物這一新型生物膠，利用多巴胺氧化自聚合性質(zhì)，在軟骨表面形成一層多糖-多巴胺涂層， 改善軟骨表面細胞及生物活性分子粘附能力差的問題，同時保持軟骨表面原有的結構，可 有效提1?淺表層軟骨缺損的修復能力。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明的目的是一種多糖-多巴胺復合生物膠，所述生物膠按如下方法制備（制 備過程始終處于惰性氣體氛圍中）：（1)在惰性氣體氛圍中，將多糖溶于pH值5?6的 MES (嗎啉乙磺酸）緩沖液中制成多糖溶液；所述多糖為硫酸軟骨素鈉鹽或透明質(zhì)酸鈉；(2) 在惰性氣體氛圍中，將1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥 珀酰亞胺鈉（sulfo-NHS)溶于pH值5?6的MES緩沖液制成EDC混合液，然后將該EDC混 合液加入步驟（1)制備的多糖溶液中，在20?30°C反應0.5?1小時，再向反應液中加入 多巴胺溶液，20?30°C繼續(xù)反應1?4小時，反應物以蒸餾水為透析液，在透析袋中透析 1?3天，取截留液冷凍干燥，獲得多糖-多巴胺復合生物膠；所述多巴胺溶液是將多巴胺 溶于pH值5?6的MES緩沖液制成，所述多糖溶液的用量以多糖質(zhì)量計，所述多糖與EDC 和sulfo-NHS投料質(zhì)量比為1 :0.8?3 :0.8?3,所述多巴胺溶液用量以多巴胺質(zhì)量計，所 述多糖與多巴胺質(zhì)量之比為1 :0.8?3 ;所述MES緩沖液的用量對本發(fā)明沒有影響，通常優(yōu) 選所述EDC混合液體積是多糖溶液體積的1/40?1/100倍，所述多巴胺溶液體積是多糖溶 液體積的1/40?1/100倍。
[0007] 進一步，所述步驟⑴將多糖溶于pH值5?6的MES緩沖液中制成終濃度1? 10mg/mL (優(yōu)選2. 5?5mg/mL)的多糖溶液。
[0008] 進一步，所述步驟（2)所述透析袋的截留分子量為3000?3500或8000?14000。
[0009] 進一步，所述步驟（2)所述冷凍干燥條件為壓力0?20Pa，溫度-105?-1KTC， 時間48?72小時，優(yōu)選10Pa，溫度-105?-110°C，時間48?72小時。
[0010] 進一步，所述步驟（1)和步驟⑵所述惰性氣體均為氮氣或氦氣，優(yōu)選氮氣。
[0011] 進一步，步驟（2)所述多糖與EDC和sulfo-NHS投料質(zhì)量比為1 :1?2 :1?2(更 優(yōu)選1:1. 1:1. 2)，所述多巴胺溶液的用量以多巴胺質(zhì)量計，所述多糖與多巴胺質(zhì)量比為1 : 1 ?2(優(yōu)選 1:1. 1)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種所述多糖-多巴胺復合生物膠在制備表面改性軟骨中的應用， 所述的應用為：將多糖-多巴胺復合生物膠溶于pH值7. 2?7. 4的PBS緩沖液中，制成多 糖-多巴胺復合生物膠溶液，加入催化劑，混合成生物膠溶液，將生物膠溶液注射到軟骨表 面至完全覆蓋，并于20?30°C放置10?60min，用PBS緩沖液沖洗軟骨，即得到表面改性 的軟骨；所述的多糖-多巴胺生物膠溶液濃度為〇. 5?25mg/mL ;所述催化劑為高碘酸鈉溶 液或質(zhì)量濃度1?3%的過氧化氫水溶液，所述高碘酸鈉溶液是由5?8mg/mL高碘酸鈉水 溶液與0. 4mol/L的NaOH水溶液以體積比50:1?200:1 (優(yōu)選100:1)混合制成；所述催化 劑的體積與多糖-多巴胺復合生物膠溶液體積比為1 :100?200。
[0013] 進一步，將生物膠溶液注射到軟骨表面的注射量為50?100 μ L/cm2。
[0014] 本發(fā)明所述MES緩沖液是指：MES溶于蒸餾水，濃度為0. 1M，用1M鹽酸或1M氫氧 化鈉調(diào)節(jié)pH至5?6。
[0015] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：采用天然軟骨中存在的多糖作 為生物膠的主要成分之一，通過修飾多巴胺這一生物活性分子達到增加組織粘性的效果， 較含氰基丙烯酸鹽的粘合劑、白蛋白-戊二醛粘合劑、纖維蛋白膠粘合劑有更好的生物相 容性與生物安全性。該修飾方法簡便有效，可增加軟骨組織的表面粘性，減少治療藥物或植 入細胞的流失，促進軟骨損傷的修復。
[0016] 所述含氰基丙烯酸鹽的粘合劑參見文獻1-3 :
[0017] 文獻 1. Leahey, A. B. , Gottsch, J. D. & Stark, ff. J. Clinical experience with N-butyl cyanoacrylate(Nexacryl)tissue adhesive. OphthalmologylOO, 173 - 180(1993).
[0018] 文獻 2. Singer, A. J. et al. Prospective, randomized, controlled trial of tissue adhesive(2-〇ctylcyanoacrylate)versus standard wound closure techniques for laceration repair. Stony brook octylcyanoacrylate study group. Acad.Emerg. Med. 5, 94 - 99 (1998).
[0019] 文獻 3. Woodward，S. C. et al. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesive in the rat. Ann. Surg. 162, 113 - 122 (1965).
[0020] 所述白蛋白-戊二醛粘合劑參見文獻4-5 :
[0021] 文獻 4. Herget，G. W. et al. Experimental use of an albumin-glutaraldehyde tissue adhesive for sealing pulmonary parenchyma and bronchial anastomoses. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 19, 4 - 9 (2001).
[0022] 文獻 5. Menon, N. G.，Downing, S.，Goldberg, N. H. &Silverman, R. P. Seroma prevention using an albumin-glutaraldehyde-based tissue adhesive in the rat mastectomy model. Ann. Plast. Surg. 50, 639 - 643 (2003).
[0023] 所述纖維蛋白膠粘合劑參見文獻6-8 :
[0024] 文獻 6. Kjaergard, Η· Κ·，Weis-Fogh, U. S.，Sorensen, Η·，Thiis, J. &Rygg, I. Autologous fibrin glue - preparation and clinical use in thoracic surgery. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 6, 52 - 54 (1992) discussion54.
[0025] 文獻 7. Owen, R. J. et al. Percutaneous ablation of an internal iliac aneurysm using tissue adhesive. Cardiovasc. Intervent. Radiol. 23, 389 - 391(2000).
[0026] 文獻8. Dunn, C. J. &Goa, K. L. Fibrin sealant:A review of its use in surgery and endoscopy. Drugs58, 863 - 886(1999). (四）
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例1硫酸軟骨素-多巴胺的1H核磁共振（? NMR)表征圖，曲線a為硫 酸軟骨素-多巴胺表征圖譜，曲線b為硫酸軟骨素圖譜。
[0028] 圖2為實施例1軟骨片掃描電鏡照片，A為表面未涂覆生物膠的軟骨片，B為涂覆 生物膠后的軟骨片。
[0029] 圖3為實施例1軟骨細胞在軟骨表面的貼壁生長的熒光照片，A為未涂覆生物膠 軟骨片，B為涂覆生物膠的軟骨片。
[0030] 圖4為實施例1軟骨細胞在軟骨表面增殖的定量檢測結果。 (五）
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 實施例1 :硫酸軟骨素-多巴胺復合生物膠及應用
[0033] (1)制備硫酸軟骨素-多巴胺復合生物膠：在氮氣環(huán)境中，將200mg硫酸軟骨素鈉 鹽（即硫酸軟骨素，購自sigma)加入40mLMES緩沖液（0· 1Μ，ρΗ5·5)中，攪拌至完全溶解， 制成多糖溶液。在氮氣環(huán)境中，將218mgEDC，247mg sulfo-NHS溶于lmLMES緩沖液（0. 1Μ， PH5. 5)，完全溶解后，制成EDC混合液；然后在氮氣環(huán)境中，將EDC混合液加入多糖溶液中， 25°C下攪拌反應30min。將216. 2mg多巴胺溶于lmLMES緩沖液（0. 1Μ，ρΗ5. 5)，加入上述反 應液中，25°C、氮氣條件下反應120min。將反應后的產(chǎn)物取出，置于透析袋（MWC03500)中， 于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（48小時，lOPa，-108°C )，得到硫酸軟骨素-多 巴胺生物膠203mg，并于4°C避光保存。
[0034] 硫酸軟骨素-多巴胺生物膠的表征：將0. 05g硫酸軟骨素-多巴胺生物膠溶于5mL D20,完全溶解后，轉入石英核磁管中，于25°C進行1H NMR表征，以硫酸軟骨素作為對照，見圖 1所示，6. 5?7. Oppm處新增的峰證明多巴胺被連接到硫酸軟骨素表面。
[0035] (2)配制催化劑：將83. 3mg高碘酸鈉溶于10mL蒸餾水中，取lmL，與0· OlmLO. 4M 氫氧化鈉水溶液混合。20?25 °C避光保存。
[0036] (3)軟骨表面涂覆硫酸軟骨素-多巴胺生物膠：將lmg硫酸軟骨素-多巴胺生物 膠溶于2mLPBS緩沖液（pH值為7.2,0. 15M)中，加入O.OlmL催化劑，混合均勻后，獲得生物 膠注射液，用100 μ L移液槍取25 μ L生物膠注射液，加至0. 25cm2軟骨片表面至完全覆蓋， 室溫下保持30min，再用2mLPBS(pH值為7. 2,0. 15M)沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到表 面改性的軟骨片。同樣條件下以未涂覆生物膠的軟骨片為對照。
[0037] 使用掃描電子顯微鏡（SEM)觀察表面改性前后軟骨表面結構，觀察生物膠對軟骨 表面形貌的影響。將涂覆或未涂覆生物膠的軟骨切片（5mmX5mmX0· 2mm，長X寬X厚度） 于15?35°C，真空干燥（10?20Pa)48?72小時，然后用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。 結果見圖2所示，從圖中可見兩者的表面形貌無顯著區(qū)別，說明該生物膠不會影響軟骨原 有的形貌結構。
[0038] 表面細胞粘附能力檢測：將5mL軟骨細胞懸液與10 μ L Dil染料（2. 5mg/mL)混 勻，置于37°C培養(yǎng)箱中孵育半小時，然后800rpm離心5min去除染液，用5mL PBS洗2次，用 F12/DMEM (1:1)培養(yǎng)基（含10 %胎牛血清與1 %青霉素-鏈霉素）重懸，調(diào)節(jié)濃度至10000 個/mL。將細胞接種至涂覆及未涂覆生物膠的軟骨切片（7mmX7mmX 1mm)表面，培養(yǎng)6小 時，去掉培養(yǎng)液，每個切片用lmLPBS洗3次，每次2min，用熒光顯微鏡（OLYMPUS)于546nm 波長處觀察細胞在兩種表面的粘附情況。結果見圖3所示，可見在涂覆生物膠后的軟骨表 面細胞數(shù)顯著增加，說明該生物膠可有效改善淺表層軟骨損傷治療中細胞流失的問題。
[0039] 表面軟骨細胞增殖能力檢測：將軟骨細胞懸液用F12/DMEM(1:1)培養(yǎng)基（含1% 青霉素/鏈霉素）調(diào)節(jié)濃度至10000個/mL。將0. 5mL細胞懸液接種至涂覆及未涂覆生物膠 的軟骨切片（7mmX7mmXlmm)表面，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1天、4天、7天時， 每片加入0. 05mL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，后吸取培養(yǎng)液，用酶標儀測量溶液在450nm 處的吸光值。結果見圖4所示，可見涂覆生物膠不會影響軟骨細胞的活性，在培養(yǎng)第四天與 第七天時，涂覆生物膠的軟骨表面細胞活性顯著高于未涂覆的軟骨表面，說明該生物膠具 有良好的生物相容性。通過表面形貌觀察及細胞粘附、增殖實驗可觀測到該生物膠涂層可 有效提高細胞粘附率且不影響軟骨原有結構與生物相容性。
[0040] 軟骨片的制備：新鮮的豬關節(jié)軟骨，除去周圍組織，用手術刀切成約lcmXlcm大 小塊狀，然后使用冰凍切片機沿橫切面切成1mm薄片，最后用手術刀修整四周邊緣，得到不 同尺寸的軟骨切片。
[0041] F12/DMEM培養(yǎng)基終濃度組成為：F12培養(yǎng)基（購自Gibco)與DMEM高糖培養(yǎng)基（購 自Gibco)按體積比1 :1混合，添加10%胎牛血清與1%青霉素-鏈霉素。
[0042] 實施例2 :硫酸軟骨素-多巴胺生物膠
[0043] (1)制備硫酸軟骨素-多巴胺生物膠：200mg硫酸軟骨素加入40mLMES緩沖液 (0. 1Μ，ρΗ5.9)中，在氮氣環(huán)境中攪拌至完全溶解，制成多糖溶液。將218mgEDC，247mg sulfo-NHS溶于lmL MES緩沖液（0. 1M，pH5. 9)，完全溶解后，獲得EDC混合液，加入多糖溶液 中，室溫、氮氣條件下反應30min。將216. 2mg多巴胺溶于lmLMES緩沖液，加入上述反應溶 液中，室溫（25°C)、氮氣條件下反應60min。將反應后的產(chǎn)物取出，置于透析袋（MWC03500) 中，于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（48小時，10Pa，-108°C )，得到硫酸軟骨 素-多巴胺生物膠凍192mg，并于4°C避光保存。
[0044] (2)配制催化劑：將質(zhì)量濃度30%過氧化氫用蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度3%。
[0045] (3)軟骨表面涂覆硫酸軟骨素-多巴胺生物膠：將2mg硫酸軟骨素-多巴胺溶于 2mL PBS緩沖液（pH值為7. 2, 0. 15M)中，加入0. 02mL催化劑，混合均勻后，獲得生物膠注射 液，用100 μ L移液槍取100 μ L生物膠注射液，加至lcm2軟骨片（制備同實施例1)表面至 完全覆蓋，室溫（25°C )下保持30min，再用5mL PBS沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到涂 覆生物膠的軟骨片。后通過表面形貌觀察及細胞粘附實驗（方法同實施例1)可觀測到該 生物膠涂層可有效提高細胞粘附率且不影響軟骨原有結構。
[0046] 實施例3 :透明質(zhì)酸鈉-多巴胺生物膠
[0047] (1)制備透明質(zhì)酸鈉-多巴胺生物膠：400mg透明質(zhì)酸鈉加入80mLMES緩沖液 (0. 1Μ，ρΗ5.9)中，在氮氣環(huán)境中攪拌至完全溶解，制成多糖溶液。將437mgEDC，495mg sulfo-NHS溶于2mL MES緩沖液（0. 1M，pH5. 9)，完全溶解后，獲得EDC混合液，加入多糖溶 液中，室溫（25°C )、氮氣條件下反應30min。將432mg多巴胺溶于2mL MES緩沖液（0. 1M， pH5. 9)，加入上述反應溶液中，室溫（25°C )、氮氣條件下反應60min。將反應后的產(chǎn)物取出， 置于透析袋（MWC08000?14000)中，于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（72小時， 10Pa，-108°C )，得到透明質(zhì)酸鈉-多巴胺生物膠411mg，并于4°C避光保存。
[0048] (2)配制催化劑：將83. 3mg高碘酸鈉溶于10mL蒸餾水中，取lmL，與0· OlmLO. 4M 氫氧化鈉溶液混合。20?25 °C避光保存。
[0049] (3)軟骨表面涂覆透明質(zhì)酸鈉-多巴胺生物膠：將25mg透明質(zhì)酸鈉-多巴胺溶于 lmL PBS緩沖液（pH值為7. 2,0. 15M)中，加入5 μ L催化劑，混合均勻后，獲得生物膠注射 液，用100 μ L移液槍取25 μ L生物膠注射液，加至0. 25cm2軟骨片（同實施例1)表面至完 全覆蓋，室溫（25°C )下保持20min，再用2mL PBS沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到涂覆 生物膠的軟骨片（即表面改性軟骨）。通過表面形貌觀察及細胞粘附實驗（同實施例1)可 觀測到該生物膠涂層可有效提高細胞粘附率且不影響軟骨原有結構。
[0050] 實施例4 :
[0051] (1)制備透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：200mg透明質(zhì)酸鈉加入80mLMES緩沖液（(λ 1M， PH5.9)中，在氮氣環(huán)境中攪拌至完全溶解，獲得多糖溶液。將218mgEDC，247mgsulf〇-NHS 溶于2mL MES緩沖液，完全溶解后，獲得EDC混合液，加入多糖溶液中，室溫（25°C )、氮氣 條件下反應30min。將216. 2mg多巴胺溶于2mL MES緩沖液，加入上述反應溶液中，室溫 (25°C )、氮氣條件下反應60min。將反應后的產(chǎn)物取出，置于透析袋（MWC08000?14000) 中，于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（48小時，10Pa，-108°C )，得到透明質(zhì)酸-多 巴胺生物膠209mg，并于4°C避光保存。
[0052] (2)配制催化劑：將83. 3mg高碘酸鈉溶于10mL蒸餾水中，取lmL，與0· OlmLO. 4M 氫氧化鈉溶液混合。20?25 °C避光保存。
[0053] (3)軟骨表面涂覆透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：將lOmg透明質(zhì)酸-多巴胺溶于 lmL PBS緩沖液中，加入5 μ L催化劑，混合均勻后，獲得生物膠注射液，用100 μ L移液槍取 25 μ L生物膠注射液，加至0. 25cm2軟骨片表面至完全覆蓋，室溫（25°C )下保持20min，再 用2mL PBS沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物膠的軟骨片。通過表面形貌觀察及 細胞粘附實驗（同實施例1)可觀測到該生物膠涂層可有效提高細胞粘附率且不影響軟骨 原有結構。
[0054] 實施例5 :
[0055] (1)制備透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：200mg透明質(zhì)酸鈉加入80mLMES緩沖液（(λ 1M， pH5. 5)中，在氮氣環(huán)境中攪拌至完全溶解，制成多糖溶液。將218mgEDC，247mgsulf〇-NHS 溶于2mL MES緩沖液（0. 1M，pH5. 5)，完全溶解后，獲得EDC混合液，加入多糖溶液中，室溫 (25°C )、氮氣條件下反應30min。將216. 2mg多巴胺溶于2mL MES緩沖液（(λ 1M，ρΗ5· 5)， 加入上述反應溶液中，室溫（25°C )、氮氣條件下反應120min。將反應后的產(chǎn)物取出，置 于透析袋（MWC08000?14000)中，于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（48小時， 10Pa，-108°C )，得到透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠214mg，并于4°C避光保存。
[0056] (2)配制催化劑：將質(zhì)量濃度30%過氧化氫用蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度3%。
[0057] (3)軟骨表面涂覆透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：將20mg透明質(zhì)酸-多巴胺溶于lmL PBS緩沖液（pH值為7. 2,0. 15M)中，加入10μ L催化劑，混合均勻后，獲得生物膠注射液，用 100 μ L移液槍取50 μ L生物膠注射液，加至lcm2軟骨片（同實施例1)表面至完全覆蓋，室 溫（25°C )下保持60min，再用5mL PBS沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物膠的軟 骨片。通過表面形貌觀察及細胞粘附實驗（同實施例1)可觀測到該生物膠涂層可有效提 高細胞粘附率且不影響軟骨原有結構。
[0058] 實施例6 :
[0059] (1)制備透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：240mg透明質(zhì)酸鈉加入80mLMES緩沖液 (0· 1M，ρΗ5· 5)中，在氮氣環(huán)境中攪拌至完全溶解，制成多糖溶液。將460mg EDC，521. 19mg sulfo-NHS溶于2mL MES緩沖液（0. 1M，pH5. 5)，完全溶解后，獲得EDC混合液，加入多糖溶 液中，室溫（25°C )、氮氣條件下反應30min。將720mg多巴胺溶于2mL MES緩沖液（0. 1M， pH5. 5)，加入上述反應溶液中，室溫（25°C)、氮氣條件下反應120min。將反應后的產(chǎn)物取 出，置于透析袋（MWC08000?14000)中，于蒸餾水中透析3天；最后將產(chǎn)物冷凍干燥（48小 時，10Pa，-108°C )，得到透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠292mg，并于4°C避光保存。
[0060] (2)配制催化劑：將83. 3mg高碘酸鈉溶于10mL蒸餾水中，取lmL，與0· OlmLO. 4M 氫氧化鈉溶液混合。20?25 °C避光保存。
[0061] (3)軟骨表面涂覆透明質(zhì)酸-多巴胺生物膠：將20mg透明質(zhì)酸-多巴胺溶于lmL PBS緩沖液（pH值為7. 2,0. 15M)中，加入10μ L催化劑，混合均勻后，獲得生物膠注射液，用 100 μ L移液槍取100 μ L生物膠注射液，加至lcm2軟骨片（同實施例1)表面至完全覆蓋， 室溫（25°C )下保持60min，再用5mL PBS沖洗軟骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物膠的 軟骨片。通過表面形貌觀察及細胞粘附實驗（同實施例1)可觀測到該生物膠涂層可有效 提高細胞粘附率且不影響軟骨原有結構。
【權利要求】
1. 一種多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于所述生物膠按如下方法制備：（1)在惰性 氣體氛圍中，將多糖溶于pH值5?6的MES緩沖液中制成多糖溶液；所述多糖為硫酸軟骨 素鈉鹽或透明質(zhì)酸鈉；(2)在惰性氣體氛圍中，將1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺鈉溶于pH值5?6的MES緩沖液，制成EDC混合液，然后將該 EDC混合液加入步驟（1)制備的多糖溶液中，在20?30°C反應0.5?1小時，再加入多巴胺 溶液，20?30°C繼續(xù)反應1?4小時，反應物以蒸餾水為透析液透析1?3天，取截留液冷 凍干燥，獲得多糖-多巴胺復合生物膠；所述多巴胺溶液是將多巴胺溶于pH值5?6的MES 緩沖液制成，所述多糖溶液的用量以多糖質(zhì)量計，所述多糖與1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺鈉投料質(zhì)量比為1 :0. 8?3 :0. 8?3,所述多巴胺 溶液用量以多巴胺質(zhì)量計，所述多糖與多巴胺質(zhì)量比為1 :〇. 8?3。
2. 如權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于所述步驟（1)將多糖溶于 pH值5?6的MES緩沖液中制成終濃度1?10mg/mL的多糖溶液。
3. 如權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于所述步驟（2)所述透析在 截留分子量為3000?3500或8000?14000的透析袋中進行。
4. 如權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于所述步驟（2)所述冷凍干 燥條件為壓力〇?20Pa，溫度-105?-110°C，時間48?72小時。
5. 如權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于所述步驟（1)和步驟（2) 所述惰性氣體均為氮氣或氦氣。
6. 如權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠，其特征在于步驟（2)所述多糖與 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺鈉投料質(zhì)量比為1 : 1?2 :1?2,所述多巴胺溶液的用量以多巴胺質(zhì)量計，所述多糖與多巴胺質(zhì)量比為1 :1? 2〇
7. -種權利要求1所述多糖-多巴胺復合生物膠在制備表面改性軟骨中的應用，其特 征在于所述的應用為：將多糖-多巴胺復合生物膠溶于pH值7. 2?7. 4的PBS緩沖液中， 制成多糖-多巴胺復合生物膠溶液，加入催化劑，混合成生物膠溶液，將生物膠溶液注射到 軟骨表面至完全覆蓋，并于20?30°C放置10?60min，用PBS緩沖液沖洗軟骨，即得到表 面改性的軟骨；所述的多糖-多巴胺生物膠溶液濃度為0. 5?25mg/mL ;所述催化劑為高碘 酸鈉溶液或質(zhì)量濃度1?3%的過氧化氫水溶液，所述高碘酸鈉溶液是由5?8mg/mL高碘 酸鈉水溶液與〇. 4mol/L的NaOH水溶液以體積比50:1?200:1混合制成；所述催化劑的體 積用量與多糖-多巴胺復合生物膠溶液體積比為1 :100?200。
8. 如權利要求7所述應用，其特征在于生物膠溶液注射到軟骨表面的注射量為50? 100 μ L/cm2。
【文檔編號】A61L24/08GK104056300SQ201410242433
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權日:2014年5月30日
【發(fā)明者】歐陽宏偉, 汪燕艷, 牟秦, 孫亨 申請人:浙江大學