一種腫瘤特異性靶向多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腫瘤特異性靶向多肽及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明的腫瘤特異性靶向多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明的多肽與聚酰胺-胺型樹枝狀高分子納米材料連接后在體外可以很好的與多種腫瘤細(xì)胞結(jié)合，作為靶向劑將在腫瘤的診斷顯像和靶向治療方面有廣闊的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種腫瘤特異性靶向多肽及其應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01310258476.0，申請(qǐng)日為2013年6月26日，發(fā)明名稱為“一種腫瘤特異性靶向多肽及其應(yīng)用”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)多肽【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及噬菌體展示的多肽及其應(yīng)用。更具體的說(shuō)是一種可與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]腫瘤在世界上是最常發(fā)生的疾病之一，有許多先進(jìn)國(guó)家，其中肺癌的死亡率居所有癌病死亡率的第一位。目前肺癌的治療主要有手術(shù)、放療和化療等手段。手術(shù)和放射性治療都是局部治療方式，無(wú)法控制晚期的轉(zhuǎn)移，而且許多病人由于體質(zhì)較弱，無(wú)法接受此類治療；而化療雖然有一些療效不錯(cuò)的化療藥物，但由于都缺乏腫瘤細(xì)胞特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷大量的骨髓及其它增值旺盛的細(xì)胞，都具有較強(qiáng)的副作用，并且多次化療之后往往會(huì)產(chǎn)生耐藥性，大大降低藥物療效。所以目前對(duì)于腫瘤的靶向治療是腫瘤治療的熱點(diǎn)。
[0004]卩遼菌體展不技術(shù)(ScottJK, Smith GP Searching for peptide ligands withan epitope library.Science.1990 ；249 (4967):386-90)是一項(xiàng)研究生物活性?shī)y、妝類藥物篩選和抗體制備等非常有用的手段。近年發(fā)展起來(lái)的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)體內(nèi)篩選方法(Pasqualini R, Ruoslahti E.0rgan targeting in vivo using phage display peptidelibraries.Nature.1996 ；380(6572):364-6)，是尋找與組織，器官特異性結(jié)合多肽的有效手段。此方法可在受體分子 尚不清楚的情況下，以受體天然存在的環(huán)境組織器官為配基，利用噬菌體短肽的抗原特異性，尋找未知的靶分子，確定其結(jié)構(gòu)域。具有特異結(jié)合活體組織、器官并在體內(nèi)具有穩(wěn)定性好、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。這一方法可以在靶點(diǎn)分子機(jī)理未知的情況下直接篩選特異結(jié)合的配體，縮短了研究周期。而且篩選與治療在相同條件下進(jìn)行，避免了體外篩選得到的配體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)無(wú)效或活性低的缺點(diǎn)，最大程度保證了篩選到的短肽的靶向特異性。目前國(guó)際上已經(jīng)通過(guò)噬菌體體內(nèi)篩選技術(shù)成功得到了幾組特異與小鼠腦、腎部位血管和腫瘤血管結(jié)合的小肽，而且將此小肽與阿霉素和腫瘤壞死因子TNF-α偶聯(lián)后，在小鼠腫瘤模型中起到了良好的抗腫瘤作用，詳見(jiàn)Scott JK, Smith GP Searching for peptideligands with an epitope library.Science.1990 ；249 (4967):386-90 ；PasqualiniR, Ruoslahti E.0rgan targeting in vivo using phage display peptide libraries.Nature.1996 ；380 (6572):364-6 ；Zhang, L.；Hoffman, J.A.；Ruoslahti, E.，Molec μ Iarprofiling of heart endothelial cells.Circulation2005,112, (11), 1601-11。
[0005]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1126429.2公開了一種抗小細(xì)胞肺癌多肽混合物一共有三種形式:SPDD多肽混合物，SPDD結(jié)構(gòu)趨同化組合的多肽文庫(kù)的多肽混合物，前兩者混合的多肽混合物。作為拮抗劑，用于制備抗小細(xì)胞肺癌的多肽藥物。
[0006]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3158296.6公開了一種具有抗腫瘤作用的多肽，由I個(gè)Ala、l個(gè)6111、1個(gè)617、1個(gè)1^11、2個(gè)？1'0、1個(gè)1111'、1個(gè)了71'組成的八肽，分子量為846.9，可應(yīng)用NDlOO來(lái)治療腫瘤。
[0007]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00710066323.0公開了一種具有腫瘤靶向性的多肽及其制備方法。它的氨基酸序列結(jié)構(gòu)為:CASPSGALRSC ；或CFPVPGHDLVC ；或CFSVPGHDIVC ；或CTPMSLSLSEC ;或CYTYPLGffHIC人工合成具有腫瘤靶向性的多肽。
[0008]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2149419.3公開了一種癌胚抗原特異性結(jié)合肽及其與TNF-α的融合蛋白主要是通過(guò)噬菌體隨機(jī)展示肽庫(kù)篩選出與癌胚抗原特異性結(jié)合的結(jié)合肽，這些結(jié)合肽可以用作癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤導(dǎo)向治療藥物的載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明通過(guò)噬菌體隨機(jī)多肽文庫(kù)體內(nèi)篩選與肺癌組織特異結(jié)合的多肽，制備肽類肺癌早期診斷和治療試劑。該多肽與生物高分子材料聚乳酸包合的抗腫瘤藥物多西紫杉醇鏈接后，制備的新型靶向抗腫瘤藥物。本發(fā)明的多肽可以很好地靶向腫瘤細(xì)胞，而且將其作為靶向劑可以對(duì)腫瘤顯像和治療起到積極。
[0010]本發(fā)明的多肽與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的有益效果在于:本發(fā)明篩選得到的多肽不但具有傳統(tǒng)抗體分子優(yōu)點(diǎn)，而且分子量小、穿透力強(qiáng)、容易到達(dá)腫瘤組織、具有良好的腫瘤靶向作用、診斷腫瘤更加靈敏，可用于制備診斷腫瘤的試劑盒，以及治療腫瘤的藥物和攜帶腫瘤藥物的靶向劑方面的應(yīng)用。 [0011]本發(fā)明提供了一種腫瘤特異性靶向多肽，所述多肽選自如氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽。
[0012]優(yōu)選地，所述腫瘤選自子宮頸癌細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞或人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明所述的腫瘤特異性靶向多肽的核苷酸序列，所示核苷酸序列為SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列，或與其互補(bǔ)的序列。
[0014]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的腫瘤特異性靶向多肽在制備腫瘤早期診斷和治療試劑中的用途。
[0015]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的腫瘤特異性靶向多肽在制備作為腫瘤靶向劑藥物方面的用途。
[0016]另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明所述的腫瘤特異性靶向多肽，與生物高分子材料聚乳酸連接，在制備腫瘤早期診斷和治療試劑中的用途。優(yōu)選地，所述的生物高分子材料為納米材料。更優(yōu)選地，所述的生物高分子材料聚乳酸包合抗腫瘤藥物。更優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物是多西紫杉醇。
[0017]另一方面，本發(fā)明提供了一種新型靶向抗腫瘤藥物，其包括如根據(jù)本發(fā)明所述的腫瘤特異性靶向多肽、生物高分子材料、以及抗腫瘤藥物。
[0018]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下的方法予以實(shí)現(xiàn):
[0019]方法:結(jié)果通過(guò)三輪篩選獲得了七肽噬菌體多肽，該多肽與生物高分子材料聚乳酸包合的抗腫瘤藥物多西紫杉醇鏈接后，制備的新型靶向抗腫瘤藥物。結(jié)論:該多肽可以很好的靶向與腫瘤細(xì)胞，將其作為靶向劑可以對(duì)腫瘤顯像和治療起到積極的作用。特別是對(duì)子宮頸癌細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞將其作為靶向劑可以對(duì)腫瘤的診斷顯像和靶向治療將會(huì)有廣闊的應(yīng)用。[0020]本發(fā)明公開的腫瘤特異性靶向多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)PLTPLP和CVKTPAQSC。
[0021]編碼的核苷酸序列分別為CTGCCGTTGACTCCGCTTCCG和TGTGTGAAGACGCCGGCTCAGTCGTGC。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步公開了腫瘤特異性靶向多肽在制備肽類腫瘤早期診斷和治療試劑方面的應(yīng)用。特別是作為腫瘤靶向劑藥物方面的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明所述的腫瘤特異性靶向多肽的應(yīng)用方法是:將該多肽與生物高分子材料聚乳酸包合的抗腫瘤藥物多西紫杉醇鏈接后，制備的新型靶向抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1表示各治療組動(dòng)物體重變化。CON為對(duì)照組，DTX為常規(guī)藥物組，NDTX為納米制劑組，TNDTX為靶向肽納米制劑高劑量組，TNDTX-L為靶向肽納米制劑低劑量組。
[0025]圖2表示各治療組瘤體解剖。
[0026]圖3A表示各治療組相對(duì)腫瘤體積變化；*p〈0.05，與模型組比較；#p〈0.05，與常規(guī)藥物組比較。
[0027]圖3B表示28天瘤體重量。CON為對(duì)照組，DTX為常規(guī)藥物組，NDTX為納米制劑組，TNDTX為靶向肽納米制劑高劑量組，TNDTX-L為靶向肽納米制劑低劑量組。ap〈0.05，與對(duì)照組比較；bp〈0.05 ;與常規(guī)藥物組比較；ep〈0.05，與納米藥物組比較。
[0028]圖4表示對(duì)照組(CON)與常規(guī)藥物多西紫杉醇組(DTX)肝臟HE染色。上圖示正常裸鼠肝臟，中圖為CON組，下圖為DTX組，右圖為左圖紅框指示放大區(qū)域。左圖標(biāo)尺表示500 μ m,右圖標(biāo)尺表示200 μ m。
[0029]圖5表示納米藥物組與靶向納米藥物組組肝臟HE染色。上圖為納米藥物組(NDTX)，中圖為靶向納米藥物低劑量組(TNDTX-L)，下圖為靶向納米藥物高劑量組(TNDTX-H),右圖為左圖紅框指示放大區(qū)域。左圖標(biāo)尺表示500 μ m,右圖標(biāo)尺表示200 μ m。
[0030]圖6表示給藥后各組裸鼠血漿AFP含量。*P〈0.05與CON組相比；#P〈0.05與DTX組相比，$Ρ〈0.05與NDTX相比。
[0031]圖7表示給藥后各組裸鼠血漿GPT含量。*Ρ〈0.05與CON組相比；#Ρ〈0.05與DTX組相比，$Ρ〈0.05與NDTX相比。
[0032]圖8表示給藥后各組裸鼠血漿GOT含量。*Ρ〈0.05與CON組相比；#Ρ〈0.05與DTX組相比，$Ρ〈0.05與NDTX相比。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供本發(fā)明的環(huán)狀肽和線性七肽的制備實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0034]噬菌體展示體內(nèi)篩選多肽
[0035]一、人Α549非小細(xì)胞肺癌裸鼠模型的建立
[0036](I)取四周齡Balb/C雌性裸鼠(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，放入SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。
[0037] (2)培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌NCI A549，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌細(xì)胞株，胰酶常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlO7個(gè)/ml，取200 μ I即2χ106個(gè)細(xì)胞接種于每只裸鼠的前肢腋下皮下，觀察細(xì)胞接種后的生長(zhǎng)狀況，大約5-6天后可見(jiàn)瘤塊，待兩周時(shí)腫瘤直徑大小約為0.3~0.5cm，可做體內(nèi)噬菌體篩選實(shí)驗(yàn)。
[0038]二、噬菌體展示多肽文庫(kù)小鼠體內(nèi)的篩選
[0039](I)E.coli ER2738 的培養(yǎng)
[0040]以無(wú)菌操作技術(shù)從ER2738大腸桿菌(New England Ph.D.-C7CTM噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒自帶)的甘油凍存物中挑取一接種環(huán)，劃線法接種于四環(huán)素抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)24h，待平板上可見(jiàn)白色透亮的菌斑形成后，將基本培養(yǎng)平板至于4°C保存。
[0041]平板上挑取E.coli ER2738單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，37°C 225轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(0D_約為0.5)。(做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前一天晚上接種)。
[0042](2)靶向噬菌體的篩選
[0043]I)準(zhǔn)備100 μ g/ml的革巴分子溶液(溶于0.1M pH8.6的NaHCO3)。
[0044]2)每板加入1.5ml上述溶液，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤(rùn)(小心不要使溶液濺出)。 [0045]3)在增濕容器中4°C輕微震蕩，孵育過(guò)夜。
[0046]4)第二天，挑ER2738單克隆(噬菌體滴度測(cè)定時(shí)鋪的板)于IOml LB液體培養(yǎng)基中。如果同一天擴(kuò)增洗脫的噬菌體，也可將ER2738接種于20ml LB液體培養(yǎng)基，37°C劇烈震
蕩培養(yǎng)。
[0047]5)倒掉每板中的包被液，板倒置在干凈的紙巾上用力拍甩以除去殘余溶液。每板加滿封阻液，4°C作用至少lhr。
[0048]6)按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1% [v/v]Tween-20)緩沖液快速洗板6次。每次均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液。
[0049]7)用Iml的TBST緩沖液稀釋2 X IO11的噬菌體(即10 μ I的原始文庫(kù))，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動(dòng)10_60min。
[0050]8)傾倒除去未結(jié)合噬菌體，倒置板在干凈的紙巾上拍甩除去殘余溶液。
[0051]9)按6中所述方法用TBST緩沖液洗板10次，每次換一干凈紙巾以避免交叉污染。
[0052]10)根據(jù)所研究的分子間相互作用，用Iml適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液0.2M甘氨酸-HCl (pH2.2)、lmg/ml BSA來(lái)分離已結(jié)合的分子:溫和搖動(dòng)>10min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。然后再用150 μ IlM Tris-HCl (pH9.1)中和上述洗脫液。
[0053]11)按上述常規(guī)M13方法中的程序測(cè)定少量(I μ I)洗脫物的滴度。噬菌體滴度測(cè)定方法:
[0054]①接種ER2738單菌落于5-10ml LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD6c?~0.5)。
[0055]②細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，微波爐融化上層瓊脂，分成3ml等份于滅菌試管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。保存于45°C備用。
[0056]③37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每個(gè)噬菌體稀釋度取一個(gè)平板備用。
[0057]④在LB中準(zhǔn)備20倍系列稀釋的噬菌體。
[0058]建議稀釋范圍:擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-1O11 ;未擴(kuò)增的淘選洗脫物:IO1-1O'
[0059]⑤當(dāng)菌體培養(yǎng)物達(dá)對(duì)數(shù)中期，分成200μ I等份于微量離心管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。
[0060]⑥每管加入10 μ I不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育l_5min。
[0061]⑦將感染細(xì)胞加入45°C預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當(dāng)傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。
[0062]⑧待平板冷卻5min后，倒置于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0063]⑨檢查平板，計(jì)數(shù)有大約IO2個(gè)噬菌斑的平板上的斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ I噬菌體的空斑形成單位(Pfu)滴度。
[0064]12)剩余洗脫物應(yīng)當(dāng)被擴(kuò)增:將洗脫物加入到20ml ER2738培養(yǎng)物中(菌體應(yīng)當(dāng)處于對(duì)數(shù)前期)，37°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4.5hr。
[0065]13)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一離心管中，然后，4°C 10，OOOrpm離心10min。上清液轉(zhuǎn)入另一
離心管中，再離心。
[0066]14)將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4°C沉淀過(guò)夜。
[0067]15) 40C 10，OOOrpm離心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清 液。
[0068]16)沉淀物重懸于Iml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C離心5min使殘余細(xì)胞沉淀。
[0069]17)上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15_60mino
[0070]4°C離心10min，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清。
[0071]18)沉淀物重懸于200 μ I TBS, 0.02% NaN3中。離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴(kuò)增后的洗脫物。
[0072]19)分別稀釋IO6-1Oiq測(cè)定噬菌體滴度。取10npfu作為第二次篩選的噬菌體。
[0073]重復(fù)以上操作,進(jìn)行三輪篩選。
[0074](3)噬菌體DNA的提取純化及其序列測(cè)定
[0075]I)按上述方法進(jìn)行噬菌斑擴(kuò)增，在第一步離心后，將500 μ I含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一
新鮮離心管。
[0076]2)加 200 μ I PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置 IOmin。
[0077]3)離心10min,棄上清液。
[0078]4)短暫離心，小心吸去殘余上清。
[0079]5)沉淀物徹底重懸于100 μ I碘化物緩沖液中，加入250 μ I乙醇。室溫溫育IOmin0短時(shí)間的室溫溫育使單鏈?zhǔn)删wDNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。
[0080]6)離心10min，棄上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。
[0081]7)沉淀重懸于 30 μ I TE [IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)，ImM EDTA]中。
[0082]8)取5μ I的上述模板溶液，用試劑盒自帶的-96引物進(jìn)行測(cè)序。
[0083]樣品送上海生工進(jìn)行測(cè)序。
[0084]三、環(huán)肽序列的建立
[0085]根據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，確定環(huán)肽噬菌體序列為:TGTGTGAAGACGCCGGCTCAGTCGTGC。根據(jù)DNA序列可以推導(dǎo)出外源插入的環(huán)肽蛋白序列為:CVKTPAQSC，通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸的二硫鍵交聯(lián)成環(huán)形七肽，環(huán)狀多肽的結(jié)合主要是靠環(huán)形內(nèi)的多肽與蛋白結(jié)合的，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)方便進(jìn)行同位素標(biāo)記，在環(huán)形多肽的末端加了一個(gè)酪氨酸，為了能夠更好的與載體連接，將左側(cè)末端的丙氨酸換成了精氨酸。多肽序列委托北京中科亞光生物科技有限公司進(jìn)行合成，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行HPLC純化和質(zhì)譜鑒定，純度98%以上，分子量與理論值相符。
[0086]四、線性七肽序列的建立
[0087]同樣地， 申請(qǐng)人:根據(jù)上述相同的方法，確立了另一種出外源插入的蛋白序列為:線性七肽的氨基酸序列為L(zhǎng)PLTPLP(SEQ ID NO:1)。
[0088]實(shí)施例1、獲得的序列為L(zhǎng)PLTPLP的線性七肽與抗腫瘤藥物聯(lián)合的體內(nèi)抗腫瘤效果
[0089]本實(shí)例將該祀向肽與載藥納米制劑相連接構(gòu)建祀向納米制劑。
[0090]靶向納米制劑的制備
[0091]將包合多西紫杉醇的載藥納米粒子重懸于MES緩沖溶液中，加入偶聯(lián)縮合劑，室溫孵育15min后,加入0.lmg/ml的祀向肽,所述祀向肽的序列為L(zhǎng)PLTPLP,旋轉(zhuǎn)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，15000rpm離心10min收集粒子，重懸洗滌三次后冷凍干燥即得靶向納米制劑。
[0092]體內(nèi)抗腫瘤治療 實(shí)驗(yàn)研究
[0093]Balb/c裸鼠50只，適應(yīng)環(huán)境后，于右側(cè)腋窩處皮下注射A549細(xì)胞106個(gè)/只，2周后腫瘤開始形成，每3天測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑及短徑并計(jì)算瘤體積(瘤體積=0.5x長(zhǎng)徑X短徑2)，當(dāng)瘤體積達(dá)到150mm3后，分別給予常規(guī)多西紫杉醇10mg/kg (常規(guī)藥物組)、多西紫杉醇納米制劑10mg/kg (納米制劑組)、多西紫杉醇祀向肽納米制劑10mg/kg (祀向肽納米制劑高劑量組)、多西紫杉醇靶向肽納米制劑5mg/kg(靶向納肽米制劑低劑量組)及生理鹽水(模型組)。以第一次給藥時(shí)的瘤體積記作Vtl,每周給藥一次，每周記錄兩次動(dòng)物的體重及瘤體積情況，記瘤體積為Vt，計(jì)算相對(duì)腫瘤體積(VtZiVtl)表示藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響狀況。
[0094]動(dòng)物體重監(jiān)測(cè)曲線顯示，降低使用劑量后，動(dòng)物的耐受能力更好，體重與之前相比有一定的上升(圖1)。給藥第20天起，與對(duì)照組相比較，靶向肽納米制劑組的相對(duì)腫瘤體積有了明顯的減小(p〈0.05)。而常規(guī)藥物和非靶向肽納米制劑在第24天時(shí)才顯示出一定的抗腫瘤作用。第28天時(shí)，與對(duì)照組相比，各給藥組的相對(duì)腫瘤體積均有了明顯的減小，與常規(guī)的多西紫杉醇組相比，靶向納米制劑的抗腫瘤效果進(jìn)一步提高(P〈0.05)(圖2，圖3A和3B)。在體結(jié)果顯示，長(zhǎng)期低劑量的治療方案得到了與前期高劑量治療方案類似的結(jié)果，靶向納米制劑低劑量組，雖然其給藥量只有常規(guī)藥物組的一半，但仍顯示與高劑量藥物相當(dāng)?shù)目鼓[瘤能力，表明納米靶向制劑具有明顯的治療優(yōu)勢(shì)。
[0095]為了進(jìn)一步驗(yàn)證納米制劑的靶向性，我們開展了藥物體內(nèi)分布觀察。結(jié)果顯示，多西紫杉醇給藥后迅速分布于體內(nèi)各組織，在肝、脾、肺、腎組織中，靶向制劑組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度均低于常規(guī)制劑組，而在腫瘤組織和心臟中，靶向制劑組的藥物濃度高于常規(guī)制劑組(表1)。藥物在腫瘤內(nèi)的聞度富集，顯不納米制劑具有良好的祀向性，提聞了藥物對(duì)腫瘤組織的選擇性。而在心臟中，由于心臟是富含血管的器官，在心臟組織的富集也側(cè)面反映出了靶向制劑的血藥濃度得到了一定的提高，而且半衰期更長(zhǎng)。
[0096]表1多西紫杉醇常規(guī)制劑及靶向納米制劑在荷瘤動(dòng)物的體內(nèi)分布
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤特異性靶向多肽，所述多肽如氨基酸序列SEQ ID NO:2所示；優(yōu)選所述腫瘤特異性靶向多肽為環(huán)肽。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性靶向多肽的核苷酸序列，所示核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、或其互補(bǔ)序列。
3.權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性靶向多肽在制備腫瘤早期診斷和治療試劑中的用途。
4.權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性靶向多肽在制備腫瘤靶向劑藥物方面的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其中所述腫瘤選自子宮頸癌細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞或人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其中所述的腫瘤特異性靶向多肽與生物高分子材料連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的生物高分子材料為聚乳酸；優(yōu)選生物高分子材料為納米材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的生物高分子材料包合抗腫瘤藥物。
9.根據(jù)權(quán) 利要求8所述的用途，其中所述抗腫瘤藥物是多西紫杉醇。
10.一種新型靶向抗腫瘤藥物，其包括如SEQ ID NO:2所示的腫瘤特異性靶向多肽、生物高分子材料以及抗腫瘤藥物。
【文檔編號(hào)】A61K31/337GK104017049SQ201410246052
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】左萍萍, 劉雁勇, 楊楠, 姜堯, 張慧豐 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所