一種復(fù)方聚維酮碘消毒液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復(fù)方聚維酮碘消毒液，每1000ml消毒液中含有如下用量的原料：聚維酮碘10～100g，美洲大蠊提取物以總氨基酸計(jì)在0.8g以上，碘酸鉀適量，余量為水。本發(fā)明還提供了消毒液的制備方法。本發(fā)明將美洲大蠊醇提物與聚維酮碘聯(lián)合使用，不僅具有良好的殺菌作用，并且還能夠促進(jìn)肉芽組織生長、抗炎及消除炎性水腫，二者組成復(fù)方聚維酮碘消毒液制劑，可用于各種創(chuàng)傷的消毒及治療；另外，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，聚維酮碘中加入美洲大蠊提取物后，明顯增加了聚維酮碘的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品質(zhì)量提供了保障。
【專利說明】一種復(fù)方聚維酮碘消毒液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種復(fù)方聚維酮碘消毒液及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 美洲大蠊（PeriplanetaAmericana)屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，"蟑螂，，為其俗名， 首見于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲，在地球上已經(jīng)生存了 3· 5億年，是世界上生 命力最強(qiáng)、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。美洲大蠊藥用主癥瘕、破積聚,通利血 脈，外用可斂瘡、拔毒、化腐、生肌，現(xiàn)代研究表明其還具有良好的抗菌作用。
[0003] 康復(fù)新液主要成分為美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物，功能通利血脈，養(yǎng)陰生肌， 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為康復(fù)新液具有促進(jìn)肉芽組織生長、抗炎及消除炎性水腫、提高機(jī)體免疫功能、 抑制胃酸分泌等藥理作用，臨床用于十二指腸潰瘍，胃潰瘍，燒燙傷等的治療。
[0004] 聚維酮碘（PVP-I)是碘與表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP)及增溶劑形成的新型 消毒劑，廣泛應(yīng)用于臨床，殺菌譜廣，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、病毒、芽孢、真菌、原蟲等 都有強(qiáng)而迅速的殺滅作用。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道碘伏可能引起女性醫(yī)護(hù)人員甲狀腺疾病發(fā) 病率上升，可能與碘的易揮發(fā)性有關(guān)，有研究表明碘伏的穩(wěn)定性易受溫度影響，也有文獻(xiàn)表 明，但有效碘濃度較高時（>1000μ g/υ時，對細(xì)胞增殖有抑制作用，因此開展新型聚維酮 碘復(fù)方消毒產(chǎn)品的研究工作，研發(fā)出質(zhì)量好、性能穩(wěn)定的產(chǎn)品，具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方聚維酮碘消毒液。
[0006] 本發(fā)明提供了一種復(fù)方聚維酮碘消毒液，每1000ml消毒液中含有如下用量的原 料：
[0007] 聚維酮碘10?100g，美洲大蠊提取物以總氨基酸計(jì)在〇· 8g以上（例如0. 8? 0. 9g)，碘酸鉀適量，余量為水。
[0008] 進(jìn)一步地，聚維酮碘的含量為25?100g。
[0009] 更進(jìn)一步地，聚維酮碘的含量為50?100g。
[0010] 目前在聚維酮碘溶液制劑中，碘酸鉀一直作為穩(wěn)定劑存在于溶液中，它有助于增 加聚維酮碘溶液的穩(wěn)定性。因此，碘酸鉀的用量可以參考已知聚維酮碘溶液制劑中的用量。 例如，本發(fā)明中每1000ml消毒液中碘酸鉀的含量為1?5g。
[0011] 其中，消毒液中還含有如下輔料：防腐劑或/和助溶劑。
[0012] 進(jìn)一步地，所述防腐劑為苯甲酸鈉或/和山梨酸鉀；所述助溶劑為甘油或/和吐 溫。
[0013] 其中，所述美洲大蠊提取物為去油脂的美洲大蠊提取物。
[0014] 進(jìn)一步地，所述去油脂的美洲大蠊提取物的制備方法為：去美洲大蠊，乙醇提取 后，去除油脂，即得。
[0015] 更進(jìn)一步地，制備方法的具體操作如下：
[0016]、取美洲大蠊，粉碎，用80%?90% v/v乙醇提取，醇提液回收乙醇并濃縮后，加水， 加熱攪拌，靜置，冷卻，待油脂充分上浮，取下清液，過濾，濾液濃縮或干燥后，得美洲大蠊提 取物。
[0017]具體地，美洲大蠊提取物的制備方法如下：
[0018]取美洲大蠊，粉碎，用80%?90%的乙醇提取，第一次加7倍量乙醇回流提取 2小 時，^二次加5倍量乙醇回流提取丨· 5小時，第三次加3倍量乙醇回流提取1小時，合并提 取液，靜置Sh以上，濾過，濾液回收乙醇并濃縮成稠膏（相對密度約丨· 3〇 (85Γ ))，加入2〇 倍浸膏量的純水，加熱攪拌，靜置，冷卻，使油脂充分上浮，取下清液，過濾，濾液濃縮成稠膏 (相對密度約1. 30 (85°C ))，得美洲大蠊提取物。
[0019]本發(fā)明還提供了上述復(fù)方聚維酮碘消毒液的制備方法，它包括如下操作步驟： [0020] (1)按配比稱取原料；
[0021] (2)取去油脂的美洲大蠊提取物、聚維酮碘和碘酸鉀，加水溶解后，加入常規(guī)輔料， 混勻，濾過，滅菌，即得消毒液。
[0022]本發(fā)明將美洲大蠊醇提物與聚維酮碘聯(lián)合使用，不僅具有良好的殺菌作用，并且 還能夠促進(jìn)肉芽組織生長、抗炎及消除炎性水腫，二者組成復(fù)方聚維酮碘消毒液制劑，可用 于各種創(chuàng)傷的消毒及治療；另外，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，聚維酮碘中加入美洲大蠊提取物后，明 顯增加了聚維酮碘的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品質(zhì)量提供了保障。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 處方
[0025]聚維酮碘（PVP-I) 50g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于0· 8g甘油150ml 山梨酸2g苯甲酸鈉3. 5g碘酸鉀2g
[0026] 制備成 1000ml
[0027] 制法
[0028]取PVP-I 5〇g，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于0· Sg，加入80%所需量 的純水、甘油150ml、碘酸鉀2g、苯甲酸鈉3. 5g及山梨酸2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1000ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0029]該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為5%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0. 8g。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 處方
[0032] 聚維酮碘（PVP-1) 25g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇· 8g甘油150ml 吐溫-801ml碘酸鉀2g山梨酸3g
[0033] 制備成 l〇〇〇ml
[0034] 制法
[0035]取？￥?-125§，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇.駘，加入80%所需量 的純水、甘油l5〇ml、碘酸鉀2g、山梨酸3g及吐溫-801ml，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1000ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0036] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為2· 5%，含美洲大蠊提取物 每1000ml不少于0. 8g。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] 處方
[0039] 聚維酮碘（PVP-1) 10g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）〇. 8?〇.呢吐溫_805ml 碘酸鉀2g
[0040] 制備成 1000ml
[0041] 制法
[0042] 取PVP-Il〇g，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）〇· 85g，加入80%所需量的純水、吐 溫805ml及碘酸鉀2g,加熱溶解，濾過，濾液加水至l〇〇〇 ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0043] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為1 %，含美洲大蠊提取物每 1000ml 為 0· 8 ?0. 9g。
[0044] 實(shí)施例4
[0045] 處方
[0046] 聚維酮碘（PVP-I) 75g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇·如甘油150ml 吐溫803ml山梨酸2g碘酸鉀2g
[0047] 制備成 1000ml
[0048] 制法
[0049] ?。浚?-175§，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于0.哋，加入8〇%所需量的 純水、甘油150ml、吐溫803ml、碘酸鉀2g及山梨酸2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至l〇〇〇ml， 攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0050] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為7· 5%，含美洲大蠊提取物 每1000ml不少于0. 8g。
[0051] 實(shí)施例5
[0052] 處方
[0053] 聚維酮碘（PVP-I) 100g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇· 8g吐溫803ml 碘酸鉀2g
[0054] 制備成 1000ml
[0055] 制法
[0056] 取？￥?-110(^，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇.8心加入80%所需量的 純水、吐溫 8〇3ml及碘酸鉀2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至l〇00ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝， 即得。
[0057] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為10%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0. 8g。
[0058] 實(shí)施例6
[0059] 處方
[0060]聚維酮碘（PVP-I) l〇g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇· 8g乙醇750ml 山梨酸2g碘酸鉀2g
[0061] 制備成 1000ml
[0062] 制法
[0063] SPVP-Il〇g，美洲大蠊提取物（以總難酸計(jì)）不少:于〇·8g，加入80%所需量的 純水、乙醇75〇ml、碘酸鉀2g及山梨酸2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1000m1，攪勻，滅菌， 濾過，灌裝，即得。 〇八
[0064]該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為1%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0· 8g。
[0065] 實(shí)施例7
[0066] 處方
[0067] 聚維酮碘（PVP_I)50g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇· %甘油50ml 碘酸鉀2g山梨酸5g ^
[0008] 制備成 1000ml
[0069] 制法
[0070] 取PVP-I50g，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇. 8g，加入80%所需量的 純水、甘油50ml、碘酸鉀2g及山梨酸5g，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1〇〇〇ml，攪勻，滅菌，濾 過，灌裝，即得。 乂 ^
[0071] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為5%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0. 8g。
[0072] 實(shí)施例8
[0073] 處方
[0074]聚維酮碘（PVP-1) 100g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇·叱甘油200ml 碘酸鉀2g山梨酸lg
[0075] 制備成 1000ml
[0076] 制法
[0077]取PVP-IlOOg，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇· 8§，加入80%所需量的 純水、甘油200ml、碘酸鉀2g及山梨酸lg，加熱溶解，濾過，濾液加水至1000m1，攪勻，滅菌， 濾過，灌裝，即得。
[0078]該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為10%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0. 8g。
[0079] 實(shí)施例9
[0080] 處方
[0081]聚維酮碘（PVP-I) l〇〇g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇. %甘油l5〇ml 山梨酸2g苯甲酸鈉3. 5g碘酸鉀lg
[0082] 制備成 1000ml
[0083] 制法
[0084]?。浚?-110(^，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇.恥，加入80%所需量 的純水、甘油150ml、碘酸鉀lg、苯甲酸鈉 3. 5g及山梨酸2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1000ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0085] 該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為10%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0. 8g。
[0086] 實(shí)施例1〇
[0087] 處方
[0088]聚維酮碘（PVP-I) l〇〇g美洲大蠊醇提物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇. 8g甘油150ml 山梨酸2g苯甲酸鈉3. 5g碘酸鉀5g _9] 制備成1000ml
[0090] 制法
[0091] 取PVP-Il〇〇g，美洲大蠊提取物（以總氨基酸計(jì)）不少于〇_ 8g，加入8〇%所需量 的純水、甘油150ml、碘酸鉀5g、苯甲酸鈉3. 5g及山梨酸2g，加熱溶解，濾過，濾液加水至 1000ml，攪勻，滅菌，濾過，灌裝，即得。
[0092]該復(fù)方聚維酮碘消毒液含聚維酮碘以有效碘濃度計(jì)為1〇%，含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0· 8g。
[0093]本發(fā)明實(shí)施例中美洲大蠊提取物的均為去油脂品，其制備方法可以參見現(xiàn)有技術(shù) 中的公開方法，如201210446614. 3。也可參照如下方法：
[0094]取美洲大蠊，粉碎，用80%?90%的乙醇提取，第一次加7倍量乙醇回流提取2小 時，第二次加5倍量乙醇回流提取1. 5小時，第三次加3倍量乙醇回流提取1小時，合并提 取液，靜置8h以上，濾過，濾液回收乙醇并濃縮成稠膏（相對密度約l 30(85t；))，加入2〇 倍浸膏量的純水，加熱攪拌，靜置，冷卻，使油脂充分上浮，取下清液，過濾，濾液濃縮成稠膏 (相對密度約L 3〇 (85°C ))，得美洲大蠊提取物。
[0095]以下通過試驗(yàn)例具體說明本發(fā)明的有益效果。
[0096]下述試驗(yàn)例中，復(fù)方聚維酮碘消毒液中的有效碘濃度參照各具體試驗(yàn)步驟要求， 消毒液中所含美洲大蠊提取物以總氨基酸計(jì)，每1000ml含〇. 8?〇. 9g。
[0097] 試驗(yàn)例1復(fù)方聚維酮碘消毒液的藥理作用考察：
[0098] 1.復(fù)方聚維酮碘消毒液對體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
[0099] 1. 1 材料
[0100] 1. 1· 1 細(xì)胞株
[0101] 內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株ECV_3〇4購于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。
[0102] 1. 1. 2主要試劑
[0103] 復(fù)方聚維酮碘消毒液（實(shí)驗(yàn)中所用的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其中除了聚維酮碘、 美洲大蠊提取物、碘酸鉀外，不含防腐劑和其他輔料）
[0104] 美洲大蠊飲片、美洲大蠊醇提物（四川科倫藥業(yè)集團(tuán)有限公司）
[0105] 聚維酮碘溶液（PVP-I，批號：101004,有效碘濃度10. 〇% )，（成都永安制藥有限公 司）
[0106] 聚維酮碘粉末（純度彡99%，鄭州賽諾康化工產(chǎn)品有限公司）
[0107] RPMI1640 培養(yǎng)基，（美國 GIBC0 公司）
[0108] 胎牛血清，（上海玉博生物科技有限公司）
[0109] PBS緩沖液（pH = 7. 4)，（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）
[0110] 0. 25%胰蛋白酶，（北京格源天潤生物科技有限公司）
[0111] 青霉素（80萬U/ml)，（山東魯抗制藥股份有限公司）
[0112] 鏈霉素（100萬U/ml)，（山東魯抗制藥股份有限公司）
[0113] 溴化丙啶（PI)，（SIGMA)
[0114] 鼠抗人PCNA單克隆抗體，（上海億欣生物科技有限公司）
[0115] 兔抗人Ki-67單克隆抗體，（上海億欣生物科技有限公司）
[0116] PV-9000通用型二抗，（上海億欣生物科技有限公司）
[0117] DAB，（上海億欣生物科技有限公司）
[0118] 1.1. 3 儀器
[0119] 酶標(biāo)儀，Bi〇-RAD550,(美國 Bio-RAD 公司）
[0120] 倒置顯微鏡，olympus，（日本）
[0121]醫(yī)用凈化工作臺，APR-GM-ZYT-6,（成都艾普瑞實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）
[0122] 微型迷你振蕩器，MS-1，（日本IKA公司）
[0123] 醫(yī)用低速離心機(jī)，TOL-5,（四川蜀科儀器有限公司）
[0124] C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，MC0175,（日本三洋電器有限公司）
[0125] 液氮生物容器，YDS-30,（成都信杰誠貿(mào)易有限公司）
[0126] _2〇°C冰箱，康佳，（安徽康佳電器有限公司）
[0127] -80°C超低溫冰箱，Therm〇F〇rma725型，（日本三洋電器有限公司）
[0128] 電熱恒溫干燥箱，（成都特思特儀器有限公司）
[0129] 流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACSCalibur，（美國BD公司）
[0130] 培養(yǎng)板，6、24、96 孔，（COSTER)
[0131] 1.1. 4各溶液配方
[0132] (l)RPMI 1640培養(yǎng)液：取一包rpmi 1640培養(yǎng)基粉末溶解于300ml三蒸水再用三蒸 水洗包裝袋內(nèi)兩次。加入磁性攪棒，放在振蕩器上攪勻，加入2gNaHC03，定容接近l〇〇〇ml，并 用lmol HCL溶液調(diào)pH值至7. 0?7· 2,并加入青霉素使終濃度至l〇〇U/ml和鏈霉素終濃度 100U/ml。0_22um濾膜兩張過濾除菌，無菌條件下分裝，4°C冷藏備用。每批使用不超過兩 周。
[0133] (2)PI 復(fù)合染液：生理鹽水：129. 6ml、PI :10ml、RNase :2mg、1.0 % Triton-100 : 0· 5ml、枸椽酸鈉：200mg，加蒸餾水至200ml，調(diào)整pH值至7· 2?7. 6,4?避光保存。
[0134] ⑶ 1 :5〇PCNA 或 Ki-67 抗體：取 PCNA 或 Ki-67 抗體原液 10 μ 1，以 490 μ 1 PBS 稀 釋至500 μ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0135] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0136] 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0137] 內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304培養(yǎng)于含1〇%胎牛血清的RPMIIMO培養(yǎng)液中，內(nèi)含終濃度為 100U/ml的青霉素和鏈霉素，置于37t：、 5% C02飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)單層培養(yǎng)，待細(xì)胞長 滿80%?90%后，PBS緩沖液沖洗兩遍，〇· 25%胰蛋白酶消化約5?8min待出現(xiàn)篩孔效應(yīng) 后，用lml吸管輕輕吹打完全后傳代。
[0138] 1. 2. 2復(fù)方聚維酮碘消毒液對體外培養(yǎng)ecv-304細(xì)胞增殖的影響
[0139]分別取復(fù)方聚維酮碘消毒液適量，用RPMI1640培養(yǎng)基分別稀釋至一定濃度的溶 液，具體方法步驟如下：
[0140] 1· 2. 2· 1消化制備單細(xì)胞懸液：待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長滿約8〇 %?9〇 %后，力口 lml0_25%胰蛋白酶消化，鏡下觀察見細(xì)胞回縮，出現(xiàn)篩孔效應(yīng)，倒掉消化液，加入含1〇%胎 牛血清的RPMI16402?3ml吹打，使細(xì)胞脫壁，加培養(yǎng)液至10ml繼續(xù)吹打使細(xì)胞之間分散 成單個細(xì)胞，并于鏡下觀察，制備成單細(xì)胞懸液。
[0141] I·2·2· 2計(jì)算細(xì)胞密度：用1ml刻度吸管吸取少許細(xì)胞懸液，滴在計(jì)數(shù)板上并置于 倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度。
[0142]細(xì)胞數(shù)Μ = 4大格細(xì)胞總數(shù)/4X 104
[0143] 1.2. 2. 3調(diào)整細(xì)胞密度：使細(xì)胞密度調(diào)至〇.8?LoxwYmi,-般每瓶細(xì)胞需加 培養(yǎng)基至24?25ml即可得到所需細(xì)胞密度。
[0144] 1. 2· 2. 4接種：24孔板每板分為i個對照組和3個實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)6個實(shí)驗(yàn)復(fù)孔。 每孔加入lml細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)約2h后細(xì)胞貼壁。
[0145] 1. 2· 2· 5加入復(fù)方聚維酮碘消毒液：待鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，取出培養(yǎng)板向?qū)嶒?yàn) 孔加不同配比組成的復(fù)方聚維酮碘消毒液。具體方法為：從實(shí)驗(yàn)孔中取出20 μ 1培養(yǎng)液棄 去，然后加入等體積的復(fù)方聚維酮碘消毒液。
[0146] 1. 2. 2. 6細(xì)胞培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)：加入不同復(fù)方聚維酮碘消毒液后放 入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于第4、8、12和24h觀察細(xì)胞生長狀況，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0147] 1.2. 3對細(xì)胞周期的影響
[0148]將ECV_3〇4細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，用含有效碘濃度為〇.丨〇%、5. 〇〇%、ι〇. 〇〇% 的^方聚維酮碘消毒液的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h后用胰酶適度消化制備單個細(xì)胞懸液，收集 至離心管lOOOrpm離心15min，棄上清。PBS沖洗2次，加0.5ml PBS吹勻，用5ml注射器將 細(xì)胞吸起打入5Π 11701%冷乙醇中，封口膜封口。4°C固定過夜。lOOOrpm離心15min，棄上清 液，PBS沖洗2次。用0· 4ml PBS重新懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎），將 細(xì)胞懸液和等體積的PI復(fù)合染液混合，染色（4°C, 20?30min)，400目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī) 檢測。ModFit分析軟件分析，用S期細(xì)胞比率（SPR)表示相對增殖力。
[0149] SPR = S/ (Go/Gi+S+02/M)
[0150] 1.2.4對？0熟、1^67表達(dá)的影響
[0151]采用第二代聚合酶兩步法（PV法）分析，其步驟為：
[0152] 1. 2. 4. 1在無菌條件下將消毒好的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板；
[0153] 1· 2· 4. 2將ECV-3〇4培養(yǎng)于蓋玻片上（6片/實(shí)驗(yàn)組），待細(xì)胞貼壁后加入等量的 復(fù)方聚維酮碘消毒液，有效碘濃度分別為10. 00 %、7. 50 %、5. 00 %、2. 50 %和0· 10 %，培養(yǎng) 24h ；
[0154] 1· 2. 4· 3由培養(yǎng)板中取出蓋玻片，冷丙酮固定細(xì)胞（室溫，i〇min)，pbs沖洗 (2minX3 次）；
[0155] 1. 2· 4. 445?烤片 3h，PBS 沖洗 5min，三次；
[0156] 1· 2. 4. 5 滴加 0· 5% Triton-X100(37O，10min)，PBS 沖洗 5min，三次；
[0157] 1· 2. 4· 6每張切片滴加蒸餾水新鮮配置的3% H202(37°C，10min)，以滅活內(nèi)源性過 氧化物酶，PBS沖洗5min，三次；
[0158] 1_2.4_7滴加一抗（鼠抗人？0碰1861:50，兔抗人1^671861 :50)，37。〇201^11后 4°C過夜；
[0159] 1· 2. 4. 837°C復(fù)溫 lh，PBS 沖洗 2min，三次；
[0160] 1.2.4.9滴加二抗中試劑1，37。〇，2〇1!^11，卩83沖洗51^11,三次 ；
[0161] 1. 2. 4. 10 滴加二抗中試劑 2,37°C，30min ;PBS 沖洗 5min，三次；
[0162] 1. 2· 4· 11滴加新鮮配置的DAB顯色，鏡下控制時間，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；
[0163] 1· 2· 4· I2蘇木素輕度復(fù)染，自來水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封 片；
[0164] 1. 2. 4. 13鏡下觀察并照相，計(jì)數(shù)100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選擇6個視野， 計(jì)算均值X 100%為陽性細(xì)胞的比率。
[0165] 1.2. 5統(tǒng)計(jì)處理方法
[0166] 數(shù)據(jù)處理采用SPSS18· 0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間的 比較采用F檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的多重比較采用q檢驗(yàn)。Ρ<0· 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P>0. 05無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0167] 1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0168] 1. 3. 1對體外培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞增殖的影響
[0169] ECV-304細(xì)胞在不同配比組成的復(fù)方聚維酮碘消毒液培養(yǎng)液中培養(yǎng)不同時間后， 可見細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞形態(tài)與有效碘濃度及作用時間存在一定關(guān)系（時間劑量效應(yīng)關(guān)系，見 表 1 -1)。
[0170] 1. 3· 1. 1. 1不同有效碘濃度的復(fù)方聚維酮碘消毒液作用4h對ECV-304細(xì)胞數(shù)量 及形態(tài)的影響：加復(fù)方聚維酮碘消毒液培養(yǎng)4h，與對照組比較，康復(fù)新液組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì) 胞計(jì)數(shù)均顯著增加，PVP-I組有增強(qiáng)趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞 呈圓形或不規(guī)則形，均勻透亮,貼壁后內(nèi)皮細(xì)胞呈典型鋪路石狀鑲嵌排列，或呈扁平的短梭 形、多角形，鍵嵌排列。
[0171] 1. 3. 1. 1. 2不同有效碘濃度的復(fù)方聚維酮碘消毒液作用8h對ECV-304細(xì)胞數(shù)量及 形態(tài)的影響：培養(yǎng)8h后，康復(fù)新液組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著增加，與對照組、PVP-I組 比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，形態(tài)無明顯改變；PVP-I組細(xì)胞計(jì)數(shù)有減少趨勢，可見形態(tài)改變，細(xì)胞 內(nèi)可見空泡現(xiàn)象以及中毒顆粒。
[0172] L 3. 1. 1. 3不同有效碘濃度的復(fù)方聚維酮捵消毒液作用12h對ECV-304細(xì)胞數(shù)量 及形態(tài)的影響：培養(yǎng)12h后，康復(fù)新液組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著增加，與對照組、PVP-I 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，形態(tài)無明顯改變；PVP-I組細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，可見細(xì)胞形態(tài)明顯改 變?yōu)槌衫w維樣長梭形，細(xì)胞內(nèi)可見空泡現(xiàn)象以及中毒顆粒。
[0173] 1. 3. 1. 1. 4不同有效碘濃度的復(fù)方聚維酮碘消毒液作用24h對ECV-304細(xì)胞數(shù)量 及形態(tài)的影響：培養(yǎng)24h后，康復(fù)新液組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著增加，與對照組、PVP-I 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，形態(tài)無明顯改變；PVP-I組細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，可見細(xì)胞形態(tài)明顯改 變?yōu)槌衫w維樣長梭形，且可見部分細(xì)胞回縮脫壁，細(xì)胞內(nèi)可見空泡現(xiàn)象以及中毒顆粒。
[0174]表1-1不同時間段復(fù)方聚維酮碘消毒液對細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 [0175]

【權(quán)利要求】
1. 一種復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：每1000ml消毒液中含有如下用量的原料： 聚維酮碘10?l 〇0g，美洲大蠊提取物以總氨基酸計(jì)在〇. 8g以上，碘酸鉀適量，余量為 水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：聚維酮碘的含量為25? 100g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：聚維酮碘的含量為50? 100g。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：碘酸鉀的含量為1?5g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：消毒液中還含有如下輔 料：防腐劑或/和助溶劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：所述防腐劑為苯甲酸鈉 或/和山梨酸鉀；所述助溶劑為甘油或/和吐溫。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：所述美洲大蠊提取物為 去油脂的美洲大蠊提取物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：所述美洲大蠊提取 物的制備方法為：去美洲大蠊，乙醇提取后，去除油脂，即得。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)方聚維酮碘消毒液，其特征在于：制備方法的具體操作如 下： 取美洲大蠊，粉碎，用80%?90% v/v乙醇提取，醇提液回收乙醇并濃縮后，加水，力口 熱攪拌，靜置，冷卻，待油脂充分上浮，取下清液，過濾，濾液濃縮或干燥后，得美洲大蠊提取 物。
10. 權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述復(fù)方聚維酮碘消毒液的制備方法，其特征在于：它包括 如下操作步驟： (1) 按配比稱取原料； (2) 取去油脂的美洲大蠊提取物、聚維酮碘和碘酸鉀，加水溶解后，加入常規(guī)輔料，混 勻，濾過，滅菌，即得消毒液。
【文檔編號】A61K35/64GK104248645SQ201410300615
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】張廷模, 蘇柘僮, 鄒俊波 申請人:成都百草和濟(jì)科技有限公司