一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。本發(fā)明針對(duì)裸DGKα質(zhì)粒易被體內(nèi)的核酸酶、酸和堿等破壞的缺點(diǎn)，利用殼聚糖制備了DGKα基因-殼聚糖納米粒，能有效保護(hù)DGKα質(zhì)粒，增強(qiáng)DGKα質(zhì)粒在體內(nèi)的活性，促進(jìn)DGKα基因在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用。DGKα具有誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的作用，能誘導(dǎo)免疫耐受。本發(fā)明制備的DGKα基因-殼聚糖納米粒能抑制卵蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠的氣道炎癥，降低血清卵蛋白特異性IgE水平，有望應(yīng)用于哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療。
【專利說明】一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法
[0001]本發(fā)明為發(fā)明《一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應(yīng)用》的分案申請(qǐng)。(原申請(qǐng)文件的申請(qǐng)日:2013年2月19日，原申請(qǐng)文件的申請(qǐng)?zhí)?201310053559.6，原申請(qǐng)文件的名稱:一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應(yīng)用)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，特別涉及一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003]哮喘是一種慢性氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病，CD4+T細(xì)胞的過度活化在哮喘的發(fā)病中具有重要作用。CD4+T細(xì)胞活化后向Th2細(xì)胞分化增多，Th2細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致了 Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子IL (白細(xì)胞介素)-4、IL-5和IL-13等分泌增多，最終導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在氣道聚集，引起氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥。研究表明，正常人反復(fù)接觸過敏原后，過敏原的刺激不會(huì)導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞過度活化而始動(dòng)發(fā)病過程。而哮喘患者，氣道抗原呈遞細(xì)胞攝取和提呈過敏原給T細(xì)胞后，促使T細(xì)胞過度活化和增殖，始動(dòng)哮喘的發(fā)生。因此免疫耐受機(jī)制的缺陷和障礙是哮喘的主要發(fā)病機(jī)制。誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗原特異性免疫耐受目前已成為防治哮喘的新途徑。
[0004]近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，DGK (甘油二酯激酶)在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的免疫功能中起重要作用。甘油二酯和磷脂酸是重要第二信使，可直接或者分解為各種信號(hào)后參與多種免疫細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。DGK能使甘油二酯磷酸化生成磷脂酸，調(diào)節(jié)甘油二酯和磷酸脂的平衡，在調(diào)節(jié)免疫功能中起重要作用。DGK α (甘油二酯激酶α )是DGK的一個(gè)亞型，為I型DGK，T細(xì)胞聞度表達(dá)DGK α。
[0005]T細(xì)胞無能是外周免疫耐受主要機(jī)制之一。T細(xì)胞無能是指T細(xì)胞的功能性無反應(yīng)或者失活。無能T細(xì)胞不能分泌IL-2，不能增殖。Zha等[Zha Y，Marks R，Ho Aff,et al.T cell anergy is reversed by active Ras and is regulated by diacylglycerolkinase-a.Nat Immunol.2006 ；7 (11): 1166-1173.]研究組發(fā)現(xiàn)無能 T 細(xì)胞過度表達(dá) DGK α，表達(dá)量為正常靜息 T 細(xì)胞 5 ~10 倍。Sanjuan 等[Sanjuan MA, Jones DR, Izquierdo M，etal.Role of diacylglycerol kinase alpha in the attenuation of receptor signaling.J Cell Biol.2001:153，207-220.Sanjuan MA, Pradet-Balade B，Jones DR, et al.T cellactivation in vivo targets diacylglycerol kinase to the membrane:a novel mechanismfor Ras attenuation.J Immunol，2003，170:2877-2883.]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 DGKa 基因的 T細(xì)胞過度表達(dá)DGKa，抑制甘油二酯依賴的T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)，從而減弱Ras激活信號(hào)和抑制ERK磷酸化，抑制了 IL-2啟動(dòng)子的活性，減弱T細(xì)胞活化信號(hào)CD69表達(dá)，導(dǎo)致T 細(xì)胞無能。Olenchock 等[Olenchock BA，Guo R，Carpenter JH, et al.Disruption ofdiacylglycerol metabolism impairs the induction of T cell anergy.Nat Immunol.2006 ；7(11):1174-1181.]研究發(fā)現(xiàn)DGKa缺陷的T細(xì)胞在誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的條件下仍能增殖并分泌IL-2，RAS活性、ERK磷酸化等細(xì)胞增殖信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)。因此，DGKa能將甘油二酯磷酸化為磷脂酸，抑制甘油二酯介導(dǎo)的TCR信號(hào)活化，抑制T細(xì)胞過度活化，誘導(dǎo)T細(xì)胞無能，在T細(xì)胞免疫耐受中起重要作用。DNA疫苗是治療哮喘的常用方法，DGK α基因的DNA疫苗是否可通過誘導(dǎo)免疫耐受治療哮喘尚不清楚。
[0006]殼聚糖是一種從甲殼類動(dòng)物提取制備的生物可降解性多糖，是自然界唯一的帶正電荷的堿性氨基陽離子多糖，無毒，無致突性，毒副作用小。殼聚糖溶于弱酸水溶液后具有高粘性且?guī)д姡膳c帶負(fù)電荷的DNA相互作用形成殼聚糖-DNA納米粒，DNA被封入殼聚糖內(nèi)，不被體內(nèi)的酸、堿和核酸酶所破壞，提高DNA生物利用性[Mao HQ, Roy K, Troung-Le VL,et al.Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers:synthesis，characterization andtransfection efficiency.J Control Release.2001 ；70 (3):399-421.]。同時(shí)，殼聚糖-DNA納米粒表面帶正電，而機(jī)體細(xì)胞表面帶負(fù)電，殼聚糖納米?？烧掣皆诩?xì)胞表面，從而促使DNA在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療[Lavertu M，M6thotS, Tran-Khanh N, et al.High efficiency gene transfer using chitosan/DNA nanoparticleswith specific combinations of molecular weight and degree of deacetylation.Biomaterials.2006；27(27):4815-4824.]。而且，殼聚糖具有緩釋作用，在體內(nèi)可以緩慢釋放所包封的DNA或者藥物，殼聚糖本身可以完全降解并代謝，其分解產(chǎn)物和降解產(chǎn)物均對(duì)人體健康無害。因此，殼聚糖是一種優(yōu)良的基因載體，可增強(qiáng)DNA疫苗等基因藥物的治療作用。目前尚未見有關(guān)DGKa基因-殼聚糖納米粒的制劑的相關(guān)報(bào)道，以及殼聚糖包裹DGKa基因應(yīng)用于哮喘治療的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應(yīng)用以及甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0009]一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應(yīng)用，所述甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒作為唯一有效成分在制備治療過敏性哮喘藥物中的應(yīng)用。
[0010]甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備減輕哮喘氣道炎癥藥物中的應(yīng)用。
[0011]甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備降低哮喘血清中過敏原特異性IgE和支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-5藥物中的應(yīng)用。
[0012]一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，包括:
[0013]步驟1、制備甘油二酯激酶a質(zhì)粒:全基因合成小鼠白細(xì)胞介素-2信號(hào)肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體而制備得甘油二酯激酶α質(zhì)粒;
[0014]步驟2、將殼聚糖溶解于I %醋酸水溶液，配制成濃度為0.5~2.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH將其pH值調(diào)節(jié)在5.5~5.7之間，無菌膜過濾，其中所述殼聚糖的分子量在2~60萬道爾頓之間，其 脫乙酰度在90%~95%之間，所述無菌膜的孔徑為0.22μπι;
[0015]步驟3、將所述甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶解在濃度為10~25mM的經(jīng)孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度在100~360 μ g/ml之間的甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶液。其中，步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數(shù)與所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩爾數(shù)之比> 5 ；
[0016]步驟4、所述的甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶液和所述殼聚糖醋酸溶液在溫度在55°C~57°C之間的水浴中加熱10~15min ；
[0017]步驟5、在漩渦震蕩的條件下，按體積比1:1的比例，將經(jīng)水浴加熱后的所述甘油二酯激酶α溶液緩慢勻速加入到經(jīng)水浴加熱后的所述殼聚糖醋酸溶液中，旋渦振蕩30~60s，室溫靜置，既得甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液。
[0018]優(yōu)選的是，所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法中，所述步驟5中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液的保存溫度為4°C。
[0019]優(yōu)選的是，所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法中，本方法制備得的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的粒徑在150nm~500nm之間，其中粒徑在150nm~300nm之間的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒占60%以上。
[0020]過敏性哮喘是臨床常見病和多發(fā)病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，它是一種慢性氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病，CD4+T細(xì)胞的過度活化在哮喘的發(fā)病中具有重要作用。CD4+T細(xì)胞活化后向Th2細(xì)胞分化增多，Th2細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致了 Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子IL(白細(xì)胞介素)_4、IL-5和IL-13等分泌增多，最終導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在氣道聚集，引 起氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥。研究表明，正常人反復(fù)接觸過敏原后，過敏原的刺激不會(huì)導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞過度活化而始動(dòng)發(fā)病過程。而哮喘患者，氣道抗原呈遞細(xì)胞攝取和提呈過敏原給T細(xì)胞后，促使T細(xì)胞過度活化和增殖，始動(dòng)哮喘的發(fā)生。因此，免疫耐受機(jī)制的缺陷和障礙是哮喘的主要發(fā)病機(jī)制。
[0021]誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗原的免疫耐受是目前防治哮喘的新途徑。DGKa (甘油二酯激酶a )具有誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的作用，能誘導(dǎo)免疫耐受。若將DGKa質(zhì)粒疫苗注入體內(nèi)，體內(nèi)的免疫細(xì)胞攝取DGK α質(zhì)粒并長(zhǎng)期表達(dá)DGK α蛋白，可能通過誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)變應(yīng)原的免疫耐受，從而達(dá)到治療哮喘的作用。但裸DGKa質(zhì)粒進(jìn)入體內(nèi)后易被組織內(nèi)的核酸酶、酸和堿等降解，且機(jī)體對(duì)吸收差，導(dǎo)致其免疫活性顯著降低。構(gòu)建能有效保護(hù)DNA疫苗并能被組織更好吸收的DNA疫苗運(yùn)載體系是非常重要的。
[0022]本發(fā)明建立一種過敏性哮喘小鼠的模型，此模型驗(yàn)證了 DGKa基因-殼聚糖納米粒可降低哮喘小鼠的氣道炎癥，為DGKa基因-殼聚糖納米?？蓱?yīng)用于哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)1?型。
[0023]本發(fā)明還提供了一種DGK α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。該制備方法中采用了殼聚糖作為載體，包裹DGK α，保護(hù)了 DGKa在生物體內(nèi)不被酸、堿和核酸酶所破壞，制備出高活性和高穩(wěn)定性的DGK α基因-殼聚糖納米粒，提高了 DGK α的生物利用性，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。其中，目前，采用復(fù)凝聚法，根據(jù)殼聚糖的陽離子特性與DNA的陰離子特性，將兩者直接結(jié)合形成納米粒子。但是多以低濃度殼聚糖(0.05-0.5mg/ml)與低濃度DNA溶液(40-100 μ g/ml)相互作用。本發(fā)明將殼聚糖和DNA溶液濃度均顯著提高，t匕較而言，本發(fā)明顯著提高DGK α基因-殼聚糖納米粒的得率，且尺寸仍在納米級(jí)范圍?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0024]圖1為DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑檢測(cè)結(jié)果。
[0025]圖2為DGK α基因-殼聚糖納米粒的Zeta電位檢測(cè)結(jié)果。
[0026]圖3為DGK α基因-殼聚糖納米粒的透射電鏡圖。
[0027]圖4為DGK α基因-殼聚糖納米粒的DNase I的酶解反應(yīng)結(jié)果。
[0028]圖5為過敏性哮喘小鼠的構(gòu)建流程圖和治療干預(yù)流程圖。
[0029]圖6為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。
[0030]圖7為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
[0031]圖8為治療過敏性哮喘 小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液IL-4水平。
[0032]圖9為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液IL-5水平。
[0033]圖10為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組血清卵蛋白特異性IgE水平。
[0034]圖11為治療過敏性哮喘小鼠的動(dòng)物模型中正常組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0035]圖12為治療過敏性哮喘小鼠模型中哮喘組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅 X 400)
[0036]圖13為治療過敏性哮喘小鼠模型中DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0037]圖14為治療過敏性哮喘小鼠模型中DGKa基因干預(yù)組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0038]圖15為治療過敏性哮喘小鼠模型中空白PEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0039]圖16為治療過敏性哮喘小鼠模型中殼聚糖納米粒對(duì)照組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0041]實(shí)施例
[0042]UDGKa (甘油二酯激酶a )基因-殼聚糖納米粒的制備:
[0043]步驟1、全基因合成小鼠IL-2信號(hào)肽序列和小鼠DGK α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體，即獲得DGK α質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序證實(shí)小鼠IL-2信號(hào)肽和小鼠DGK α基因序列均與 GenBank 的 IL-2 (NM_008366.3)和 DGKa 基因(NM_016811.2)完全相符；
[0044]步驟2、將殼聚糖溶解于醋酸濃度為I %的溶液中，制備得濃度為1.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，將其PH值用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到5.5，再用孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾殺菌，其中殼聚糖的分子量為10萬道爾頓，脫乙酰度為95% ；
[0045]步驟3、將所述DGK α質(zhì)粒溶解在IOmM的0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度為360 μ g/ml的DGK α溶液，其中步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數(shù)與所述DGK α溶液中的磷酸酯基摩爾數(shù)之比為8.3 ；
[0046]步驟4、將DGK α溶液和殼聚糖醋酸溶液在溫度為55°C的水浴中加熱15min ；[0047]步驟5、將Iml的360 μ g/ml DGK α溶液繼續(xù)保持在55 V的水浴中，將Iml的1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液取出置于旋渦振蕩器上，邊振蕩邊用吸頭向殼聚糖醋酸溶液中緩慢勻速加入DGKa質(zhì)粒溶液，兩者比例為1: l，DGKa質(zhì)粒溶液全部加入后繼續(xù)振蕩60s。室溫靜置lOmin，既獲得2ml淡藍(lán)色乳光的DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液，將DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液在4°C的條件下保存。
[0048]2、DGK α基因-殼聚糖納米粒的檢測(cè)結(jié)果及討論:
[0049]2.1、納米粒度儀檢測(cè)DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑和Zeta電位，透射電鏡觀察DGK α基因-殼聚糖納米粒的形態(tài)。
[0050]如圖1所示，經(jīng)納米粒度儀檢測(cè)，DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑為283.4nm,多分散度為0.227 ;圖2所示，DGKa基因-殼聚糖納米粒的Zeta電位為+22.1mV;圖3所示透射電鏡圖可見DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑大小較均一、分布均勻，無明顯凝聚現(xiàn)象，而且包裹DGKa的殼聚糖納米粒的中心染色更深，表明DGKa質(zhì)粒被包裹在殼聚糖內(nèi)部，而未包裹DGK α的殼聚糖納米粒粒徑顯著更小，顏色均勻，無深染區(qū)。
[0051]2.2、DNase I型保護(hù)實(shí)驗(yàn):向含I μ g裸DGK α質(zhì)粒的溶液和含I μ gDGK α質(zhì)粒的DGKa基因-殼聚糖納米粒的溶液加入I型DNaselU，37°C反應(yīng)15min，冰浴放置30min，中止消化反應(yīng)，用含溴化乙錠的I %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，凝膠成像分析儀成像。
[0052]如圖4所示，DGKa質(zhì)粒與殼聚糖形成DGK α基因-殼聚糖納米粒后，DGKa基因-殼聚糖納米粒被阻滯在加樣孔中，未被I型DNase降解，殼聚糖可保護(hù)DGK α質(zhì)粒免受核酸酶破壞。而A孔中裸DGK α質(zhì)粒被I型DNase降解為小片段。
[0053]其中，在圖4 中，A:裸DGKa質(zhì)粒+I型DNase ；Β:裸DGKa質(zhì)粒；C:DGKa基因-殼聚糖納米粒+I型DNase ；D:DGK α基因-殼聚糖納米粒。
[0054]3、治療過敏性哮喘小鼠模型
[0055]3.1、實(shí)驗(yàn)分組:SPF(無特定病原體)級(jí)BALB/c雄性小鼠，5_6周齡，隨機(jī)分為正常組(Normal)、哮喘組(Asthma)、DGK α基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組(CS-DGK a )、DGK α基因干預(yù)組(DGKa )、空白pEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組(Control plasmid)、殼聚糖納米粒對(duì)照組(CS)，共6組，每組10只。過敏性哮喘小鼠的構(gòu)建流程和治療干預(yù)流程如圖5所示。
[0056]3.2、過敏性哮喘小鼠模型的構(gòu)建:除正常組外，其余5組按以下方法構(gòu)建模型。將OVA (卵蛋白，Sigma公司)溶于生理鹽水中，配制濃度為400 μ g/ml的溶液。將400 μ g/mlOVA溶液與氫氧化鋁凝膠以1: 3比例混合，混勻后靜置I小時(shí)后可用于腹腔注射小鼠致敏。在第0，7，14天腹腔注射與氫氧化鋁凝膠(Sigma公司)混合的0VA，劑量為200 μ I/鼠，即20μ g OVA/鼠。第28、29、30、31天采用空氣壓縮霧化器霧化吸入10mg/ml OVA溶液(0VA溶于生理鹽水)激發(fā)小鼠，每天35分鐘。采用同樣的處理方法，以不含OVA的生理鹽水與氫氧化鋁凝膠溶液1: 3混合后以同樣體積腹腔注射致敏小鼠，以生理鹽水霧化吸入激發(fā)小鼠，作為正常組。
[0057]3.3、給藥方法
[0058]給藥時(shí)間:于致敏前第-13，-4天給藥。
[0059]DGK α基因干預(yù)組:將裸DGK α質(zhì)粒溶于生理鹽水，配制成2000 μ g/ml，每只小鼠肌肉注射50 μ I (含100 μ gDGK α質(zhì)粒)。
[0060]DGK α基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組:將制備的DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液，腹腔注射200 μ I/只小鼠，含36 μ g DGK α質(zhì)粒。
[0061 ] 空白pEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組:將空白pEGFP_N3質(zhì)粒溶于生理鹽水，配制成2000 μ g/ml，每只小鼠肌肉注射50 μ I (含100 μ g空白pEGFP-N3質(zhì)粒)。
[0062]殼聚糖納米粒對(duì)照組:將1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液與不含質(zhì)粒的IOmM的經(jīng)孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液在55°C的水浴中加熱15min，不含質(zhì)粒IOmM的經(jīng)孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液繼續(xù)保持在55°C的水浴中，將Iml的
1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液取出置于旋潤(rùn)振蕩器上,邊振蕩邊用吸頭向Iml的1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液加入到Iml的不含質(zhì)粒IOmM的經(jīng)孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，腹腔注射200 μ I/只小鼠。
[0063]3.4、指標(biāo)測(cè)定及其結(jié)果
[0064]3.4.1、BALF(支氣管肺泡灌洗液)中細(xì)胞總數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量
[0065]末次激發(fā)后48小時(shí)，腹腔注射麻醉小鼠，處死小鼠，摘眼球取血。切開氣管，插管，PBS (磷酸鹽緩沖液)0.8ml/次，灌洗3次，灌洗液回收率> 80%。回收BALF，1500r/min離心lOmin，留取上清，_80°C保存。細(xì)胞沉淀用Iml PBS重懸，取少許滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，算出每毫升的細(xì)胞數(shù)。剩余細(xì)胞溶液，1500r/min離心10min,棄上清,用50 μ IPBS重懸細(xì)胞沉淀后涂片，晾干后行HE (蘇木素-伊紅)染色。油鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)600個(gè)細(xì)胞，計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞各占的百分比，計(jì)算各類細(xì)胞數(shù)量。
[0066]如圖6和7所示，哮喘組的BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著高于正常組。腹腔注射DGKa基因-殼聚糖納米粒和肌肉注射裸DGK α質(zhì)粒均能降低哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，腹腔注射DGK α基因-殼聚糖納米粒作用顯著優(yōu)于肌肉注射裸DGK α質(zhì)粒。殼聚糖納米粒對(duì)照組和空白pEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量與哮喘組無顯著差異。以上結(jié)果表明DGKa質(zhì)粒能降低氣道炎癥，而DGK α基因-殼聚糖納米粒能夠顯著增強(qiáng)DGK α基因的治療效果。
[0067]其中，在圖6和7中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS_DGKa:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組；DGKa:DGK α基因干預(yù)組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質(zhì)粒對(duì)照組；CS:殼聚糖納米粒對(duì)照組。EOS:嗜酸性粒細(xì)胞；LYM:淋巴細(xì)胞；NEU:中性粒細(xì)胞；MAC:巨噬細(xì)胞。與Asthma組相比*p < 0.05 ;與CS-DGK α組相比#ρ < 0.05。
[0068]3.4.2> BALF 炎性指標(biāo)
[0069]取BALF上清液，采用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))法檢測(cè)BALF中IL-4和IL-5水平，ELISA試劑盒購自eBioscience公司，按說明書操作。
[0070]Th2細(xì)胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一。如圖8和9所示，哮喘組BALF中IL-4和IL-5水平較正常組明顯增高。腹腔注射DGKa基因-殼聚糖納米粒能顯著降低BALF中IL-4和IL-5水平，而肌肉注射裸DGK α質(zhì)粒不能降低IL-4和IL-5水平。殼聚糖納米粒對(duì)照組和空 白pEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組BALF中IL_4、IL-5水平與哮喘組無顯著差異。
[0071]其中，在圖8和9中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS-DGK a:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組；DGKa:DGK α基因干預(yù)組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質(zhì)粒對(duì)照組；CS:殼聚糖納米粒對(duì)照組。與Asthma組相比*p < 0.05。[0072]3.4.3、血清OVA特異性IgE水平檢測(cè)
[0073]小鼠處死后，摘眼球取血，室溫靜置I小時(shí)后，1000Og,離心10min,留取血清，-80°C保存。采用ELISA法檢測(cè)血清OVA特異性IgE水平，ELISA試劑盒購自Chondrex公司，按說明書操作。
[0074]圖10所示，正常組不能檢測(cè)到血清OVA特異性IgE，而哮喘組血清OVA特異性IgE明顯增高。給予DGK α基因-殼聚糖納米粒和裸DGK α質(zhì)粒干預(yù)均能顯著降低血清OVA特異性IgE水平，且DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組作用顯著優(yōu)于裸DGKa質(zhì)粒干預(yù)組。而殼聚糖納米粒對(duì)照組和空白PEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組血清OVA特異性IgE水平與哮喘組無顯
著差異。
[0075]其中，在圖10中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS-DGKa:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組；DGKa:DGK α基因干預(yù)組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質(zhì)粒對(duì)照組；CS:殼聚糖納米粒對(duì)照組。與Asthma組相比*p < 0.05 ;與CS-DGK α組相比#ρ < 0.05。
[0076]3.4.4、肺組織病理檢查
[0077]取小鼠肺組織放入4%甲醛固定液中固定過夜。常規(guī)取材后，進(jìn)行梯度酒精脫水，組織透明處理，浸蠟，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫和氣道上皮損傷情況。
[0078]如圖11~16所示，正常組氣道和肺組織均未見明顯炎癥改變。哮喘組出現(xiàn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮破壞、氣道水腫。DGKa基因-殼聚糖納米粒干預(yù)組幾乎未見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，較哮喘組明顯減輕。DGKa基因干預(yù)組氣道炎癥較輕，與哮喘組相比氣道炎癥減輕較明顯。而殼聚糖納米粒對(duì)照組和空白PEGFP-N3質(zhì)粒對(duì)照組氣道炎癥與哮喘組相似。
[0079]綜上所述，我們成功制備了 DGK α基因-殼聚糖納米粒，粒徑大小為283.4nm，多分散度為0.227，Zeta電位為+22.lmV，殼聚糖能保護(hù)DGKa質(zhì)粒不被核酸酶所降解。
[0080]而且，根據(jù)DGK α具有誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的作用，我們通過治療過敏性哮喘小鼠的動(dòng)物模型可以很好的驗(yàn)證，DGKa基因-殼聚糖納米粒能減少哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，明顯降低BALF中IL-4、IL-5和血清OVA特異性IgE水平，顯著改善氣道炎癥。DGKa基因-殼聚糖納米粒在體內(nèi)降低哮喘小鼠氣道炎癥作用顯著優(yōu)于裸DGK α質(zhì)粒，而且殼聚糖價(jià)格低廉，來源豐富，DGKa基因-殼聚糖納米粒的制備方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，DGKa基因-殼聚糖納米?？蛇m用于過敏性哮喘的治療。
[0081] 盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，包括: 步驟1、制備甘油二酯激酶α質(zhì)粒:全基因合成小鼠白細(xì)胞介素-2信號(hào)肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體而制備得甘油二酯激酶α質(zhì)粒； 步驟2、將殼聚糖溶解于I %醋酸水溶液，配制成濃度為0.5~2.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH將其pH值調(diào)節(jié)在5.5~5.7之間，無菌膜過濾，其中所述殼聚糖的分子量在2~60萬道爾頓之間，其脫乙酰度在90%~95%之間，所述無菌膜的孔徑為0.22 μ m ; 步驟3、將所述甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶解在濃度為10~25mM的經(jīng)孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度在100~360 μ g/ml之間的甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶液。其中，步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數(shù)與所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩爾數(shù)之比≥5 ； 步驟4、所述的甘油二酯激酶α質(zhì)粒溶液和所述殼聚糖醋酸溶液在溫度在55°C~57°C之間的水浴中加熱10~15min ； 步驟5、在漩渦震蕩的條件下，按體積比1:1的比例，將經(jīng)水浴加熱后的所述甘油二酯激酶α溶液緩慢勻速加入到經(jīng)水浴加熱后的所述殼聚糖醋酸溶液中，旋渦振蕩30~60s，室溫靜置，既得甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟5中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液的保存溫度為4°C。
3.如權(quán)利要求1所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，本方法制備得的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的粒徑在150nm~500nm之間，其中粒徑在150nm~300nm之間的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒占60%以上。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104001187SQ201410244407
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月19日
【發(fā)明者】王彥, 王長(zhǎng)征, 林科雄, 程曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院