免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，采用以下步驟：以高純度大豆皂苷Ab為原料，溶于吡啶，先后加入碳二亞胺試劑和苯乙胺，加水終止反應(yīng)過夜后，經(jīng)加乙酸乙酯振蕩器間歇振搖，轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置過夜，得到反應(yīng)混合物；取乙酸乙酯層，檢測目標(biāo)產(chǎn)物及目標(biāo)產(chǎn)物分子量；采用制備型液相色譜分離得到苯乙胺修飾的親脂性衍生物AbD。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備了高純度修飾物AbD，目標(biāo)產(chǎn)物分子量為1539，產(chǎn)率為5.40％，溶血率低，對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的體外免疫有增強(qiáng)作用，同時提高了OVA免疫小鼠血清中四種特異性抗體的水平。
【專利說明】免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)，尤其是涉及一種免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皂苷(Saponins) —詞最早來源于拉丁語“sapo”，又名皂甙、皂素。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，皂苷是由苷元骨架與糖基，通過糖苷鍵相連構(gòu)成的糖苷類化合物。根據(jù)苷元和糖基側(cè)鏈位置的不同，大豆皂苷可被分為四大類:A、B、E和DDMP族。
[0003]隨著近年來對大豆皂苷各種組分及化學(xué)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識逐步加深，特別是DDMP結(jié)合皂苷的發(fā)現(xiàn)，使得大豆皂苷的研究取得了很大的進(jìn)展。國內(nèi)外學(xué)者通過對大豆皂苷的生物學(xué)、生理學(xué)和藥學(xué)的活性試驗都證明，大豆皂苷對人體無毒害作用，而且還有許多有益的生理功效，由于組成大豆皂苷的苷元和多聚糖的種類不同，大豆皂苷具有多種生物學(xué)和藥學(xué)特性，如抑制癌細(xì)胞生長、增強(qiáng)免疫能力、抗病毒、抗氧化、降血脂血糖等。
[0004]近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們在研究中觀察到了皂苷的糖鏈與其生物活性之間的密切關(guān)系，對糖鏈的修飾和改造也逐漸成為研究的熱點。對活性天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造或優(yōu)化研究中，一般只在其取代基或側(cè)鏈進(jìn)行衍生化，如烷基化、?；?、氧化、還原等。對大豆皂苷而言，可在糖鏈上進(jìn)行取代基或衍生化的反應(yīng)，加入親脂或親水性的基團(tuán)，改變其極性的大小。對皂苷糖鏈的修飾方法歸納起來主要有化學(xué)法和酶法。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，多糖分子上的某些羥基被硫酸根取代后形成的硫酸化多糖有更好的抗病毒、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能的活性。除此之外，皂苷中的糖鏈經(jīng)過衍生化如乙酰化、甲基化、硫酸化等也能顯著的影響阜苷的生物活性。Daniela等對積雪草阜苷的酶法修飾做了深刻的研究。他利用脂肪酶NOVOZym435催化糖類羥基與乙酸乙烯酯的反應(yīng)，將糖類?；挥闷崦窵accases結(jié)合TEMPO (電子介導(dǎo)劑)將葡萄糖和半乳糖上的伯羥基氧化成羧基；利用β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(i3-l，4-GalT)將半乳糖苷基團(tuán)從UDP-半乳糖苷轉(zhuǎn)移到N-多糖復(fù)合物的末端N-乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，形成β-1，4糖苷鍵；還用β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)催化水解結(jié)合與末端非還原性的糖苷鍵，釋放出葡萄糖體和配基等，通過這些特定的酶法修飾，以期得到更高生物活性的積雪草皂苷。
[0006]“佐劑”來源于拉丁文單詞，意思為幫助，通過機(jī)體識別抗原、清除抗原的過程而發(fā)揮效果。免疫佐劑最早被ramon描述為一種物質(zhì)能利用特殊的抗原產(chǎn)生的免疫性，超過單獨的抗原。它是指先于抗原或與抗原合用，能非特異性增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。
[0007]到目前為止，用于人用疫苗的佐劑只有鋁膠和MF59。鋁鹽佐劑(主要是氫氧化鋁或其磷酸鹽)一直以來都是人用疫苗中主要使用的佐劑。然而，鋁鹽只誘導(dǎo)較弱的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答并 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體，即主要引導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答。而Th2型免疫應(yīng)答并不能對一些主要的傳染性疾病抗原如結(jié)核病、丙肝HCV或HIV抗原產(chǎn)生保護(hù)能力。因此，鋁鹽佐劑雖然相對安全，但并不適用于新型疫苗的設(shè)計使用。[0008]皂苷的免疫佐劑活性最早在20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)，此后國內(nèi)外學(xué)者就天然植物中皂苷的免疫佐劑作用進(jìn)行了大量的研究，但主要集中于南美皂樹皂皮中的Quil A。但由于它們較高的毒性，不令人滿意的溶血性，在水溶液中的不穩(wěn)定等，都限制了它們用在人體接種疫苗時的佐劑作用。因此，開始篩選各種類型的皂苷或修飾其為具有佐劑活性的新型衍生物顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種結(jié)構(gòu)新穎、藥用價值大、溶血率低、安全性高且可提高機(jī)體免疫力等特點的一種免疫佐劑活性增強(qiáng)的大豆皂苷單體Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法。本發(fā)明通過碳二亞胺法合成得到反應(yīng)產(chǎn)物，取乙酸乙酯層經(jīng)分析型HPLC檢測，ES1-MS鑒定目標(biāo)產(chǎn)物分子量后，由液相制備型HPLC分離純化得到目標(biāo)產(chǎn)物，紫外檢測器和FTIR對其做出有效地檢測和判斷。
[0010]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0011]免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，采用以下步驟:
[0012](I)以高純度大豆皂苷Ab為原料，溶于吡啶，先后加入碳二亞胺試劑和苯乙胺，加水終止反應(yīng)過夜后，經(jīng)加乙酸乙酯振蕩器間歇振搖，轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置過夜，得到反應(yīng)混合物；
[0013](2)取乙酸乙酯層，檢測目標(biāo)產(chǎn)物及目標(biāo)產(chǎn)物分子量；
[0014](3)采用制備 型液相色譜分離得到苯乙胺修飾的親脂性衍生物AbD。
[0015]步驟⑴具體采用以下步驟:
[0016]a、混合反應(yīng):稱取大豆皂苷Ab，溶于吡啶，先后加入二環(huán)己基碳二亞胺，N-羥琥珀酰亞胺和苯乙胺，大豆皂苷、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為80: 65-70: 35-40，吡啶與苯乙胺的體積比為500: 5_6，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，室溫下反應(yīng)3天；
[0017]b、加水終止反應(yīng):向反應(yīng)混合液中加入超純水，超純水與吡啶的體積比為1: 1，控制磁力攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min,室溫過夜；
[0018]C、靜止分層:過夜處理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯與超純水的體積比為2: 1，振蕩器間歇振搖lOmin，轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置過夜，得到水層和乙酸乙酯層。(根據(jù)實驗數(shù)據(jù)修改為比例關(guān)系，這樣能夠擴(kuò)大專利的保護(hù)范圍)
[0019]所述的高純度大豆皂苷Ab的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%
[0020]步驟⑵采用液相色譜(HPLC)、紫外可見光二極管陣列(PDA)檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測目標(biāo)產(chǎn)物；采用電噴霧電離質(zhì)譜(ES1-MS)鑒定目標(biāo)產(chǎn)物的分子量。
[0021]檢測目標(biāo)產(chǎn)物時，檢測目標(biāo)產(chǎn)物的色譜條件:分離柱=AquasilC18 (150mmX4.6mm, 3 μ m);溫度:25°C;流速 lmL/min ;流動相 A:0.002% (v/v)乙酸-水溶液，B:0.002% (v/v)乙酸-乙腈溶液；檢測器=PDA檢測器(監(jiān)控波長205nm)和ELSD檢測器；HPLC梯度洗脫。
[0022]HPLC梯度洗脫程序如下:
【權(quán)利要求】
1.免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，該方法采用以下步驟: (1)以高純度大豆皂苷Ab為原料，溶于吡啶，先后加入碳二亞胺試劑和苯乙胺，加水終止反應(yīng)過夜后，經(jīng)加乙酸乙酯振蕩器間歇振搖，轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置過夜，得到反應(yīng)混合物； (2)取乙酸乙酯層，檢測目標(biāo)產(chǎn)物及目標(biāo)產(chǎn)物分子量； (3)采用制備型液相色譜分離得到苯乙胺修飾的親脂性衍生物AbD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體采用以下步驟: a、混合反應(yīng):稱取大豆皂苷Ab，溶于吡啶，先后加入二環(huán)己基碳二亞胺，N-羥琥珀酰亞胺和苯乙胺，大豆皂苷、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為80: 65-70: 35-40，吡啶與苯乙胺的體積比為500: 5_6，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，室溫下反應(yīng)3天； b、加水終止反應(yīng):向反應(yīng)混合液中加入超純水，超純水與吡啶的體積比為1: 1，控制磁力攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，室溫過夜； C、靜止分層:過夜處理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯與超純水的體積比為2: 1，振蕩器間歇振搖lOmin，轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置過夜，得到水層和乙酸乙酯層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述的高純度大豆皂苷Ab的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，步驟(2)采用液相色譜(HPLC)、紫外可見光二極管陣列(PDA)檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測目標(biāo)產(chǎn)物；采用電噴霧電離質(zhì)譜(ES1-MS)鑒定目標(biāo)產(chǎn)物的分子量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，檢測目標(biāo)產(chǎn)物時，檢測目標(biāo)產(chǎn)物的色譜條件:分離柱:Aquasil C18(150mmX4.6mm,3 μ m);溫度:25°C ;流速 lmL/min ;流動相 A:0.002% (v/v)乙酸-水溶液，B:0.002% (v/V)乙酸-乙腈溶液；檢測器:PDA檢測器(監(jiān)控波長205nm)和ELSD檢測器；HPLC梯度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，鑒定目標(biāo)產(chǎn)物的分子量時，電噴霧電離質(zhì)譜的檢測條件:掃描范圍:100-2000m/z，毛細(xì)管電壓:1.5kV，樣品流速:15 μ L/s ;掃描時間:3min ;流量:0.2mL/min ;溫度:2000C0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的制備型液相色譜的分析條件為=Daisogel C18-10 μ m, 100 A(20mmX 250mm)分離柱；流速10mL/min ;流動相為A:水；B:0.01% (v/v)三氟乙酸-乙腈；檢測器:PDA檢測器；HPLC梯度洗脫，收集保留時間約為95min的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后凍干濃縮液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，制備得到的苯乙胺修飾的親脂性衍生物AbD經(jīng)傅里葉紅外光譜(FTIR)和紫外檢測器解析分子結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫佐劑大豆皂苷Ab親脂性苯乙胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述的紫外檢測器的分析條件為:紫外可見光掃描200-800nm，檢測化合物最大吸收波 長。
【文檔編號】A61P37/04GK104031110SQ201410245437
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】趙大云, 馮凡, 任小云 申請人:上海交通大學(xué)