一種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑及其制備方法。該方法是通過光接枝的方法將神經(jīng)生長因子(NGF)固定在水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(Fe3O4-OA-NAPI-AA)表面,再吸附能夠干擾α-突觸核蛋白合成的質粒DNA。將所述納米材料轉染試劑作用于MPP+誘導后的體外帕金森癥模型PC12細胞,細胞的凋亡受到明顯的抑制,其中神經(jīng)生長因子受體(NGFR)表達上調,α-突觸核蛋白表達下調,同時影響了經(jīng)典的BAX,P53,Bcl-2凋亡通路,達到治療帕金森癥的目的。本發(fā)明納米材料轉染試劑無毒、副作用小,能順利攜載基因進入細胞、作用明顯,值得推廣應用于帕金森癥的治療。
【專利說明】一種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉 染試劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米生物材料領域。更具體地,涉及一種具有基因治療帕金森癥效果 的多功能納米生物材料轉染試劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 帕金森癥(Parkinson' s disease, H)),是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病, 由英國醫(yī)生詹姆士·帕金森(James Parkinson)于1817年首先描述,早期被稱為"震顫麻 痹",后將此病命名為帕金森癥(Parkinson's disease)并沿用至今。"震顫麻痹"顧名思義 是因為患者患病后表現(xiàn)出動作遲緩,手或者腳及身體其他部分發(fā)生震顫,身體失去柔韌性, 肌肉僵硬。
[0003] 目前帕金森癥的主要治療手段以藥物治療為主,其中最重要的就是左旋多巴胺制 齊[J(L-dopa),最早由Hornykiewicz提出左旋多巴胺制劑可以治療帕金森癥,并由Cotzias 成功將左旋多巴胺制劑作為治療帕金森癥的有效制劑。左旋多巴胺制劑在帕金森癥的治 療中起著關鍵性的作用,目前所有的帕金森癥患者都選擇左旋多巴胺試劑作為治療手段。 但是服用左旋多巴胺制劑的同時會產(chǎn)生很多并發(fā)癥,例如"異動癥"、"開關效應"、"劑末效 應"。并且,使用左旋多巴胺治療的同時還會產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀,例如:幻覺、精神錯亂、焦 慮、抑郁等,給病人帶來了極大的痛苦和不便。
[0004] 基因治療是現(xiàn)代科學家提出的一種全新的治療手段,可以治療多種復雜疾病,癌 癥、遺傳性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等都是基因治療的主要領域?;蛑委熓侵竿?過外來遺傳物質干預疾病基因層面的發(fā)生、惡化和進展,替代并糾正人自身基因結構和功 能上的錯亂,消滅病變細胞或者提高機體清理病變細胞的能力。過去的幾年里,基因治療在 臨床上取得了長足的進步。臨床上,基因治療也遇到了很多的困難。未來基因治療的主要 目標是,研制安全高效的基因導入系統(tǒng),可以將外源基因靶向輸入到靶細胞。其中,RNAi是 基因治療的一種有效手段,通過人為地引入與內源靶基因相配對的雙鏈RNA,誘導內源靶基 因的mRNA降解,達到阻止基因表達的功能。目前科學家已經(jīng)開始腫瘤、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng) 疾病、顯性遺傳病等多種疾病的基因治療研究。據(jù)英國廣播公司(BBC)3月17日報道,美國 科學家在《柳葉刀一神經(jīng)病學》雜志上表示,使用基因療法治療帕金森病首次在臨床上取得 成功。帕金森病病患丘腦下核中一種化學物質氨基丁酸(GABA)的濃度會減少,英國帝 國理工學院的基因療法專家尼克勒斯?馬薩拉基斯領導的研究團隊制造出了一種病毒,該 病毒能使用一個基因來"感染"細胞,增加患者體內GABA的濃度。但是接受基因療法和未 接受基因療法病人的運動能力改進之間差別僅為10. 4%,并不明顯,加上許多人對基因療法 的安全性存在質疑,該方法并未得到有效的推廣應用。
[0005] 另外,通過靶向給藥系統(tǒng)將藥物運送到機體從而實現(xiàn)疾病的治療早已成為了研究 熱點。祀向給藥系統(tǒng)(Targeting durg delivery system, TDDS),誕生于20世紀70年代, 是一種新的技術和工藝,它是指藥物通過局部或者全身血液循環(huán)濃縮并定位到靶組織、靶 器官以及靶細胞的給藥系統(tǒng)。靶向給藥系統(tǒng)是通過脂質體、微球、微囊、納米粒等載體,經(jīng)口 腔給藥、直腸給藥、鼻腔給藥或皮膚給藥的方式將藥物靶向輸送到患處。靶向給藥系統(tǒng)具有 藥量小,作用大,毒副作用小的優(yōu)點,而且靶向制劑也從傳統(tǒng)的單一抗癌制劑發(fā)展到成為一 切具有靶向性的試劑。靶向性的機制主要有:多重靶向給藥系統(tǒng),生物化學靶向系統(tǒng),生物 免疫靶向系統(tǒng)。其中生物化學靶向系統(tǒng)和生物免疫靶向系統(tǒng)是現(xiàn)在藥物靶向系統(tǒng)的研究 熱點。近些年,科研工作者們試圖構建高效的藥物靶向運輸系統(tǒng),以提高藥物對靶細胞的靶 向選擇性,降低藥物用量,減少藥物的毒副作用;同時增強載體對藥物的控釋能力。靶向給 藥系統(tǒng)根據(jù)其制劑源動力不同可分為被動靶向制劑和主動靶向制劑以及前提靶向制劑。在 靶向給藥系統(tǒng)中,藥物載體以及藥物靶標的選擇是至關重要的。近些年納米材料的研究發(fā) 展提供了一種新型的藥物載體。本發(fā)明人前期的研究制備出水凝膠包覆納米四氧化三鐵顆 粒,符合納米藥物載體的要求,但是針對特定的病癥、特定的藥物,水凝膠包覆納米四氧化 三鐵顆粒如何實現(xiàn)藥物的攜載、如何順利進入機體、如何祀向定位等等問題,仍然是一項重 大的研究課題。
[0006] 同時,脂質體等傳統(tǒng)轉染試劑毒副作用大,而且一般都是親脂性的溶劑,他們和細 胞膜的親和性都比較大,容易透過細胞膜,這些轉染試劑能夠直接導致細胞死亡,如脂質體 可引起70%作用的細胞死亡。因此,制備一種低毒高效的能夠進入機體的藥物載體對ro的 治療意義重大。目前,未見有相關的報道,也未見有將納米生物材料靶向給藥結合基因調控 并應用于帕金森癥的治療研究。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有帕金森癥治療及傳統(tǒng)藥物轉染試劑的缺陷 和技術不足,提供一種具有基因治療帕金森癥效果的納米材料轉染試劑。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供上述具有基因治療帕金森癥效果的納米材料轉染試劑的制 備方法。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供上述具有基因治療帕金森癥效果的納米材料轉染試劑在 治療帕金森癥方面的應用。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn): 本發(fā)明提供了一種具有基因治療帕金森癥效果的納米材料轉染試劑,是通過光接枝的 方法將神經(jīng)生長因子(NGF)固定在水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(Fe304-0A-NAPI-AA)表 面,再利用其中的水凝膠吸附能夠干擾α -突觸核蛋白合成的質粒DNA制備得到。
[0011] 所述能夠干擾α -突觸核蛋白合成的質粒DNA是指pDNA ;所述pDNA是攜帶有SEQ ID NO. 1所示序列的GV102載體。
[0012] 所述納米材料轉染試劑不僅克服了傳統(tǒng)轉染試劑高毒副作用的缺陷,還能夠順利 的將siRNA或pDNA轉染到細胞內,干擾靶蛋白α -突觸核蛋白的合成,進而阻止PC12細胞 模型的凋亡。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述具有基因治療帕金森癥效果的納米材料轉染試劑的制備方 法,步驟如下: S1.制備光活性神經(jīng)生長因子; S11.按照1 :4?1 :5的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶 液,pH=7. 4),再加入800?90(^g N-琥珀酰亞胺酯; 512. 將60?lOOPg的NGF加入26?30mL步驟S11得到的含有N-琥珀酰亞胺酯和 二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7. 4)中,冰浴、避光條件下攪拌反應 50?72h ;離心純化產(chǎn)物,即得到光活性神經(jīng)生長因子,冷凍干燥備用; 513. 使用前,加入磷酸鹽緩沖溶液溶解并調整濃度; 32.制備光接枝神經(jīng)生長因子納米材料(斤6304-(^-見?4^4-如?)); 521. 按照比例,稱取1?5mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒,溶于5?30mL磷酸鹽 緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 將光活性神經(jīng)生長因子加入磁性水凝膠溶液中,使得磁性水凝膠與光活性神經(jīng)生 長因子的摩爾質量比為50 :1?300 :1,在避光混合均勻,800?3000W超聲分散10?30min 后轉移至培養(yǎng)皿,150?200W的紫外燈下10cm處照射8?12s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑; 按照lmg的Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于4mL磷酸鹽緩沖溶液的比例,將二者混勻,再向 其中加入10?lOOPg pDNA,冰浴攪拌2?3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調 整濃度備用。
[0014] 優(yōu)選地,S12所述離心是3500?5000rpm/min的轉速下,離心20?40min ;更優(yōu)選 地,S12所述離心是4000rpm/min的轉速下,離心30min。
[0015] S13所述調整濃度至lng/^L。
[0016] S21所述水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒是本發(fā)明人課題組制備的,方法參照本 課題組申請?zhí)枮?01110183415. 3的專利所述。
[0017] 按照體積比,S22所述的磁性水凝膠與光活性神經(jīng)生長因子的摩爾質量比為100 : 1〇
[0018] S22所述的超聲的條件為使用超聲波清洗機,1200?2500W超聲分散10?20min。
[0019] S22所述紫外照射的條件為:150W的紫外燈下10cm處照射10s。
[0020] S3所述冰浴攪拌3d。
[0021] 利用上述制備方法制備得到的多功能納米生物材料轉染試劑也在本發(fā)明的保護 范圍之內。
[0022] 本發(fā)明還提供上述多功能納米生物材料轉染試劑或上述制備方法制備得到的多 功能納米生物材料轉染試劑在制備帕金森癥治療藥物方面的應用。
[0023] 本發(fā)明人為了克服現(xiàn)有帕金森癥治療及傳統(tǒng)藥物轉染試劑的缺陷和技術不足, 通過大量的研究和探索,制備出所述的具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物 材料轉染試劑。將神經(jīng)生長因子(NGF)光接枝固定于水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒 (Fe304-0A-NAPI-AA)表面,再利用水凝膠吸附能夠干擾α -突觸核蛋白表達的質粒后,將 干擾質粒運送到細胞內。在體內,PDNA能夠干擾α-突觸核蛋白的表達,抑制相關神經(jīng)細 胞的凋亡;再加上NGF能夠抑制細胞凋亡,并發(fā)揮其對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用,細胞凋亡情況 得到進一步的抑制,從而帕金森癥逐步得到改善,進而達到治療帕金森病的目的。
[0024] 研究指出,路易小體(Lewy Body)是一種嗜酸性的核心致密的包涵體,存在于細胞 漿中,周圍有細絲狀暈圈。帕金森病人中腦黑質區(qū)病變位置的多巴胺能神經(jīng)元含有路易小 體,因此路易小體被認為是帕金森癥的主要病理特征,也是帕金森癥診斷的主要依據(jù)。而 α -突觸核蛋白(a -synuclein)是路易小體的主要成分,是帕金森病的罪魁禍首。α -突 觸核蛋白是一個全長140個氨基酸的蛋白質,α-突觸核蛋白的致病性突變有可能是由于 他的磷酸化和硝化。本發(fā)明選擇α-突觸核蛋白作為靶標,成功的制備出攜帶有干擾其表 達的質粒的多功能納米藥物載體,并能夠成功將干擾質粒運載到體內發(fā)揮作用。
[0025] 而神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)和研 究最為透徹的神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有神經(jīng)元的營養(yǎng)和促進神經(jīng)突觸生長的雙重生物學功能, NGF對神經(jīng)中樞和周圍神經(jīng)元的分化、發(fā)育、再生和生長和功能性表達都有著重要的調控作 用。NGF與受體結合后,通過受體介導的內吞機制產(chǎn)生內在化,形成由軸膜包繞、含有NGF、 并保持其生物活性的小泡,經(jīng)軸突沿微管逆行轉運至胞體,經(jīng)酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇 鈣、內源性環(huán)腺苷酸等第二信使體系的轉導,啟動一系列級聯(lián)反應,對靶細胞的某些結構或 功能蛋白基因表達進行調控而發(fā)揮其生物效應。通過本發(fā)明的多功能納米藥物載體,可以 將NGF運載到體內,發(fā)揮其對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用和對細胞凋亡的抑制作用,進一步保證 對帕金森癥的改善和治療效果。
[0026] 在本發(fā)明制備所述具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑 的過程中,如何保證光接枝并成功制備復合要求的能夠攜載藥物的納米材料,其中有著復 雜的影響因素和控制工藝,每一步都是非常關鍵的。另外,即使成功制備出復合要求的能夠 攜載藥物的納米材料以后,對于該納米材料是否能夠進入細胞,并將其攜載的藥物運載到 目的地仍然是非常關鍵的一步,其粒徑、表面電荷等等都是非常關鍵的影響因素。負載藥物 的粒徑、電荷以及負載量都有可能造成負載不成功、破壞載體的納米凝膠(使其不能夠形成 凝膠)、導致粒徑變大等問題。另外,溶劑以及藥物的pH值、電荷、載藥量等因素之間是相互 影響相互制約的,細微的差別可能造成嚴重的后果,藥物和載體相互作用可能會造成整體 粒徑出現(xiàn)數(shù)量級的差異。
[0027] 本發(fā)明人通過長期的探索和大量的研究,克服了種種因素和技術難題, 終于成功制備出具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑 (Fe304-0A-NAPI-AA-NGF-pDNA),并作用于PC12細胞模型,對PC12細胞的蛋白表達進行分 析發(fā)現(xiàn),神經(jīng)生長因子受體(NGFR)表達上調,α -突觸核蛋白表達下調,經(jīng)典凋亡通路中的 ΒΑΧ,Ρ53下調,Bcl-2上調,即影響了經(jīng)典的ΒΑΧ,Ρ53, Bcl-2凋亡通路,表面本發(fā)明的多功 能納米生物材料轉染試劑能夠很好的改善和治療帕金森癥,在帕金森癥的治療應用和研究 中,具體很好的推廣應用前景。
[0028] 本發(fā)明具有以下有益效果: 本發(fā)明提供了一種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑及其 制備方法,成功的將光活性NGF接枝到Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝膠上,再利用水凝膠吸 附能夠干擾α-突觸核蛋白表達的質粒后,將干擾質粒運送到細胞內。在體內,pDNA能夠 干擾α-突觸核蛋白的表達,抑制相關神經(jīng)細胞的凋亡;再加上NGF能夠抑制細胞凋亡,并 發(fā)揮其對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用,細胞凋亡情況得到進一步的抑制,從而帕金森癥逐步得到 改善,進而達到治療帕金森病的目的。
[0029] 將本發(fā)明的多功能納米生物材料轉染試劑作用于PC12細胞模型,對PC12細胞的 蛋白表達進行分析發(fā)現(xiàn),神經(jīng)生長因子受體(NGFR)表達上調,α-突觸核蛋白表達下調,經(jīng) 典凋亡通路中的ΒΑΧ,Ρ53下調,Bcl-2上調,即影響了經(jīng)典的ΒΑΧ,Ρ53, Bcl-2凋亡通路,表 面本發(fā)明的多功能納米生物材料轉染試劑可以抑制帕金森癥凋亡模型的凋亡現(xiàn)象,質粒的 加入導致α-突觸核蛋白的表達下降,可以引起凋亡作用的抑制,達到很好的改善和治療 帕金森癥的目的,在帕金森癥的治療應用和研究中,具體很好的推廣應用前景。
[0030] 本發(fā)明納米材料轉染試劑無毒、副作用小,粒徑分布于220?270nm之間,各種性 能均符合藥物載體及安全要求,能順利攜載藥物進入細胞,對帕金森癥有明顯的改善和療 效,值得推廣應用于帕金森癥的治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1為不同生物材料的紅外圖譜。
[0032] 圖2為本發(fā)明制備的納米材料轉染試劑的粒徑與電鏡掃描檢測。
[0033] 圖3為X射線光電子能譜儀檢測三種不同藥物(Fe304-0A,F(xiàn)e 304-0A-NIPA-AA, Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)的電子能譜。
[0034] 圖 4 為 MPP+濃度篩選(24h,72h,144h)。
[0035] 圖5為不同生物材料作用于PC12細胞模型后的凋亡率。
[0036] 圖6為不同生物材料作用于PC12細胞72h后經(jīng)DAPI染色后于熒光顯微鏡下觀察 的細胞形態(tài)圖。
[0037] 圖7為不同納米生物材料誘導α -突觸核蛋白表達情況。
[0038] 圖8為不同納米生物材料誘導BAX、Bcl_2、P53蛋白表達情況。
[0039] 圖9為不同納米生物材料誘導NGF受體蛋白表達情況。
【具體實施方式】
[0040] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明,但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明,本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規(guī)試 齊IJ、方法和設備。
[0041] 除非特別說明,本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0042] 以下實施例中所用交感神經(jīng)細胞(PC12細胞系)由中山大學醫(yī)學院動物中心提供, 經(jīng)本實驗室傳代培養(yǎng)。
[0043] 神經(jīng)生長因子(NGF),購自廣州新特藥店;胰酶、低糖DMEM培養(yǎng)基均為GIBC0BRL 公司產(chǎn)品;新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;24孔聚苯乙烯組織培養(yǎng) 基板為美國Corning康寧公司產(chǎn)品。
[0044] 干擾質粒pDNA購自上?;鶆P基因公司;所述pDNA是攜帶有SEQ ID NO. 1所示序列 的GV102載體。
[0045] SEQ ID NO. 1所示序列如下: gatcccACCAAAGAGCAAGTGACAAATctcgagATTTGTCACTTGCTCTTTGGTtttttggat。
[0046] 以下實施例中所用的水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(Fe304-0A-NIPA-AA)由發(fā)明 人自己制備,制備方法參考本發(fā)明人申請?zhí)枮?01110183415. 3的專利所述。
[0047] 為了更清晰明確的理解本發(fā)明及實施例的內容,現(xiàn)將個物質的名稱統(tǒng)一如下: Fe304-0A :油酸包裹的四氧化三鐵納米粒。
[0048] Fe304-0A-NIPA-AA :磁性水凝膠(即水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒,附圖中標示 為 NP-NIPA-AA)。
[0049] Fe304-0A_NIPA-AA-NGF :光接枝神經(jīng)生長因子納米材料(光接枝NGF納米材料,另 外附圖中標示為NP-NIPA-AA-NGF)。
[0050] Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA :攜載干擾質粒(藥物)的新型多功能納米生物材料轉 染試劑(即本發(fā)明制備的納米材料轉染試劑,附圖中標示為NP-NIPA-AA-NGF(pDNA))。
[0051] AzPhNGF :光活性 NGF。
[0052] 發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗和驗證,本發(fā)明所述的方法能夠成功的將光活性NGF接枝 到Fe 304-0A -NIPA-AA磁性水凝膠上,再利用水凝膠吸附能夠干擾α -突觸核蛋白表達的質 粒后,將干擾質粒運送到細胞內,發(fā)揮作用。
[0053] 以下實施例呈現(xiàn)出部分實驗數(shù)據(jù)來說明問題。
[0054] 實施例1本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, ρΗ=7. 4),再加入80〇μ8 Ν-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入26mL上述含有Ν-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0055] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取lmL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF (AzPhNGF)(其中 Fe304-0A_NIPA-AA與AzPhNGF的摩爾質量比為100 :1 ),在避光條件下混合均勻,并用超聲波 清洗器,1200W超聲清洗分散15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射10s, 真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入2(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0056] 實施例2本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF S11.按照1 :5的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入80〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入27mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應55h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在3500rpm/min 的轉速下,離心40min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0057] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 20mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取1. 5mL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA 與AzPhNGF的摩爾質量比為150 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器1500W超聲 清洗分散l〇min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射10s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入3(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0058] 實施例3本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4. 5的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入85〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入30mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7. 4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應60h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,lOKNa),在4500rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0059] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取3mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA_AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取2mL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA與 AzPhNGF的摩爾質量比為200 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器1800W超聲清 洗分散20min后轉移至培養(yǎng)皿中,于160W紫外燈下10cm處照射12s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入5(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0060] 實施例4本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF S11.按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入90〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將10〇μ8的NGF加入30mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7. 4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應72h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在5000rpm/min 的轉速下,離心20min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0061] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取5mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA_AA),溶于 30mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取0. 5mL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA 與AzPhNGF的摩爾質量比為50 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器2000W超聲 清洗分散20min后轉移至培養(yǎng)皿中,于170W紫外燈下11cm處照射10s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入8(^g pDNA,冰浴攪拌2d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0062] 實施例5本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :5的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入88〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將7〇μ8的NGF加入27mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7. 4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0063] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取2mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA_AA),溶于 30mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取2. 5mL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA 與AzPhNGF的摩爾質量比為250 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器2200W超聲 清洗分散15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于180W紫外燈下10cm處照射9s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入lOOPg pDNA,冰浴攪拌2. 5d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度 備用。
[0064] 實施例6本發(fā)明多功能納米生物材料轉染試劑的制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入86〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將8〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0065] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取2mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA_AA),溶于 15mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取3mL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA與 AzPhNGF的摩爾質量比為300 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器3000W超聲清 洗分散18min后轉移至培養(yǎng)皿中,于200W紫外燈下10cm處照射8s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入9(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0066] 本發(fā)明通過大量性能測定和研究實驗驗證,經(jīng)過本發(fā)明所述方法制備的具有基因 治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑均可達到很好的效果,成功的將光活性 NGF接枝到Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝膠上,再利用水凝膠吸附能夠干擾α -突觸核蛋白 表達的質粒后,將干擾質粒運送到細胞內。在體內,pDNA能夠干擾α-突觸核蛋白的表達, 抑制相關神經(jīng)細胞的凋亡;再加上NGF能夠抑制細胞凋亡,并發(fā)揮其對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作 用,細胞凋亡情況得到進一步的抑制,從而帕金森癥逐步得到改善,進而達到治療帕金森病 的目的。
[0067] 其中,以實施例1制備的多功能納米生物材料轉染試劑的各項性能和轉染應用效 果最好。以下實施例7?10呈現(xiàn)出對實施例1制備的多功能納米生物材料轉染試劑進行 表征和應用研究結果。
[0068] 實施例7多功能納米生物材料轉染試劑的表征 本實施例對實施例1制備的多功能納米生物材料轉染試劑進行性能表征,具體方法和 結果如下。
[0069] 1、紅外光譜檢測 將Fe304-0A_NIPA-AA-NGF,AzPhNGF試樣和KBr在干燥機中進行干燥處理,混合并研磨 均勻,并將混合物研磨到粒度小于2Mm,以免散射光影響。將混合物置于模具中,在油壓機上 用5?lOMPa壓力將混合物壓成透明薄片,上機待定。結果如附圖1所示。
[0070] 附圖1顯示的是傅里葉轉換紅外線光譜分析儀表征比較光活性NGF制備前后官能 團的紅外圖譜的變化,疊氮苯甲酸-N-琥珀亞酰胺酯的疊氮基的伸縮振動峰在2140CHT 1處, 合成AzPhNGF后振動吸收峰移至2382 cnT1處;NGF在16378CHT1處本身具有伯胺NH面的變 形振動吸收峰,光活性NGF在1640 cnT1處出現(xiàn)酰胺的振動吸收峰。NGF羧基伸縮振動峰在 948 cnT1處,合成AzPhNGF后振動吸收峰減弱,可以推斷是由于引進疊氮苯甲酸-N-琥珀亞 酰胺酯時NGF上的羧基發(fā)生反映形成酰胺鍵。同時AzPhNGF中出現(xiàn)的疊氮基,可以進一步推 斷是由于引進疊氮苯甲酸-N-琥珀亞酰胺酯內有疊氮基。在接枝NGF后Fe 304-0A-NIPA_AA 上的-CH2-和-CH3-消失,原因是疊氮基在紫外光的刺激下定向攻擊-CH2-和-CH3-并與 其形成酰胺鍵將光活性NGF連接到Fe 304-0A-NIPA-AA,初步證明光活性NGF成功地接枝到 Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝膠上。
[0071] 2、粒徑和掃描電鏡觀察 取部分樣品,經(jīng)馬爾文粒度分析儀測量粒徑。
[0072] 結果如附圖2所示。圖2顯示的是Fe304-0A_NAPI-AA接枝NGF,并且 Fe304-0A_NAPI-AA-NGF吸附質粒DNA后,粒徑分布于220?270nm之間,且分布較為狹窄, SEM結果顯示粒子直徑與粒徑結果相符,可用于后續(xù)轉染實驗。電鏡結果與粒徑結果基本相 符,進一步驗證了本發(fā)明制備的納米生物材料合成成功。
[0073] 3、X射線光電子能譜儀檢測 X射線光電子能譜儀分析其元素構成及化學鍵的形成情況。分別取適量油酸包裹的四 氧化三鐵納米粒、磁性水凝膠、接枝NGF的材料(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF)送樣,用X射線光 電子能譜儀掃描各樣品組成成分元素分析。結果見附圖3。
[0074] 通過X射線光電子能譜儀(XPS,日本U1VAC-PHI公司)進一步驗證多功能納米生物 材料各步反應的合成成功,如附圖3所示,I圖表示油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe 304-0A 的XPS圖譜,II圖表示磁性水凝膠(Fe304-0A-NIPA_AA)的XPS圖譜,III圖表示接枝神經(jīng)生 長因子(NGF)的多功能納米生物材料(Fe 304-0A_NIPA-AA-NGF)的XPS圖譜。在I圖中主要 由C-C鍵、C-H鍵、羰基C=0鍵組成,II圖中由于水凝膠接枝到四氧化三鐵納米粒表面形成 了 C-N鍵,使得C-N鍵的比例增加到10. 09%,同時C=0鍵羰基的比例增加到8. 39% ;111圖 中由于進一步光接枝了神經(jīng)生長因子(NGF),使得C-N鍵的比例增加到25. 64%,同時C=0鍵 羰基的比例下降到5. 67% ;因此,我們可以進一步認定,將水凝膠接枝于四氧化三鐵納米粒 表面、將神經(jīng)生長因子(NGF)接枝到磁性水凝膠表面的光接枝反應是成功的。
[0075] 實施例8多功能納米生物材料轉染試劑轉染PC12細胞模型實驗 本實施例利用實施例1制備的多功能納米生物材料轉染試劑進行轉染PC12細胞模型 實驗,具體方法和結果如下。
[0076] 1、細胞培養(yǎng) 交感神經(jīng)細胞(PC12細胞系)由中山大學醫(yī)學院動物中心提供。細胞在培養(yǎng)瓶中融合 培養(yǎng)至80%后,以1. 75 X 104/孔的密度接種至24孔板上,培養(yǎng)3?6天,以進行后續(xù)實驗。
[0077] 2、MPP+誘導細胞凋亡 分別取不同劑量MPP+ (1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子)加入正在培養(yǎng)的PC12細胞 中,24h,72h,144h后測量細胞存活率,設定后續(xù)建模MPP+濃度。
[0078] MPP+是1-甲基-4-苯基-1,2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)在體內由單胺氧化酶B催化 而來的神經(jīng)毒性物質,MPP+進入細胞的細胞質后,就聚集在線粒體通過組織電子傳遞鏈的 complex I影響細胞的呼吸作用,產(chǎn)生類似于的病理狀態(tài)。
[0079] 根據(jù)經(jīng)驗,我們選擇細胞凋亡率為40%,即每孔MPP+濃度為250Mmol/L,作為我們 24h體外帕金森細胞模型的藥物作用濃度,為72h模型篩選MPP+濃度提供了參考。同理,72h 與144h的MPP+濃度分別為5〇Mmol/L和5Mmol/L。(如附圖4所示) 3、雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 將處于對數(shù)生長期的PC12細胞,消化、收集后用有血清DMEM培養(yǎng)基接種到24孔培 養(yǎng)板中。待細胞生長4h (細胞已貼壁良好)后,將培養(yǎng)板中的有血清培養(yǎng)基棄掉,各加入 lmL無血清DMEM培養(yǎng)基,同時加入MPP+ (根據(jù)72h和144h的篩選劑量)5〇Mmol/L(72h), 5Mmol/L(144h),并分別加入 I、II、III 三種藥物,其中 I 為 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 為 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 為 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (藥量以 pDNA 量為 0· lPg/ 孔 計)。37°C下培養(yǎng)72h和144h后,棄去培養(yǎng)基,用胰酶消化收集細胞,用冰冷的PBS緩沖液反 復洗滌3次,離心沉淀細胞,棄上清。再加0. 5mL PBS緩沖溶液重懸細胞,然后加入Annexin V/PI各5PL,37°C下避光孵育20min,用流式細胞儀上機檢測熒光強度。
[0080] 結果如附圖5所示,a組未加任何藥物的正常細胞,生長72h后,1. 7%的細胞位 于Q2凋亡象限,2. 4%的細胞位于Q4壞死象限。b組經(jīng)由MPP+誘導PC12細胞凋亡后加入 Fe304-0A_NAPI-AA,10. 9%的細胞位于Q2凋亡象限,26. 7%的細胞位于Q4壞死象限,59. 4%的 細胞位于Q3正常象限。c組經(jīng)由MPP+誘導PC12細胞凋亡后加入Fe304-0A_NAPI-AA-NGF, 8. 4%的細胞位于Q2凋亡象限,12. 3%的細胞位于Q4壞死象限,71. 6%的細胞位于Q3正常 象限。d組經(jīng)由MPP+誘導PC12細胞凋亡后加入Fe304-0A-NAPI-AA-NGF-pDNA,3. 1%的細胞 位于Q2凋亡象限,6. 3%的細胞位于Q4壞死象限,90. 2%的細胞位于Q3正常象限??梢姸?功能納米生物材料作用細胞72h后一定程度上抑制了 MPP+誘導的PC12細胞的凋亡。同理 144趨勢與72h相同。
[0081] 4、細胞DAPI染色后的形態(tài)觀察 將處于對數(shù)生長期的PC12細胞,消化、收集后用有血清DMEM培養(yǎng)基接種到24孔培 養(yǎng)板中。待細胞生長4h (細胞已貼壁良好)后,將培養(yǎng)板中的有血清培養(yǎng)基棄掉,各加入 lmL無血清DMEM培養(yǎng)基,同時加入MPP+ (根據(jù)72和144h的篩選劑量)5〇Mmol/L(72h), 5Mmol/L(144h),并分別加入 I、II、III 三種藥物,其中 I 為 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 為 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 為 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (藥量以 pDNA 量為 0· lPg/ 孔 計)。37°C下培養(yǎng)72h和144h后,棄去上清液,用PBS洗2?3次。
[0082] 用DAPI染細胞核在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài):避光向每孔中加入4%多聚甲 醛,室溫下固定30min ;避光用PBS洗三次;并向每孔中加入0. 2%TritonX-100,37°C下透化 30min ;再用PBS洗三次,5min/次;避光向每孔中加入DAPI,避光反應5min,再用PBS洗;用 熒光顯微鏡觀察DAPI藍色熒光區(qū)域。
[0083] 結果如附圖6所示。圖6顯示了經(jīng)MPP+作用建模后的PC12細胞經(jīng)多功能納 米生物材料作用72h后用DAPI染細胞核于熒光顯微鏡下觀察的細胞核形態(tài),圖中三行 NP-NAPI-AA、NP-NAPI-AA-NGF、NP-NAPI-AA-NGF (pDNA)分別代表三種不同的納米生物材料 組,即 Fe304-0A_NIPA-AA、Fe304-0A-NIPA-AA-NGF、Fe 304-0A-NIPA_AA-NGF-pDNA。MPP+ 作用 建模后的PC12細胞,經(jīng)多功能納米生物材料作用72h后,細胞用DAPI染細胞核于熒光顯微 鏡下觀察細胞核的形態(tài)結果。三個組的細胞核都被DAPI染成藍色,經(jīng)MPP+作用后的PC12 細胞,加入NP-NAPI-AA后,由于MPP+對細胞的刺激,使PC12細胞發(fā)生凋亡,染色質皺縮, 高度凝集并且邊緣化,出現(xiàn)凋亡小體,加入NP-NAPI-AA-NGF后,由于NGF對細胞凋亡的抑 制作用,細胞核變大,凋亡小體減少,凋亡細胞較NP-NAPI-AA組減少,加入NP-NAPI-AA-NGF (pDNA)后,由于α -突觸核蛋白被干擾,加上NGF對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用,細胞凋亡情況得 到進一步的抑制,細胞核形態(tài)趨于正常,凋亡小體較前兩組減少。對照同位置光鏡可以分析 得出細胞形態(tài)的變化趨勢。144h趨勢對比72h趨勢相似。
[0084] 5、α-突觸核蛋白、P53、BAX、Bcl_2的變化趨勢 將處于對數(shù)生長期的PC12細胞,消化、收集后,用有血清DMEM培養(yǎng)基接種到24孔培 養(yǎng)板中。待細胞生長4h (細胞已貼壁良好)后,將培養(yǎng)板中的有血清培養(yǎng)基棄掉,各加入 lmL無血清DMEM培養(yǎng)基,同時加入MPP+ (根據(jù)72和144h的篩選劑量)5〇Mmol/L(72h), 5Mmol/L(144h),并分別加入 I、II、III 三種藥物,其中 I 為 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 為 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 為 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (藥量以 pDNA 量為 0· lPg/ 孔 計)。37°C下培養(yǎng)72h和144h后提取蛋白,進行免疫印記實驗。
[0085] 附圖7反映了免疫印跡檢測α -突觸核蛋白(a -syn)表達情況。如圖7所示,I 組(油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe304-0A)細胞內α -突觸核蛋白(a -syn)表達量較高, II組(油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe304-0A外光接枝神經(jīng)生長因子NGF)和III組(吸附 pDNA的Fe304-0A -NIPA-AA-NGF)細胞內α -突觸核蛋白(a -syn)表達量明顯下調,尤其是 III組細胞內α -突觸核蛋白(a -syn)表達量下調最明顯,這說明多功能納米生物材料傳 遞pDNA進入細胞,干擾了 α -突觸核蛋白(a -syn)的合成,并且144h的干擾情況優(yōu)于72h。
[0086] 其中,II組細胞內α-突觸核蛋白(a-Syn)表達量下調的原因是神經(jīng)生長因子也 可以引起α-突觸核蛋白的表達下調,誘導細胞的增長和分化。
[0087] 附圖8反映了免疫印跡檢測Ρ53、BAX、Bcl-2的表達情況。如圖所示,I組為油酸 包裹的四氧化三鐵納米粒Fe 304-0A),II組為油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe304-0A外光接 枝神經(jīng)生長因子NGF,III組為吸附pDNA的Fe 304-0A -NIPA-AA-NGF。從圖8可以看出,ΒΑΧ 和Ρ53表達發(fā)生下調,Bcl-2表達發(fā)生上調,說明吸附質粒的多功能納米材料抑制了細胞內 的經(jīng)典凋亡途徑,促進了細胞生長。
[0088] 6、NGFR的蛋白表達 附圖9反映了免疫印跡檢測神經(jīng)生長因子受體(NGFR)表達情況。如附圖9所示,I組 (油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe304_0A)細胞內腫瘤壞死因子-α受體(TNFR1)幾乎沒有 表達,II組(油酸包裹的四氧化三鐵納米粒Fe304-0A外光接枝神經(jīng)生長因子NGF)和III組 (吸附pDNA的Fe304-0A -NIPA-AA-NGF)細胞內神經(jīng)生長因子受體(NGFR)表達量明顯上調, 這說明多功能納米生物材料已成功將NGF運載到細胞內,其表面接枝的神經(jīng)生長因子與細 胞表面的神經(jīng)生長因子受體(NGFR)發(fā)生了相互作用并引發(fā)了細胞信號轉導途徑,并且介導 了胞吞作用。
[0089] 對比例1多功能納米生物材料轉染試劑制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF S11.按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入20〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0090] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取lmL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA與 AzPhNGF的比例為100 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器,1200W超聲清洗分散 15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射10s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入2(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0091] 對比例2多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例1,唯一不同的是步驟S11中加入N-琥珀酰亞胺酯的量為lOOOPg。
[0092] 對比例3多功能納米生物材料轉染試劑制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入80〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7. 4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0093] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取lmL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA與 AzPhNGF的比例為100 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器,1200W超聲清洗分散 15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射Is,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入2(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0094] 對比例4多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例3,唯一不同的是步驟S22所述150W紫外燈下10cm處照射5s。
[0095] 對比例5多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例3,唯一不同的是步驟S22所述150W紫外燈下10cm處照射15s。
[0096] 對比例6多功能納米生物材料轉染試劑制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入80〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,10KNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0097] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取lmL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF,其中Fe304-0A-NIPA-AA與 AzPhNGF的比例為100 :1,在避光條件下混合均勻,并用超聲波清洗器,1200W超聲清洗分散 15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射10s,真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS緩沖液中,向其中 加入2(^g pDNA,冰浴攪拌7d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度備 用。
[0098] 對比例7多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例6,唯一不同的是步驟S3所述冰浴攪拌的時間為5d。
[0099] 對比例8多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例6,唯一不同的是步驟S3所述冰浴攪拌的時間為10h。
[0100] 對比例9多功能納米生物材料轉染試劑制備 步驟如下: S1.制備光活性NGF 511. 按照1 :4的體積比,將二甲基甲酰胺(DMF)加入到磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液, pH=7. 4),再加入80〇μ8 N-琥珀酰亞胺酯;將6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亞 胺酯和二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液,pH=7.4)中,在4°C冰浴、避光條 件下攪拌反應50h ; 512. 合成結束后,分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II,lOKNa),在4000rpm/min 的轉速下,離心30min以純化生成的疊氮苯基衍生物,即為光活性NGF(AzPhNGF),冷凍干燥 備用; 513. 使用前,加入50mL的PBS溶液溶解,并調整至所需濃度lng/^L。
[0101] S2.制備光接枝NGF納米材料(多功能納米材料Fe304-0A-NIPA-AA-NGF) 521. 稱取lmg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒(磁性水凝膠,F(xiàn)e304-0A-NIPA-AA),溶于 10mL PBS緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液; 522. 吸取lmL磁性水凝膠溶液,向其中加入lPg光活性NGF (AzPhNGF)(其中 Fe304-0A_NIPA-AA與AzPhNGF的摩爾質量比為100 :1 ),在避光條件下混合均勻,并用超聲波 清洗器,1200W超聲清洗分散15min后轉移至培養(yǎng)皿中,于150W紫外燈下10cm處照射10s, 真空凍干備用; S3.制備多功能納米生物材料轉染試劑(Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 稱取lmg光接枝NGF納米材料(Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于10mL PBS緩沖液中,向其 中加入2(^g pDNA,冰浴攪拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后,調整至合適濃度 備用。
[0102] 對比例10多功能納米生物材料轉染試劑制備 本對比例同對比例9,唯一不同的是步驟S3所述稱取lmg光接枝NGF納米材料 (Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于 lmL PBS 緩沖液。
[0103] 本發(fā)明對上述對比例1?10制備的多功能納米生物材料轉染試劑進行了性能檢 測和應用研究實驗,對結果進行如下描述,并對其可能原因進行了分析: 結果顯示,對比例1和2由于步驟S11中N-琥珀亞胺脂的計量變低,導致光活性的NGF 量變少,進而使NGF接枝到納米粒外的量變少,無法發(fā)揮出NGF介導納米材料進入細胞的功 效。
[0104] 對比例3?5由于步驟S22所述照射時間過短或過長,引起納米粒嚴重團聚,粒徑 結果顯示不適宜后續(xù)試驗,因而無法成功制備多功能納米生物材料轉染試劑,不能將干擾 質粒運送到細胞內,從而無法實現(xiàn)治療帕金森病的目的。
[0105] 對比例6和7由于步驟S3中冰浴攪拌時間過久,引起質粒DNA的裂解,影響納米 材料的治療效果。
[0106] 對比例8由于步驟S3中冰浴攪拌時間過短,F(xiàn)e304-0A_NIPA-AA-NGF未能有效吸附 pDNA,從而達不到干擾α -突觸核蛋白合成的作用,無法實現(xiàn)治療帕金森病的目的。
[0107] 對比例9由于步驟S3中Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于PBS緩沖液的濃度過低,未能 有效吸附PDNA,從而達不到干擾α -突觸核蛋白合成的作用,無法實現(xiàn)治療帕金森病的目 的。
[0108] 對比例10由于步驟S3中Fe304-0A_NIPA-AA-NGF溶于PBS緩沖液的濃度過高,反而 引起了 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF的競爭吸附,造成未能有效吸附pDNA,從而達不到干擾α -突 觸核蛋白合成的作用,無法實現(xiàn)治療帕金森病的目的。 SEQUENCE LISTING 〈110>華南師范大學 〈120> -種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑及其制備方 法和應用 <130> <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 63 <212> DNA 〈213>干擾質粒pDNA攜載序列 <400> 1 gatcccacca aagagcaagt gacaaatctc gagatttgtc acttgctctt tggttttttg 60 gat 63
【權利要求】
1. 一種具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑,其特征在于,是 通過光接枝的方法將神經(jīng)生長因子固定在水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒表面,再利用水 凝膠吸附能夠干擾α -突觸核蛋白合成的質粒DNA制備得到; 所述能夠干擾α -突觸核蛋白合成的質粒DNA是指pDNA ;所述pDNA是攜帶有SEQ ID NO. 1所示序列的GV102載體。
2. -種權利要求1所述具有基因治療帕金森癥效果的多功能納米生物材料轉染試劑 的制備方法,其特征在于,步驟如下:
51. 制備光活性神經(jīng)生長因子;
511. 按照1 :4?1 :5的體積比,將二甲基甲酰胺加入到磷酸鹽緩沖液中,再加入800? 9〇〇μβ N-琥珀酰亞胺酯;
512. 將60?lOOPg的NGF加入26?30mL步驟SI 1得到的含有Ν-琥珀酰亞胺酯和二 甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液中,冰浴、避光條件下攪拌反應50?72h ;離心純化產(chǎn)物,即得 到光活性神經(jīng)生長因子,冷凍干燥備用;
513. 使用前,加入磷酸鹽緩沖溶液溶解并調整濃度;
52. 制備光接枝神經(jīng)生長因子納米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;
521. 按照比例,稱取1?5mg水凝膠包裹的四氧化三鐵納米粒,溶于5?30mL磷酸鹽 緩沖溶液中,得到磁性水凝膠溶液;
522. 將光活性神經(jīng)生長因子加入磁性水凝膠溶液中,使得磁性水凝膠與光活性神經(jīng)生 長因子的摩爾質量比為50 :1?300 :1,在避光混合均勻,800?3000W超聲分散10?30min 后轉移至培養(yǎng)皿,150?200W的紫外燈下10cm處照射8?12s,真空凍干備用;
53. 制備多功能納米生物材料轉染試劑; 按照lmg的Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于4mL磷酸鹽緩沖溶液中的比例,將二者混勻,再 向其中加入10?l〇〇Kg pDNA,冰浴攪拌2?3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后, 調整濃度備用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法,其特征在于,所述磷酸鹽緩沖液的pH值均為7. 4 ; S12所述離心是3500?5000rpm/min的轉速下,離心20?40min ; S13所述調整濃度至lng/^L。
4. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法,其特征在于,S12所述離心是4000rpm/min的轉速 下,離心30min。
5. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法,其特征在于,按照體積比,S22所述的磁性水凝膠 與光活性神經(jīng)生長因子的摩爾質量比為100 :1。
6. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法,其特征在于,S22所述超聲的條件為使用超聲波清 洗機,1200?2500W超聲分散10?20min ; S22所述紫外照射的條件為:150W的紫外燈下10cm處照射10s。
7. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法,其特征在于,S3所述冰浴攪拌3d。
8. 權利要求2?7任一所述制備方法制備得到的多功能納米生物材料轉染試劑。
9. 權利要求1或8所述多功能納米生物材料轉染試劑在制備帕金森癥治療藥物方面的 應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104043132SQ201410289953
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權日:2014年6月26日
【發(fā)明者】關燕清, 劉俊明, 武迪 申請人:華南師范大學