一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法包括以下步驟：A、將摘取的動(dòng)物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落；B、將水更換為脫細(xì)胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細(xì)胞試劑和水交替使用，以使基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞脫落；C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細(xì)胞角膜；D、將所述脫細(xì)胞角膜進(jìn)行削切，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)只含有前彈力層和基質(zhì)層；其中，所述脫細(xì)胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。本發(fā)明提供的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，能有效的去除容易引起免疫反應(yīng)的角膜細(xì)胞成分和可溶性蛋白，得到完好的只含有前彈力層和基質(zhì)層的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
【專利說(shuō)明】一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，尤其涉及一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜病是全球范圍內(nèi)第二致盲眼病，并且以每年150~200萬(wàn)病例的速度遞增。角膜移植是目前治療角膜盲唯一有效的方法，但供體角膜來(lái)源的極端匱乏制約著角膜移植的開展。角膜基質(zhì)如動(dòng)物等動(dòng)物的角膜基質(zhì)具有與人角膜基質(zhì)類似的組織結(jié)構(gòu)、生物物理特性和光學(xué)特性，但異種移植后強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)阻礙了異種角膜在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，角膜基質(zhì)內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞是引起基質(zhì)型排斥反應(yīng)的主要抗原，而作為角膜基質(zhì)架構(gòu)的膠原纖維在種系間高度保守，抗原性很低，無(wú)細(xì)胞的異種角膜移植后不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。因此，將動(dòng)物的基質(zhì)細(xì)胞完全脫去，使之成為無(wú)細(xì)胞的角膜基質(zhì)可能是人角膜基質(zhì)的理想替代物。
[0003]但現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞角膜基質(zhì)在脫細(xì)胞過(guò)程中，采用的是胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚)、脫氧膽酸鈉、SDS (十二烷基磺酸鈉)等表面活性劑，此類方法雖然能去除細(xì)胞成分，但反應(yīng)劇烈，對(duì)角膜基質(zhì)破壞嚴(yán)重，不能達(dá)到良好的生物相容性。此外，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為全層角膜，臨床使用前需根據(jù)創(chuàng)面大小以及深度進(jìn)行處理后才能使用，在操作過(guò)程中材料被污染的幾率增大，基質(zhì)層容易被破壞，且處理后的角膜基質(zhì)層表面不平整，不利于創(chuàng)面愈合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，旨在快速而溫和地去除角膜中免疫原細(xì)胞成分和可溶性蛋白，從而得到只含有前彈力層和基質(zhì)層的脫細(xì)胞角月吳基質(zhì)。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，包括以下步驟:
[0006]A、將摘取的動(dòng)物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落；
[0007]B、將水更換為脫細(xì)胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細(xì)胞試劑和水交替使用，以使基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞脫落；
[0008]C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細(xì)胞角膜；
[0009]D、將所述脫細(xì)胞角膜進(jìn)行削切，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)只含有iu彈力層和基質(zhì)層；
[0010]其中，所述脫細(xì)胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。
[0011]優(yōu)選地，所述脫細(xì)胞試劑為:濃度為2~5mol/L的NaCl溶液與濃度為0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
[0012] 優(yōu)選地，所述脫細(xì)胞試劑的pH值為7.0~7.4 ;所述脫細(xì)胞試劑和/或水的溫度均為2~37°C。[0013]優(yōu)選地，所述A步驟的振蕩時(shí)間為5~10h，期間，每隔I~a更換一次水；所述8步驟的振蕩時(shí)間為40~70h，期間，每隔I~2h交替更換一次脫細(xì)胞試劑或水。
[0014]優(yōu)選地，所述脫水劑中甘油的體積比為50~90%。
[0015]優(yōu)選地，在所述C步驟之后、D步驟之前還包括以下步驟:
[0016]X、使用濃度為2~5g/L碳酸氫鈉溶液清洗所述動(dòng)物角膜2~lOmin。
[0017]優(yōu)選地，在所述A步驟之后、B步驟之前還包括以下步驟:
[0018]Y、將水更換成濃度為0.02~2%。的次氯酸鈉溶液，靜置10~60min。
[0019]優(yōu)選地，在所述D步驟之后，還包括以下步驟:
[0020]Z、將所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用鈷-60輻照。
[0021]此外，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，由前述制備方法制備得到。
[0022]優(yōu)選地，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的厚度為150~550 μ m,直徑為0.5~L 2mm。
[0023]本發(fā)明通過(guò)脫細(xì)胞試劑和水的交替使用，反復(fù)改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質(zhì)中免疫原細(xì) 胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。此外，通過(guò)削切處理，可制備出只含有前彈力層和基質(zhì)層的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，臨床使用前只需醫(yī)生根據(jù)患者創(chuàng)面大小和深度選擇對(duì)應(yīng)的規(guī)格型號(hào)，環(huán)鉆取得合適的直徑大小的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)即可使用。這樣，不僅操作簡(jiǎn)單，又能避免污染。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)一實(shí)施例的脫細(xì)胞處理前和脫細(xì)胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片對(duì)比圖，其中，IA為脫細(xì)胞處理前的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，IB為脫細(xì)胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖；
[0025]圖2為本發(fā)明的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)一實(shí)施例的脫細(xì)胞處理前和脫細(xì)胞處理后的透射電鏡照片對(duì)比圖，其中，2A為脫細(xì)胞處理前的透射電鏡照片圖，2B為脫細(xì)胞處理后的透射電鏡照片圖。
[0026]本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)、功能特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說(shuō)明?！揪唧w實(shí)施方式】
[0027]應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的【具體實(shí)施方式】為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的最佳實(shí)施方式，其僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，在第一實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法包括以下步驟:
[0029]A、將摘取的動(dòng)物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然后在恒溫振蕩器中以200rpm(轉(zhuǎn)/每分鐘)的轉(zhuǎn)速振蕩處理5h(小時(shí))，期間，每隔Ih換一次水，以使上皮層脫落。所述動(dòng)物包括豬、牛、羊等動(dòng)物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。在振蕩處理過(guò)程中，角膜基質(zhì)的膠原蛋白吸水蓬松，角膜逐漸吸水變厚，所述角膜基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞逐漸破裂，角膜上皮層逐漸脫落。在振蕩處理結(jié)束時(shí)，所述角膜呈飛碟狀，所述角膜上皮層全部脫落。
[0030]將水更換成濃度為0.02%。的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅病毒處理，靜置60min后倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
[0031]B、在裝有所述動(dòng)物角膜的試劑瓶?jī)?nèi)加入含有濃度為5mol/L的NaCl和5g/L的EDTA的脫細(xì)胞試劑，然后在恒溫振蕩器中以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩處理Ih后，將所述脫細(xì)胞試劑替換為所述水在恒溫振蕩器中以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩處理lh，如此這兩種溶液交替使用，共振蕩處理40h。
[0032]C、加入甘油所占體積比為90%的脫水劑，在25°C溫度下振蕩處理30min (分鐘)，得到脫細(xì)胞角膜。脫細(xì)胞處理后的角膜由于吸水，厚度變厚，故使用含有甘油的脫水劑脫去角膜中的水分，能使角膜厚度達(dá)到原始厚度。
[0033]使用濃度為2g/L碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細(xì)胞角膜lOmin。這樣，既可以降低角膜中甘油含量至合理范圍，又可以使角膜中含有一定水分。
[0034]D、將所述脫細(xì)胞角膜進(jìn)行削切，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)只含有iu彈力層和基質(zhì)層。
[0035]將得到的所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用用劑量為5KGy的鈷-60輻照滅菌。
[0036]通過(guò)脫細(xì)胞試劑和水的交替使用，反復(fù)改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質(zhì)中免疫原細(xì)胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。此外，通過(guò)削切處理，可制備出只含有前彈力層和基質(zhì)層的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，使得臨床使用前只需醫(yī)生根據(jù)患者創(chuàng)面大小和深度選擇對(duì)應(yīng)的規(guī)格型號(hào)，環(huán)鉆取得合適的直徑大小的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)即可使用。這樣，不僅操作簡(jiǎn)單，又能避免污染。
[0037]第二實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法包括以下步驟:
[0038]A、將摘取的動(dòng)物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然后在恒溫振蕩器中以150rpm(轉(zhuǎn)/每分鐘)的轉(zhuǎn)速振蕩處理IOh (小時(shí))，期間，每隔2h換一次水，以使上皮層脫落。所述動(dòng)物包括豬、牛、羊等動(dòng)物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。
[0039]將水更換成濃度為2%。的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅病毒處理，靜置IOmin后倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
[0040]B、在裝有所述動(dòng)物角膜的試劑瓶?jī)?nèi)加入含有濃度為2mol/L的NaCl和0.5g/L的EDTA的脫細(xì)胞試劑，然后在恒溫振蕩器中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速振蕩處理2h后，將所述脫細(xì)胞試劑替換為所述水在恒溫振蕩器中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速振蕩處理2h，如此這兩種溶液交替使用，共振蕩處理70h。
[0041]C、加入甘油所占體積比為50%的脫水劑，在2°C溫度下靜置處理60min (分鐘)，得到脫細(xì)胞角膜。
[0042]使用濃度為5g/L碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細(xì)胞角膜2min。
[0043]D、將所述脫細(xì)胞角膜進(jìn)行削切，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)只含有iu彈力層和基質(zhì)層。
[0044]將得到的所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用用劑量為25KGy的鈷-60輻照滅菌。
[0045]第三實(shí)施例中，在第二實(shí)施例的基礎(chǔ)上，采用以下參數(shù)進(jìn)行實(shí)施:
[0046]所述脫細(xì)胞試劑的pH值為7.0 ;所述脫細(xì)胞試劑和/或水的溫度為37°C。
[0047]第四實(shí)施例中，與第三實(shí)施例相比，所述脫細(xì)胞試劑的pH值為7.4 ;所述脫細(xì)胞試劑和/或水的溫度為2°C。
[0048] 本發(fā)明還提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，在第一實(shí)施例中，由前述制備方法制備得到的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)厚度為150 μ m，直徑為0.5mm。通過(guò)削切處理，可制備出只含有角膜前彈力層與基質(zhì)層的角膜。臨床使用前，無(wú)需醫(yī)生對(duì)材料進(jìn)行厚度的處理，醫(yī)生只需根據(jù)患者創(chuàng)面大小和深度選擇對(duì)應(yīng)的規(guī)格型號(hào)，環(huán)鉆取得合適的直徑大小的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)即可使用。這樣，不僅操作簡(jiǎn)單，又能避免污染。此外，由于該方法制備的所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)表面平整,創(chuàng)面能夠快速愈合。
[0049]在第二實(shí)施例中，由前述制備方法制備得到的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)厚度為550 μ m，直徑為1.2mm。
[0050]圖1至圖2，以豬角膜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用本發(fā)明提供的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0051]取依據(jù)上述制備方法所制得的豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行形態(tài)學(xué)HE染色觀察、超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察。
[0052]結(jié)果顯示:
[0053]圖1中，IA為脫細(xì)胞處理前的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，其中正常角膜具有完整的全層角膜上皮細(xì)胞和單層角膜內(nèi)皮細(xì)胞，角膜基質(zhì)內(nèi)存在大量基質(zhì)細(xì)胞為脫細(xì)胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，其中脫細(xì)胞處理后，角膜中未觀察到任何完整的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮層。
[0054]圖2中，2A為脫細(xì)胞處理前天然豬角膜的透射電鏡照片圖，2B為脫細(xì)胞處理后的透射電鏡照片圖，2B顯示脫細(xì)胞角膜中膠原纖維排列整齊，與圖2A對(duì)比觀察，脫細(xì)胞處理后的角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)與天然角膜膠原結(jié)構(gòu)一致，說(shuō)明脫細(xì)胞過(guò)程未對(duì)角膜膠原結(jié)構(gòu)造成破壞。[0055]本發(fā)明并不局限于以上實(shí)施方式，在上述實(shí)施方式公開的技術(shù)內(nèi)容下，還可以進(jìn)行各種變化。凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: A、將摘取的動(dòng)物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落； B、將水更換為脫細(xì)胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細(xì)胞試劑和水交替使用，以使基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞脫落； C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細(xì)胞角膜； D、將所述脫細(xì)胞角膜進(jìn)行削切，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)只含有前彈力層和基質(zhì)層； 其中，所述脫細(xì)胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。
2.如權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞試劑為:濃度為2~5mol/L的NaCl溶液與濃度為0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
3.如權(quán)利要求2所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞試劑的PH值為7.0~7.4 ;所述脫細(xì)胞試劑和/或水的溫度為2~37°C。
4.如權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述A步驟的振蕩時(shí)間為5~10h，期間，每隔I~2h更換一次水；所述B步驟的振蕩時(shí)間為40~70h，期間，每隔I~2h交替更換一次脫細(xì)胞試劑或水。
5.如權(quán)利要求1所述的 脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述脫水劑中甘油的體積比為50~90%。
6.如權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，在所述C步驟之后、D步驟之前還包括以下步驟: X、使用濃度為2~5g/L碳酸氫鈉溶液清洗所述動(dòng)物角膜2~lOmin。
7.如權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，在所述A步驟之后、B步驟之前還包括以下步驟: Y、將水更換成濃度為0.02~2%。的次氯酸鈉溶液，靜置10~60min。
8.如權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，其特征在于，在所述D步驟之后，還包括以下步驟: Z、將所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用鈷-60輻照。
9.一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征在于，由權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。
10.如權(quán)利要求9所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征在于，所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的厚度為.150 ~550 μ m，直徑為 0.5 ~1.2mm。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK104001215SQ201410264542
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】王維博, 張斌 申請(qǐng)人:深圳艾尼爾角膜工程有限公司