具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于納米復(fù)合材料領(lǐng)域，公開(kāi)了一種具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，以納米四氧化三鐵為核，使用二氧化硅包裹，由異硫氰酸熒光素標(biāo)記，通過(guò)表面修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷使其氨基化，然后通過(guò)羧氨交聯(lián)接枝乳糖酸，最后通過(guò)活化羧基與前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體(PSCA)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作方便，得到的納米顆粒具有主動(dòng)靶向，生物相容性好，毒副作用小，單分散性與穩(wěn)定性好，磁性與熒光性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001 ] 本發(fā)明涉及具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]Fe304納米顆粒是一種典型的磁性材料，由于Fe304納米粒子兼有納米粒子的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)以及磁性材料特有的磁響應(yīng)性，使得它具有常規(guī)粒子所不具備的特殊性能:(l)Fe304納米粒子具有優(yōu)良的磁敏感性。磁性Fe304納米粒子具有很強(qiáng)的磁性，可以在很弱的外加磁場(chǎng)中獲得很強(qiáng)的磁感應(yīng)，并且能夠定向移動(dòng)；(2)在一定尺寸分布范圍內(nèi)具有超順磁性。當(dāng)磁性納米粒子的粒徑小于16nm時(shí),其各向異性減小到可以與熱運(yùn)動(dòng)能相比擬，易磁化方向呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律的變化，于是便產(chǎn)生了超順磁性；(3)在外加交變電磁場(chǎng)的作用下能產(chǎn)生熱量等。磁性Fe304納米粒子在交變磁場(chǎng)的誘導(dǎo)下，可以產(chǎn)生高溫、高熱。
[0003]Fe304納米粒子具有優(yōu)異的磁性 能和良好的生物相容性，在細(xì)胞分離、靶向給藥、癌癥熱療、磁共振成像等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，是當(dāng)今納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。磁性Fe304納米粒子由于兼有納米級(jí)材料的量子尺寸效應(yīng)和磁性材料的磁偶極子引力作用，使得磁性納米粒子團(tuán)聚嚴(yán)重、化學(xué)穩(wěn)定性差、易氧化、表面羥基不足，這些缺點(diǎn)直接限制了 Fe304納米粒子的應(yīng)用。而通過(guò)表面修飾,不但可以改善Fe304納米粒子在溶液中的分散性能和穩(wěn)定性，還可以調(diào)節(jié)納米粒子與其他物質(zhì)的相容性和反應(yīng)特性。經(jīng)過(guò)修飾的磁性納米粒子必須具有以下幾個(gè)特點(diǎn)，才可以用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域:(1)親水性，磁性納米粒子表面的疏水基團(tuán)必須被替換為親水基團(tuán)，否則在生物體內(nèi)會(huì)嚴(yán)重團(tuán)聚，同時(shí)這也是對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行紀(jì)向改性的第一步；(2)生物相容性，納米粒子本身必須具有良好的生物相容性，這樣才不會(huì)被生物體的免疫系統(tǒng)識(shí)別為有害物質(zhì)而遭到排除；(3)毒性，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的磁性納米粒子必須是無(wú)毒或者低毒的，這樣才不會(huì)對(duì)病人造成傷害；(4)形狀，有研究表明，形狀不規(guī)則例如棒狀、孺蟲(chóng)狀的納米粒子較之球形納米粒子更不容易被生物體的免疫系統(tǒng)識(shí)別為抗原。提高納米粒子的長(zhǎng)寬比例可以顯著優(yōu)化納米材料在血液中的長(zhǎng)程循環(huán)性能。類(lèi)似的，高縱橫比的磁性納米粒子較之球形的磁性納米粒子也具有更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。這些結(jié)果表明，研究者們需要進(jìn)一步確定何種長(zhǎng)寬比例對(duì)磁性納米粒子的藥代動(dòng)力學(xué)影響最大。(5)表面電荷，不同的電荷會(huì)影響磁性納米粒子與某些蛋白質(zhì)或細(xì)胞的結(jié)合；
(6)磁性，磁性納米粒子應(yīng)當(dāng)可以輕易地被外加磁場(chǎng)操縱。所以選擇理想的包覆材料，也是重要的研究。
[0004]介孔二氧化硅材料因具有大比表面積、高孔容、均勻可調(diào)的孔徑、無(wú)毒性、良好的化學(xué)穩(wěn)定性、易修飾等獨(dú)特的組織和結(jié)構(gòu)性能而成為一種理想的包覆材料。Fe304@Si02復(fù)合納米粒子,兼有Fe304納米粒子獨(dú)特的磁性能和Si02納米粒子生物相容性好、易表面修飾的優(yōu)點(diǎn)。用二氧化娃對(duì)Fe304納米粒子包覆,不但可以提高磁性納米粒子的抗氧化能力和在液體介質(zhì)中的分散性能，而且由于Si02納米粒子表面極易功能化，可以容易地實(shí)現(xiàn)與各種有機(jī)分子和生物分子的鏈接，為進(jìn)一步的表面修飾和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。[0005]眾所周知，熒光標(biāo)記是監(jiān)測(cè)活體中藥物傳輸路線的一種實(shí)時(shí)、簡(jiǎn)單且有效的方法。因此，光功能化介孔二氧化硅藥物緩釋體系具有識(shí)別、跟蹤和監(jiān)測(cè)藥物釋放效率和疾病診療效果的能力，已經(jīng)逐漸成為藥物緩釋領(lǐng)域另一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前，用于合成復(fù)合材料的熒光粉主要包括有機(jī)染料、量子點(diǎn)和稀土熒光粉。有機(jī)染料，例如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、羅丹明(RITC)等，是一種傳統(tǒng)的熒光材料。最大的缺點(diǎn)是容易發(fā)生光漂白和光淬滅，不適合敏感檢測(cè)和實(shí)時(shí)跟蹤。然而有機(jī)染料摻雜的二氧化硅復(fù)合材料的設(shè)計(jì)合成不但克服了有機(jī)染料的上述弊端，而且熒光強(qiáng)度比對(duì)應(yīng)的單個(gè)染料分子明顯增強(qiáng)。
[0006]目前，光磁功能化介孔二氧化硅材料的研究主要包括以下三個(gè)方面:(1)氧化鐵和有機(jī)染料功能化的介孔二氧化硅/無(wú)孔二氧化硅復(fù)合材料；(2)氧化鐵和量子點(diǎn)功能化的介孔二氧化硅/無(wú)孔二氧化硅復(fù)合材料；(3)氧化鐵和稀土熒光粉功能化的無(wú)孔二氧化硅復(fù)合材料；多功能介孔二氧化硅復(fù)合材料既可以用于靶向給藥系統(tǒng)又可以用于成像和光熱治療，而多功能無(wú)孔二氧化硅復(fù)合材料則很難被用作藥物緩釋載體。
[0007]很多專(zhuān)利都涉及關(guān)于多功能介孔二氧化硅的制備及應(yīng)用。如:中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“基于熒光介孔二氧化硅蛋黃-蛋殼納米膠囊的制備”
[0008](CN 102350281 A)公開(kāi)了一種以熒光介孔二氧化硅為蛋殼，磁性納米材料為蛋黃的納米膠囊:中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“一種多功能納米顆粒及其制備”(CN 103566381 A)公開(kāi)了一種磁性納米顆粒的制備，并在二氧化硅的表面修飾了親水基團(tuán)與靶向試劑；中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“一種多功能腫瘤成像劑制備方法與應(yīng)用”(CN 102614532 A)公開(kāi)了一種通過(guò)微乳液方法制備包裹熒光染料和磁性納米顆粒為核二氧化硅為殼的納米顆粒，表面修飾了多肽；中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“多功能的偏心介孔二氧化硅納米粒子的制備方法”(CN103211767A)公開(kāi)了一種將聚丙烯酸連接在氨基修飾過(guò)的二氧化硅表面，并將其作為載體構(gòu)建了一個(gè)PH響應(yīng)的控制藥物傳輸系統(tǒng)；中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“多功能核殼結(jié)構(gòu)藥物載體及其制備”(CN 101670107 A)公開(kāi)了一種通過(guò)溶膠-凝膠制備雙層二氧化過(guò)包裹四氧化三鐵，最后加熒光沖國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)“多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球及其制備方法”(CN 102120168 A)公開(kāi)了一種通過(guò)調(diào)節(jié)兩種熒光素的不同配比達(dá)到制備多種熒光編碼磁性微球。而關(guān)于通過(guò)以納米四氧化三鐵為核，使用二氧化硅包裹，由異硫氰酸熒光素標(biāo)記，通過(guò)表面修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷使其氨基化，然后通過(guò)羧氨交聯(lián)接枝乳糖酸，最后通過(guò)活化羧基與前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體(PSCA)，得到主動(dòng)靶向功能的雙模態(tài)介孔硅納米粒子實(shí)現(xiàn)方法的專(zhuān)利，還沒(méi)有類(lèi)似的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，以納米四氧化三鐵為核，使用二氧化硅包裹，由異硫氰酸熒光素標(biāo)記，通過(guò)表面修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷使其氨基化，然后通過(guò)羧氨交聯(lián)接枝乳糖酸，最后通過(guò)活化羧基與前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體(PSCA)，該方法簡(jiǎn)單，操作方便，得到的納米顆粒具有主動(dòng)靶向，生物相容性好，毒副作用小，單分散性與穩(wěn)定性好，磁性與熒光性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0010]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法:首先制備異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，再以氨水作為催化劑，在四氧化三鐵納米溶液中，加入四乙氧基硅烷和異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，反應(yīng)得到具有雙功能團(tuán)的介孔二氧化硅納米顆粒，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾氨基，進(jìn)而為納米顆粒修飾乳糖酸提供功能基團(tuán)，交聯(lián)乳糖酸以后，利用碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺與乳糖酸的羧基形成半穩(wěn)定的氨活性NHS酯，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到主動(dòng)祀向功能的雙模態(tài)介孔娃納米粒子。
[0011]進(jìn)一步的，所述光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法具體包括以下步驟:
[0012](1)將0.01g~1g0.01mmol~1mmol的異硫氰酸突光素和0.1Og~1g0.1mmol~1mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到1ml~10ml的乙醇中，在10°C~60°C下,避光通氮?dú)?.1mol~5mol反應(yīng)1h~28h,得到異硫氰酸突光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，記做FITC-APTES ；
[0013](2)將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液0.1ml~1ml0.001 g/ml~1g/ml分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min,加入氨水0.1ml~1ml,濃度為0.lmol/1~20mol/l作為催化劑，在10°C~6CTC下,劇烈攬拌1min~6.5h,攪拌速度為60r/s，加入0.01ml~5ml的四乙氧基硅烷，在10°C~60°C下，反應(yīng)2h~24h，加入步驟(1)合成的異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷0.1ml~20ml，繼續(xù)攪拌2h~24h,在Ih~1h內(nèi)逐滴加入0.01ml~1ml的四乙氧基硅烷,避光劇烈攪拌Ih~10h，攪拌速度為60r/s，得到雙功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存；
[0014](3)將0.01g~1g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min使其充分溶解，在30min~5h內(nèi)逐滴加完0.1ml~20ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，50°C~240V下，劇烈攪拌Ih~24h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次；
[0015](4)取0.1ml~1ml lmg/ml~10mg/ml的含半乳糖基的乳糖酸分子,在冰水浴下向其中加入0.1ml~1ml0.lmg/ml~10mg/ml的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0.1mL~1ml0.lmg/ml~10mg/ml N-羥基丁二酰亞胺，超聲反應(yīng)20min~2h,使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液混合，持續(xù)攪拌Ih~19h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ；
[0016](5)將0.1Omg~1mg碳二亞胺鹽酸鹽和0.01mg~20mg N-羥基硫代琥拍酰亞胺，混合在Iml~1ml的2-嗎啉乙磺酸緩沖液中，緩沖液濃度為0.01mol/l~10mol/l，pH為4~9.5，最后加入1ml~50ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在10°C~60°C避光攪拌20h~40h,攪拌速度60r/s ;碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥拍酰亞胺與乳糖酸的羧基形成半穩(wěn)定的氨活性NHS酯，透析分離后加入到pH為4~8.5，濃度為0.001mol/l~1mol/I的Iml~50ml的磷酸鹽緩沖液中，再加入0.1 μ I~100 μ I的10 μ g/ml~100 μ g/ml的前列腺干細(xì)胞抗原，在10°C~60°C避光反應(yīng)4h~22h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0017]進(jìn)一步的，所制備的異硫氰酸熒光素修飾的氨丙基三乙氧基硅烷保存在4°C下。[0018]進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，逐滴滴加四乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在Ih~1h滴加完。
[0019]進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，乙醇和水的混合液中乙醇和水的體積比為5:2。
[0020]進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在30min~5h滴加完。
[0021]進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，乙醇和水的混合液中乙醇和水的體積比為5:1。
[0022]進(jìn)一步的，所述步驟(4)中，冰水浴的的溫度為零攝氏度；
[0023]進(jìn)一步的，所述步驟(4)中，活化的乳糖酸溶液和步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液 的混合比例為1:3。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025]1、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，快速，操作方便，重復(fù)性好，具有通用型，實(shí)驗(yàn)條件易實(shí)現(xiàn)；
[0026]2、本發(fā)明得到的納米顆粒分散性好，穩(wěn)定性好，介孔可裝載需要的藥物；
[0027]3、本發(fā)明的納米顆粒具有多種功能，既具備了磁性納米顆粒的功能，又具備熒光探針的功能；
[0028]4、本發(fā)明得到的納米顆粒具有很好的生物相容性，無(wú)生物毒性；
[0029]5、本發(fā)明納米顆粒的表面修飾了 APTES，具有豐富的氨基，有利于再修飾，并可廣泛應(yīng)用于生物載藥；
[0030]6、本發(fā)明個(gè)步驟條件簡(jiǎn)單，溫和，自然環(huán)保。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0031]圖1為本發(fā)明制備前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的過(guò)程原理圖。
[0032]圖2為前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的透射電鏡圖。
[0033]圖3為前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的在體磁共振成像圖，圖中A-第一天，B-第二天，C-第三天，D-第四天，E-第五天。
[0034]圖4為前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的熒光光譜圖。
[0035]圖5為前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的熒光顯微圖像。
【具體實(shí)施方式】:
[0036]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0037]如圖1所示，本法明為具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0038](I)將0.01g~1g0.01mmol~1mmol的異硫氛酸突光素和0.1Og~1g0.1mmol~1mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到1ml~10ml的乙醇中，在10°C~60°C下,避光通氮?dú)?.1mol~5mol反應(yīng)1h~28h,得到異硫氰酸突光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，記做FITC-APTES ；
[0039](2)將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液0.1ml~1ml0.001g/ml~1g/ml分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min,加入氨水0.1ml~1ml,濃度為0.lmol/1~20mol/l作為催化劑，在10°C~6CTC下,劇烈攬拌1min~6.5h,攪拌速度為60r/s，加入0.01ml~5ml的四乙氧基硅烷，在10°C~60°C下，反應(yīng)2h~24h，加入步驟(1)合成的異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷0.1ml~20ml，繼續(xù)攪拌2h~24h,在Ih~1h內(nèi)逐滴加入0.01ml~1ml的四乙氧基硅烷,避光劇烈攪拌Ih~10h，攪拌速度為60r/s，得到雙功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存；
[0040](3)將0.01g~1g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min使其充分溶解，在30min~5h內(nèi)逐滴加完0.1ml~20ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，50°C~240°C下，劇烈攪拌Ih~24h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次；
[0041](4)取0.1ml~10mllmg/ml~10mg/ml的含半乳糖基的乳糖酸分子,在冰水浴下向其中加入0.1ml~1ml0.lmg/ml~10mg/ml的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0.1mL~1ml0.lmg/ml~10mg/ml N-羥基丁二酰亞胺，超聲反應(yīng)20min~2h,使乳糖酸的羧酸基團(tuán) 活化，然后將活化的乳糖酸溶液與步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液混合，持續(xù)攪拌Ih~19h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ；
[0042](5)將0.1Omg~1mg碳二亞胺鹽酸鹽和0.01mg~20mg N-羥基硫代琥拍酰亞胺，混合在Iml~1ml的2-嗎啉乙磺酸緩沖液中，緩沖液濃度為0.01mol/l~10mol/l，pH為4~9.5，最后加入1ml~50ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在10°C~60°C避光攪拌20h~40h,攪拌速度60r/s ;碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥拍酰亞胺與乳糖酸的羧基形成半穩(wěn)定的氨活性NHS酯，透析分離后加入到pH為4~8.5，濃度為0.001mol/l~1mol/I的Iml~50ml的磷酸鹽緩沖液中，再加入0.1 μ I~100 μ I的10 μ g/ml~100 μ g/ml的前列腺干細(xì)胞抗原，在10°C~60°C避光反應(yīng)4h~22h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0043]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，上述所制備的異硫氰酸熒光素修飾的氨丙基三乙氧基硅烷應(yīng)保存在四攝氏度下。
[0044]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(2)中，逐滴滴加四乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在Ih~10滴加完。
[0045]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(2)中，乙醇和水混合液的體積比為5:2。
[0046]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(3)中，逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在30min~5h滴加完。
[0047]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(3)中，乙醇和水混合液的體積比為5:1。[0048]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(4)中，冰水浴的的溫度為零攝氏度；
[0049]作為本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式，步驟(4)中，活化的乳糖酸溶液和步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液的混合比例為1:3。
[0050]為了簡(jiǎn)便，下述化合物使用英文簡(jiǎn)稱(chēng):
[0051]1、異硫氰酸熒光素:FITC ;2、3-氨丙基三乙氧基硅烷=APTES ;3、四乙氧基硅烷:TEOS ;4、異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷:FITC-APTES ;5、乳糖酸:LA ;6、
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺:EDC;7、N-羥基丁二酰亞胺:NHS ;8、光磁多功能介孔硅=FMNPs ;9、碳二亞胺鹽酸鹽:EDAC ;10、N-羥基硫代琥珀酰亞胺:Sulfo_NHS ;11、
2-嗎啉乙磺酸:MES;12、前列腺干細(xì)胞抗原:PSCA。
[0052]實(shí)施例1
[0053]將0.01g0.01mmol 的 FITC 和 0.1Og0.1mmol 的 APTES 加入到 1ml 的乙醇中，在10°C下，避光通氮?dú)?.1mol,反應(yīng)10h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液0.1ml0.001 g/ml分散在1ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2，超聲20min,加入0.lmol/1的氨水0.1ml作為催化劑,在10°C下，劇烈攪拌1min,攪拌速度60r/s，加入0.01ml的TE0S，在I (TC下，反應(yīng)2h，加入FITC-APTES0.1ml，繼續(xù)攪2h，在Ih內(nèi)逐滴加完0.01ml的TE0S，避光劇烈攪拌10h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用Iml的水做第一次離心洗滌，Iml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將0.01g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在1ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲20min使其充分溶解，在30min內(nèi)逐滴加完0.1ml的APTES，在50°C下，劇烈攪拌lh，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用Iml的水做第一次離心洗滌，Iml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml的水做第三次離心洗滌三次。取0.1mllmg/ml的LA，在冰水浴下向其中加入0.1ml0.lmg/ml的EDC和0.1mL0.lmg/ml NHS，超聲反應(yīng)20min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌lh，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將0.1Omg的EDAC和0.01mg的Sulfo-NHS，混合在Iml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為0.01mol/l, pH為4，最后加入1ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在10°C避光攪拌20h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到Iml的pH為4濃度為
0.0Olmol/1磷酸鹽緩沖液中，再加入0.1μ I的10 μ g/ml的PSCA，在I (TC避光反應(yīng)4h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0054]實(shí)施例2
[0055]將0.1g0.1mmol 的 FITC 和 0.20g0.5mmol 的 APTES 加入到 20ml 的乙醇中，在 20°C下，避光通氮?dú)?.5mol,反應(yīng)12h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液0.2ml0.0I g/ml分散在20ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2，超聲30min，加入lmol/1的氨水0.5ml作為催化劑，在20°C下，劇烈攪拌30min,攪拌速度60r/s,加入0.1ml的TE0S，在20°C下，反應(yīng)5h，加入FITC-APTES0.5ml，繼續(xù)攪5h，在2h內(nèi)逐滴加完0.1ml的TE0S，避光劇烈攪拌12h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用2ml的水做第一次離心洗滌，2ml的乙醇做第二次離心洗滌，2ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將0.1g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在20ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲30min使其充分溶解，在60min內(nèi)逐滴加完0.5ml的APTES，在80°C下，劇烈攪拌3h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用2ml的水做第一次離心洗滌，2ml的乙醇做第二次離心洗滌，2ml的水做第三次離心洗滌三次。取lml2mg/ml的LA，在冰水浴下向其中加入1ml lmg/ml的EDC和0.5mLlmg/ml NHS,超聲反應(yīng)30min,使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌3h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將Img的EDAC和0.1mg的Sulfo-NHS，混合在2ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為0.lmol/l，pH為5，最后加入5ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在20°C避光攪拌24h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到5ml的pH為4.5濃度為0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入I μ I的20 μ g/ml的PSCA，在20°C避光反應(yīng)6h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0056]實(shí)施例3
[0057]將Iglmmol的FITC和lg2mmol的APTES加入到30ml的乙醇中，在25 °C下，避光通氮?dú)鈒mol，反應(yīng)14h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液
0.5ml0.1 g/ml分散在30ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲40min,加3mol/l的氨水Iml作為催化劑，在25°C下，劇烈攪拌50min，攪拌速度60r/s，加入0.5ml的TEOS，在25°C下，反應(yīng)7h，加入FITC-APTESlml，繼續(xù)攪8h，在3h內(nèi)逐滴加完Iml的TE0S，避光劇烈攪拌14h,攪拌速度60r/s,得到功能團(tuán)的納米顆粒,記做FMNPs,用3ml的水做第一次離心洗滌，3ml的乙醇做第二次離心 洗滌，3ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將Ig的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在30ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲40min使其充分溶解，在90min內(nèi)逐滴加完Iml的APTES，在100°C下，劇烈攪拌5h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用3ml的水做第一次離心洗滌，3ml的乙醇做第二次離心洗滌，3ml的水做第三次離心洗漆三次。取2ml3mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入2ml2mg/ml的EDC和lmL2mg/ml NHS，超聲反應(yīng)40min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌5h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將2mg的EDAC和Img的Sulfo-NHS，混合在3ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為lmol/1，pH為6，最后加入1ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在25 °C避光攪拌26h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入1ml的pH為5濃度為0.lmol/Ι的磷酸鹽緩沖液中，再加入10 μ I的30 μ g/ml的PSCA，在25°C避光反應(yīng)8h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0058]實(shí)施例4
[0059]將2g2mmol的FITC和2g3mmol的APTES加入到40ml的乙醇中，在30°C下，避光通氮?dú)?.5mol,反應(yīng)16h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液Imllg/ml分散在40ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5: 2，超聲50min,加入5mol/l的氨水2ml作為催化劑，在30°C下，劇烈攪拌70min，攪拌速度60r/s，加入1ml的TE0S，在30°C下，反應(yīng)9h，加入FITC-APTES5ml，繼續(xù)攪llh，在4h內(nèi)逐滴加完2ml的TE0S，避光劇烈攪拌16h,攪拌速度60r/s,得到功能團(tuán)的納米顆粒,記做FMNPs,用4ml的水做第一次離心洗滌，4ml的乙醇做第二次離心洗滌，4ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將2g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在40ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲50min使其充分溶解，在2h內(nèi)逐滴加完3ml的APTES，在120°C下，劇烈攪拌7h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用4ml的水做第一次離心洗滌，4ml的乙醇做第二次離心洗滌，4ml的水做第三次離心洗漆三次。取3ml4mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入3ml3mg/ml的EDC和3mL3mg/ml NHS，超聲反應(yīng)50min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為，1: 3，持續(xù)攪拌7h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將3mg的EDAC和3mg的Sulfo-NHS,混合在4ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為2mol/l，pH為6.5，最后加入15ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在30°C避光攪拌28h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入15ml的pH為5.5濃度為lmol/Ι的磷酸鹽緩沖液中，再加入20 μ I的40 μ g/ml的PSCA，在30°C避光反應(yīng)10h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0060]實(shí)施例5
[0061]將3g3mmol的FITC和3.5g4mmol的APTES加入到50ml的乙醇中，在35°C下，避光通氮?dú)?mol，反應(yīng)18h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液3ml2g/ml分散在50ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲60min,加入7mol/l的氨水3ml作為催化劑，在35°C下，劇烈攪拌90min，攪拌速度60r/s，加入1.5ml的TE0S，在35°C下，反應(yīng)llh，加入FITC-APTES7ml，繼續(xù)攪14h，在5h內(nèi)逐滴加完3ml的TE0S，避光劇烈攪拌18h,攪拌速度60r/s,得到功能團(tuán)的納米顆粒,記做FMNPs,用5ml的水做第一次離心洗滌，5ml的乙醇做第二次離心洗滌，5ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將3g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMN Ps分散在50ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲60min使其充分溶解，在2.5h內(nèi)逐滴加完5ml的APTES，在140°C下，劇烈攪拌9h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用5ml的水做第一次離心洗滌，5ml的乙醇做第二次離心洗滌，5ml的水做第三次離心洗漆三次。取4ml5mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入4ml4mg/ml的EDC和4mL4mg/ml NHS，超聲反應(yīng)60min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌9h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將4mg的EDAC和5mg的SuIfo-NHS，混合在5ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為3mol/l，pH為7，最后加入20ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在35°C避光攪拌30h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到20ml的pH為6濃度為2mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入30 μ I的50 μ g/ml的PSCA,在35°C避光反應(yīng)12h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0062]實(shí)施例6
[0063]將4g4mmo1的FITC和5g5mmol的APTES加入到60ml的乙醇中，在40°C下，避光通氮?dú)?.5mol,反應(yīng)20h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液5ml3g/ml分散在70ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲70min,加入9mol/l的氨水5ml作為催化劑，在40°C下，劇烈攪拌llOmin，攪拌速度60r/s，加入2ml的TEOS，在40°C下，反應(yīng)13h，加入FITC-APTES9ml，繼續(xù)攪17h，在6h內(nèi)逐滴加完4ml的TEOS，避光劇烈攪拌20h，攪拌速度是60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用6ml的水做第一次離心洗滌，6ml的乙醇做第二次離心洗滌，6ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將4g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在70ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲70min使其充分溶解，在3h內(nèi)逐滴加完7ml的APTES，在160°C下，劇烈攪拌13h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用6ml的水做第一次離心洗滌，6ml的乙醇做第二次離心洗滌，6ml的水做第三次離心洗漆三次。取5ml6mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入5ml5mg/ml的EDC和5mL5mg/mlNHS，超聲反應(yīng)70min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3 ;持續(xù)攪拌llh，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將5mg的EDAC和7mg的Sulfo-NHS，混合在6ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為4mol/l，pH為7.5，最后加入25ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在40°C避光攪拌32h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到25ml的pH為6.5濃度為3mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入40 μ I的60 μ g/ml的PSCA,在40°C避光反應(yīng)14h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0064]實(shí)施例7
[0065]將5g5mmol的FITC和6g6mmol的APTES加入到70ml的乙醇中，在45°C下,避光通氮?dú)?mol，反應(yīng)22h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液6ml5g/ml分散在90ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲80min,加入氨水6ml作為催化劑，在45°C下，劇烈攪拌130min，攪拌速度60r/s，加入2.5ml的TEOS，在45°C下，反應(yīng)15h，加入FITC-APTES13ml，繼續(xù)攪20h，在7h內(nèi)逐滴加完5ml的TE0S，避光劇烈攪拌22h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用7ml的水做第一次離心洗滌，7ml的乙醇做第二次離心洗滌，7ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將5g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在90ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲80min使其充分溶解，在3.5h內(nèi)逐滴加完1ml的APTES，在180°C下，劇烈攪拌15h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用7ml的水做第一次離心洗滌，7ml的乙醇做第二次離心洗滌，7ml的水做第三次離心洗漆三次。取6ml7mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入7ml7mg/ml的EDC和7mL7mg/mlNHS,超聲反應(yīng)80min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌13h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將6mg的EDAC和1mg的Su If o-NHS，混合在7ml的MES沖液中，緩沖液濃度為6mol/l，pH為8，最后加入30ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在45°C避光攪拌34h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到30mol/l的pH為7，濃度為5mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入50 μ I的70 μ g/ml的PSCA，在45°C避光反應(yīng)16h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。[0066]實(shí)施例8
[0067]將6g6mmol的FITC和?.5g7mmol的APTES加入到80ml的乙醇中，在50°C下，避光通氮?dú)?.5mol，反應(yīng)24h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液7ml7g/ml分散在IlOml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲90min,加入15mol/I的氨水7ml作為催化劑，在50°C下，劇烈攪拌150min，攪拌速度60r/s，加入3ml的TE0S，在50°C下，反應(yīng)17h，加入FITC-APTES15ml，繼續(xù)攪22h，在8h內(nèi)逐滴加完7ml的TE0S，避光劇烈攪拌24h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用8ml的水做第一次離心洗滌，8ml的乙醇做第二次離心洗滌，8ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將6g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在IlOml乙醇和水的混合液中，混合比例為5: 1，超聲90min使其充分溶解，在4h內(nèi)逐滴加完14ml的APTES，在200°C下，劇烈攪拌18h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用8ml的水做第一次離心洗滌，8ml的乙醇做第二次離心洗漆，8ml的水做第三次離心洗漆三次。取7ml8mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入8ml8mg/ml的EDC和8mL8mg/ml NHS，超聲反應(yīng)90min，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌15h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將7mg的EDAC和15mg的Sulfo-NHS，混合在8ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為8mol/l，pH為8.5，最后加入40ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在50°C避光攪拌36h，攪拌速度60r/s ；透析分離后加入到35ml的pH為7.5，濃度為7mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入70 μ I的80 μ g/ml的PSCA，在50°C避光反應(yīng)18h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0068]實(shí)施例9 [0069]將8g8mmol的FITC和9g9mmol的APTES加入到90ml的乙醇中，在55°C下,避光通氮?dú)?mol，反應(yīng)26h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液9ml9g/ml分散在130ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲10min,加入18mol/l的氨水9ml作為催化劑，在55°C下，劇烈攪拌170min，攪拌速度60r/s，加入4ml的TE0S，在55°C下，反應(yīng)20h，加入FITC-APTES18ml，繼續(xù)攪23h，在9h內(nèi)逐滴加完9ml的TE0S，避光劇烈攪拌26h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用9ml的水做第一次離心洗滌，9ml的乙醇做第二次離心洗滌，9ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將Sg的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在130ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲10min使其充分溶解，在4.5h內(nèi)逐滴加完18ml的APTES，在220°C下，劇烈攪拌20h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用9ml的水做第一次離心洗滌，9ml的乙醇做第二次離心洗滌，9ml的水做第三次離心洗漆三次。取8ml9mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入9ml9mg/ml的EDC和9mL9mg/ml NHS，超聲反應(yīng)lOOmin，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌17h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ;將9mg的EDAC和18mg的Su If o-NHS，混合在9ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為9mo 1/1，pH為9，最后加入45ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在55°C避光攪拌38h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到40mol/l的pH為8，濃度為9mol/l的磷酸鹽緩沖液中，再加入90 μ I的90 μ g/ml的PSCA，在55°C避光反應(yīng)20h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0070]實(shí)施例10
[0071]將1glOmmol 的 FITC 和 1glOmmol 的 APTES 加入到 10ml 的乙醇中，在 60°C下，避光通氮?dú)?mol，反應(yīng)28h，得到FITC-APTES ;將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液10mll0g/ml分散在150ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:2,超聲2h,加入20mol/l的氨水1ml作為催化劑，在60°C下，劇烈攪拌210min，攪拌速度60r/s，加入5ml的TEOS，在60°C下，反應(yīng)24h，加入FITC-APTES20ml，繼續(xù)攪24h，在1h內(nèi)逐滴加完1ml的TEOS，避光劇烈攪拌28h，攪拌速度60r/s，得到功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用1ml的水做第一次離心洗滌，1ml的乙醇做第二次離心洗滌，1ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存，將1g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在150ml乙醇和水的混合液中，混合比例為5:1，超聲2h使其充分溶解，在5h內(nèi)逐滴加完20ml的APTES，在240°C下，劇烈攪拌24h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用1ml的水做第一次離心洗滌，1ml的乙醇做第二次離心洗漆，1ml的水做第三次離心洗漆三次。取10mll0mg/ml的LA,在冰水浴下向其中加入10mll0mg/ml的EDC和10mL10mg/ml NHS，超聲反應(yīng)2h，使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與氨基修飾的FMNPs溶液混合，混合比例為1:3，持續(xù)攪拌19h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ；將1mg的EDAC和20mg的Sulfo-NHS，混合在1ml的MES緩沖液中，緩沖液濃度為1mol/
I,pH為9.5，最后加入50ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在60°C避光攪拌40h，攪拌速度60r/s ;透析分離后加入到50mol/l的pH為8.5，濃度為lOmol/Ι的磷酸鹽緩沖液中，再加入100 μ I的100 μ g/ml的PSCA，在60°C避光反應(yīng)22h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
[0072]本發(fā)明的前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的透射電鏡圖如圖2所示；前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的在體磁共振成像圖如圖3所示；前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的熒光光譜圖如圖4所示；前列腺癌干細(xì)胞抗原抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的熒光顯微圖像如圖5所示。上述圖像表明納米顆粒分散性好，穩(wěn)定性好，有磁性納米顆粒的功能，而且熒光性能增強(qiáng)。
【權(quán)利要求】
1.具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:該制備方法為:首先制備異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，再以氨水作為催化劑，在四氧化三鐵納米溶液中，加入四乙氧基硅烷和異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷，反應(yīng)得到具有雙功能團(tuán)的介孔二氧化硅納米顆粒，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾氨基，進(jìn)而為納米顆粒修飾乳糖酸提供功能基團(tuán)，交聯(lián)乳糖酸以后，利用碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺與乳糖酸的羧基形成半穩(wěn)定的氨活性NHS酯，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到主動(dòng)靶向功能的雙模態(tài)介孔娃納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:該方法具體包括以下步驟: (1)將0.01g~1g0.01mmol~1mmol的異硫氛酸突光素和0.1Og~1g0.1mmol~1mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到1ml~10ml的乙醇中，在10°C~60°C下，避光通氮?dú)?.1mol~5mol反應(yīng)1h~28h,得到異硫氰酸突光素修飾的3-氨丙基三乙氧基娃烷，記做 FITC-APTES ； (2)將檸檬酸保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒水溶液0.1ml~1ml0.001g/ml~10g/ml分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min,加入氨水0.1ml~1ml,濃度為0.lmol/1~20mol/l作為催化劑，在10°C~60°C下，劇烈攪拌1min~6.5h,攪拌速度為60r/s，加入0.01ml~5ml的四乙氧基硅烷，在10°C~60°C下，反應(yīng)2h~24h，加入步驟(1)合成的異硫氰酸熒光素修飾的3-氨丙基三乙氧基硅烷0.1ml~20ml，繼續(xù)攪拌2h~24h,在Ih~1h內(nèi)逐滴加入0.01ml~1ml的四乙氧基硅烷,避光劇烈攪拌Ih~10h，攪拌速度為60r/s，得到雙功能團(tuán)的納米顆粒，記做FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次，干燥保存； (3)將0.01g~1g的雙功能團(tuán)的納米顆粒FMNPs分散在40ml~130ml乙醇和水的混合液中，超聲20min~120min使其充分溶解，在30min~5h內(nèi)逐滴加完0.1ml~20ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，50°C~240°C下，劇烈攪拌Ih~24h，攪拌速度60r/s，得到氨基修飾的FMNPs，用Iml~1ml的水做第一次離心洗滌，Iml~1ml的乙醇做第二次離心洗滌，Iml~1ml的水做第三次離心洗滌三次； (4)取0.1ml~10mllmg/ml~10mg/ml的含半乳糖基的乳糖酸分子,在冰水浴下向其中加入0.1ml~1ml0.lmg/ml~10mg/ml的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0.1mL~1ml0.lmg/ml~10mg/ml N-羥基丁二酰亞胺，超聲反應(yīng)20min~2h,使乳糖酸的羧酸基團(tuán)活化，然后將活化的乳糖酸溶液與步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液混合，持續(xù)攪拌Ih~19h，使乳糖酸活化的羧基與氨基修飾的FMNPs氨基結(jié)合，從而得到有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs ； (5)將0.1Omg~1mg 碳二亞胺鹽酸鹽和0.01mg~20mg N-羥基硫代琥拍酰亞胺，混合在Iml~1ml的2-嗎啉乙磺酸緩沖液中，緩沖液濃度為0.01mol/l~10mol/l，pH為4~9.5，最后加入1ml~50ml有乳糖酸修飾的氨基功能化FMNPs，在10°C~60°C避光攪拌20h~40h,攪拌速度60r/s ;碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥拍酰亞胺與乳糖酸的羧基形成半穩(wěn)定的氨活性NHS酯，透析分離后加入到pH為4~8.5，濃度為0.0Olmol/1~1mol/I的Iml~50ml的磷酸鹽緩沖液中，再加入0.1 μ I~100 μ I的10 μ g/ml~100 μ g/ml的前列腺干細(xì)胞抗原，在10°C~60°C避光反應(yīng)4h~22h，半穩(wěn)定的氨活性NHS酯與前列腺干細(xì)胞抗原抗體表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵連接，從而實(shí)現(xiàn)抗體交聯(lián)，得到表面修飾有抗體前列腺干細(xì)胞抗原的雙功能介孔二氧化硅。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所制備的異硫氰酸熒光素修飾的氨丙基三乙氧基硅烷保存在4°C下。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，逐滴滴加四乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在Ih~1h滴加完。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，乙醇和水的混合液中乙醇和水的體積比為5:2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷的時(shí)間間隔是以每滴10微升計(jì)算間隔時(shí)間，在30min~5h滴加完。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，乙醇和水的混合液中乙醇和水的體積比為5:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，冰水浴的的溫度為零攝氏度。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所 述的具有抗體介導(dǎo)的光磁雙模態(tài)介孔硅納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，活化的乳糖酸溶液和步驟(3)制備的氨基修飾的FMNPs溶液的混合比例為1:3。
【文檔編號(hào)】A61K47/04GK104027824SQ201410289389
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】詹勇華, 李英超, 韓青林, 李智敏, 梁繼民, 田捷 申請(qǐng)人:西安電子科技大學(xué)