滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了滅活肺炎克雷伯菌在在作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中新的用途，滅活肺炎克雷伯菌菌液作為免疫成分，具有免疫增強(qiáng)劑作用，既可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)肺炎克雷伯菌的抗體使機(jī)體免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫調(diào)節(jié)活性提高機(jī)體對(duì)疫苗應(yīng)答水平，產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)。
【專利說明】滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中的應(yīng)用，用于提 高動(dòng)物滅活疫苗的免疫效果，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌具有豐厚莢膜，其莢膜物質(zhì)具有極強(qiáng)的免疫原性，法國羅素公司 已將其開發(fā)成口服免疫調(diào)節(jié)劑。
[0003] 大量實(shí)驗(yàn)證明，肺炎克雷伯菌莢膜糖蛋白能加速B淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì) 胞的吞噬、消化、破壞抗原及其趨化作用，并能促進(jìn)吞噬細(xì)胞白介素的產(chǎn)生，從而使T淋巴 細(xì)胞增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還證明肺炎克雷伯菌莢膜糖蛋白對(duì)細(xì)菌(綠膿桿菌、金葡菌、大腸桿菌、 肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌)、病毒(流感病毒、引起腦和心肌炎病變的病毒）和真 菌（白色念珠菌）的感染均具明顯的保護(hù)作用。
[0004] 在充分的理論研究基礎(chǔ)上，法國羅素公司將其開發(fā)成新型免疫調(diào)節(jié)劑一必思添， 臨床上用于呼吸道感染的防治，并可用于潰瘍和燒傷的治療。國外關(guān)于肺炎克雷伯菌莢膜 糖蛋白的研究開展較早，主要集中在二十世紀(jì)70-80年代，報(bào)道最多的是有關(guān)肺炎克雷伯 菌莢膜糖蛋白免疫學(xué)活性方面的研究。
[0005] 據(jù)報(bào)道Kp莢膜多糖（CPS-K)對(duì)強(qiáng)抗原和弱抗原均有明顯的佐劑作用。在相同 條件下，其作用強(qiáng)于胞壁酞膚(MDP)，與A1 (0Η) 3和脂質(zhì)體相似，從而證明CPS-K具有免疫增 強(qiáng)劑的作用。有關(guān)Kp莢膜多糖的免疫原性和作為獨(dú)立的免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)的研究已經(jīng)有 報(bào)道。
[0006] 目前常用的疫苗佐劑，例如鋁膠佐劑、油佐劑等，由于局部刺激強(qiáng)烈、誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答差等諸多缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。因此開發(fā)新一代高效、低毒、廉價(jià)的疫苗佐劑十分迫切。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中的用途，提供了 滅活肺炎克雷伯菌的新用途，配以滅活疫苗預(yù)防動(dòng)物疾病，預(yù)防免疫效果佳，安全性好。
[0008] 本發(fā)明提供滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分別按培養(yǎng)基體積的2%接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整菌數(shù)為100 億CFU/mL ;500mL擋板瓶裝液量16%，搖床轉(zhuǎn)速在150r/min，37°C，增氧震蕩培養(yǎng)8h ; 2) 用終濃度0. 3%的甲醛滅活步驟1所得肺炎克雷伯菌培養(yǎng)物，24°C滅活72h，期間振 搖5-8次； 3) 將肺炎克雷伯菌滅活培養(yǎng)物與動(dòng)物滅活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步驟3所得培養(yǎng)物中添加防腐劑，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐劑的滅活疫 苗；所述防腐劑為疊氮鈉，優(yōu)選終質(zhì)量濃度為〇. 01 %。
[0009] 本發(fā)明所述肺炎克雷伯菌菌株26混合制成的滅活疫苗，其制備工藝簡單，適合商 品化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0010] 本發(fā)明的積極效果在于：公開了滅活肺炎克雷伯菌在在作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活 疫苗中新的用途，滅活肺炎克雷伯菌菌液作為免疫成分，具有免疫增強(qiáng)劑作用，既可以誘導(dǎo) 機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)肺炎克雷伯菌的抗體使機(jī)體免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫調(diào)節(jié)活性提 高機(jī)體對(duì)疫苗應(yīng)答水平，產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為肺炎克雷伯菌菌株26的形態(tài)； 圖2為肺炎克雷伯菌作為佐劑在水貂綠膿桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用； 圖3為肺炎克雷伯菌作為佐劑在雞大腸桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用； 圖4為肺炎克雷伯菌作為佐劑在水貂病毒性腸炎滅活疫苗中的應(yīng)用； 圖5為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)； 圖6為淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明涉及的肺炎克雷伯菌菌株26,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所(參見圖 1)。
[0014] 用Reed-Muench法測定毒株對(duì)小白鼠的半數(shù)致死量LD5(I，菌株26對(duì)水貂的半數(shù)致 死量 LD5Q 為 8X106CFU。
[0015] 試驗(yàn)材料 發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L):蔗糖40,胰蛋白胨20,酵母粉1，K2S04 1，MgS04 0. 25, ΚΗ2Ρ04 4， Na2HP04 3,121°C 滅菌 20min。
[0016] 綠膿桿菌分型用標(biāo)準(zhǔn)血清購自日本生研株式會(huì)社；肺炎克雷伯菌的分型采用PCR 分型方法進(jìn)行；細(xì)菌鑒定微量生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑公司；18~22g小白鼠購 自吉林正業(yè)生物制品有限公司；甲醛，疊氮鈉購自北京化學(xué)試劑廠。
[0017] 實(shí)施例1 : 滅活免疫佐劑的制備 免疫佐劑制備：將菌株菌株26劃線接種于培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)18h，之后挑單菌落接 種于5mlNB肉湯培養(yǎng)基中37°C振搖12h作為一代種子液，再按1 %比例接種于300mlNB肉 湯中37°C振搖12h作為二代種子液，將二代種子液按2%比例接種于500mL的發(fā)酵液體培 養(yǎng)基37°C增氧培養(yǎng)8h，即為培養(yǎng)好的疫苗菌液，通過細(xì)菌平板計(jì)數(shù)對(duì)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通 過計(jì)數(shù)結(jié)果將菌數(shù)均調(diào)整為1〇〇億CFU/mL，之后將菌液按甲醛終濃度為0. 3%滅活，24°C滅 活72h，期間震蕩5-8次。將滅活后的肺炎克雷伯菌，按照1 :9的比例與滅活疫苗混合。
[0018] 免疫佐劑的滅活檢驗(yàn)：將甲醛滅活后的菌液取200μ L接于5mL液體培養(yǎng)基中，一 次培養(yǎng)取3次樣，每個(gè)樣品接種于3個(gè)試管中觀察5天進(jìn)行滅活安全檢驗(yàn)，5天后接種的液 體培養(yǎng)基仍澄清無混濁則安全檢驗(yàn)合格。
[0019] 實(shí)施例2: 滅活肺炎克雷伯菌的安全檢驗(yàn) 將實(shí)施例1制備好的三批佐劑單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量注射健康小鼠，后肢內(nèi)側(cè) 肌肉接種。通過14d觀察，接種小鼠體溫和食欲正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部 和全身反應(yīng)；每批選擇3只，剖殺后切開注射部位皮膚觀察注射局部病理變化，小鼠接種部 位皮下無異常變化，后肢內(nèi)側(cè)肌肉接種部位肌肉組織正常，注射部位未見炎癥反應(yīng)。說明對(duì) 小鼠具有較好的安全性。
[0020] 實(shí)施例3 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對(duì)水貂肺炎滅活疫苗的效力試驗(yàn)測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與水貂出血性肺炎滅活疫 苗混合后免疫45日齡斷奶仔貂20只，lml/只，免疫后用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的間接ELISA方法 連續(xù)檢測10周抗體的水平，繪制抗體消長規(guī)律(參見圖2所示)。
[0021] 實(shí)施例4: 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對(duì)雞大腸桿菌滅活疫苗的效力試驗(yàn)測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與雞大腸桿菌滅活疫苗混 合后免疫30日齡雛雞20只，lml/只，免疫后用間接ELISA方法連續(xù)檢測10周抗體的水平， 繪制抗體消長規(guī)律(參見圖3所示)。
[0022] 實(shí)施例5 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對(duì)水貂病毒性腸炎滅活疫苗的效力試驗(yàn)測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與水貂病毒性腸炎滅活疫 苗混合后免疫45日齡斷奶仔貂20只，lml/只，免疫后用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的血凝抑制試驗(yàn)連 續(xù)檢測10周抗體的水平，繪制抗體消長規(guī)律(參見圖4所示)。
[0023] 實(shí)施例6 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對(duì)小鼠非特異性免疫增強(qiáng)作用測定 進(jìn)行免疫相關(guān)指標(biāo)測定，包括小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)， 如圖5、6所示(注：PP.巨噬細(xì)胞吞噬率PI.巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)Vaccine.肺炎克雷伯菌佐劑 腸炎疫苗Control.鋁膠佐劑腸炎疫苗）；將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按 照1:9比例與水貂病毒性腸炎滅活疫苗混合后免疫16~18g小白鼠20只，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 各10只，0. 2ml/只。免疫一周后采用常規(guī)方法測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)， 使用MTT法測定淋巴細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)。 本發(fā)明公開了肺炎克雷伯菌菌株26及用所述菌株制備的動(dòng)物滅活疫苗及其制備方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā) 明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng) 用本發(fā)明技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1. 滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動(dòng)物滅活疫苗中的用途。
2. -種滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分別按培養(yǎng)基體積的2%接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整菌數(shù)為100 億CFU/mL ;500mL擋板瓶裝液量16%，搖床轉(zhuǎn)速在150r/min，37°C，增氧震蕩培養(yǎng)8h ; 2) 用終濃度0. 3%的甲醛滅活步驟1)所得肺炎克雷伯菌培養(yǎng)物，24°C滅活72h，期間振 搖5-8次； 3) 將肺炎克雷伯菌滅活培養(yǎng)物與動(dòng)物滅活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步驟3)所得培養(yǎng)物中添加防腐劑，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐劑的滅活疫 苗；所述防腐劑為疊氮鈉，優(yōu)選終質(zhì)量濃度為〇. 01%。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK104043122SQ201410280086
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】雷連成, 閆新武, 欒浩麟, 趙成新, 王金玲 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)