鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)變體及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白及其變體，及其在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。使本發(fā)明的蛋白變體通過真核表達，能夠相對于原始蛋白顯著的提高癌細胞的抑制效果。
【專利說明】鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，本發(fā)明涉及鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體。
【背景技術(shù)】
[0002]鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)以下簡稱鰩功能區(qū)，鰩血管生成抑制因子I是從南海海域一種鰩組織中分離出來的蛋白質(zhì)(分子量42KD)。研究結(jié)果顯示:鰩血管生成抑制因子I顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細胞誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成；無論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤組織微血管密度，下調(diào)促血管生成因子VEGF的表達；對裸小鼠黑色素瘤B16細胞的轉(zhuǎn)移也有強抑制作用；下調(diào)促轉(zhuǎn)移因子⑶44v6和ErBb2的表達；與5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合應(yīng)用時效果更顯著。鰩血管生成抑制因子I的作用靶點與美國基因技術(shù)研究所開發(fā)出的抗癌新藥Avastin不同。Avastin是基因工程產(chǎn)品，是VEGF的抗體，其作用靶點是VEGF ;鰩血管生成抑制因子I是天然產(chǎn)物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和TOGF。
[0003]在現(xiàn)有技術(shù)中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的特異位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規(guī)的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性， 申請人:通過大量的實驗，針對鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)本身具有更高抑制活性的變體。 [0004]發(fā)明詳述
[0005]本發(fā)明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應(yīng)于SEQ ID NO:1的功能區(qū)的位置 9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K 或217R的位置包含修飾。具體而言，本發(fā)明的變體具有改善的抑制活性。
[0006]優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的方法、呈現(xiàn)改善的抑制活性的蛋白變體為以下任一修飾:9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T。
[0007]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白變體的方法，包括(a)培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。
[0008]在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。
[0009]所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
[0010]本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，Protein Purificat1n, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York,1989)。
[0011]本發(fā)明的多肽用于制備相應(yīng)的藥物，去用于抑制癌癥。
【具體實施方式】
[0012]實施例1
[0013]1.鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)的獲得
[0014]鰩功能區(qū)由下列氨基酸殘基按下列順序組成:
[0015]TLDIYKQLRDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPVIQDRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKG⑶DLDPNYVLSSRVRTGRSIKG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK
[0016]2、鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體的構(gòu)建
[0017]突變點的引入
[0018](I)、根據(jù)相應(yīng)的突變位點設(shè)計相應(yīng)的誘變引物，采用PCR定點突變法在鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)所對應(yīng)的基因上把野生型對應(yīng)的氨基酸位點進行突變；
[0019](2)、上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶進行酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pmD-18T載體片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞；
[0020](3)、鑒定重組質(zhì)粒:用酶切、PCR方法對重組質(zhì)粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到突變后的核苷酸序列。這些核苷酸序列說對應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQ ID NO:1的基礎(chǔ)上，在 9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T 位置進行了相應(yīng)的突變。
[0021](4)、pPIC6 α -鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體的表達
[0022]將上述步驟構(gòu)建獲得的鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體基因的兩端引入酶切位點，在上游加入信號肽序列，構(gòu)建得到pPicea -鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體載體，鑒定后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染畢赤酵母細胞，并進行真核表達，采用Blasticidin作為篩選標記。誘導(dǎo)其分泌表達目的蛋白，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度為0.5%、連續(xù)誘導(dǎo)4天得到的蛋白表達量較高。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離得到的蛋白條帶在Westernblot檢測中能與兔抗hCG的抗血清發(fā)生反應(yīng)。實驗結(jié)果表明我們構(gòu)建的重組質(zhì)粒PPIC6 α -鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體在巴斯德畢赤酵母中平均的表達量為表達量約為140mg/L。
[0023]3、鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)變體抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移
[0024]BALB/c裸鼠隨機分為對照組、陽性(環(huán)磷酰胺)對照組和實驗組，每組8只，雌雄各半。每鼠背部皮下接種0.2ml Lewis肺癌細胞懸液(4X 106細胞)Lewis肺癌細胞。腫瘤接種后第7天，實驗組腹腔注射不同劑量鰩功能區(qū)溶液，每天I次，共14次；對照組腹腔注射等量溶劑；陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺，每周I次，共2次。第21天犧牲小鼠，剝離腫瘤稱重(用10%中性福爾馬林固定用于免疫組化實驗)，解剖、觀察并記錄肝轉(zhuǎn)移節(jié)結(jié)數(shù)。
按下式計算腫瘤生長抑制率和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制率:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。
2.—種鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白變體，其特征在于:其在至少一個對應(yīng)于SEQID NO:I 的成熟多肽的位置 9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K 或 217R 進行取代。
3.—種鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白變體，其特征在于，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，分別在 9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T 進行相應(yīng)的取代。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白變體在制備抑制腫瘤藥物中的用途。
5.一種 抗腫瘤藥物制劑，它含有權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上合適的載體。
【文檔編號】A61P35/00GK104031136SQ201410249736
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】張壘, 張勇 申請人:杭州普英生物科技有限公司