一種分泌表達pedv核心抗原coe蛋白重組乳酸乳球菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，具體公開了一種分泌表達PEDV核心抗原COE蛋白重組乳酸乳球菌及其制備方法和應用。本發(fā)明通過設(shè)計多條引物，采用重疊延伸PCR的方法將信號肽等序列連接到PEDV核心抗原COE的基因上，并將其連接到乳酸乳球菌表達載體pNZ8048，電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000細胞內(nèi)獲得重組菌。將重組菌以乳鏈菌肽誘導獲得表達，誘導后的全培養(yǎng)物直接作為口服疫苗能夠刺激小鼠并引起較強的細胞免疫應答，該重組乳酸乳球菌可以作為一種具有良好產(chǎn)業(yè)前景的新型口服疫苗產(chǎn)品，對減輕PEDV對養(yǎng)豬業(yè)的危害起到積極的作用，對促進養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展具有重要的實踐意義。
【專利說明】-種分泌表達PEDV核心抗原COE蛋白重組乳酸乳球菌及其 制備方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種分泌表達豬流行性腹瀉 病毒核心抗原C0E蛋白重組乳酸乳球菌及其制備方法和應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是世界性的豬傳染病之 一，1978年在英國首次被報道，隨后在包括我國在內(nèi)的世界多個地區(qū)爆發(fā)流行，對各國養(yǎng)豬 業(yè)造成重大損失。PED在亞洲的爆發(fā)引起極高的死亡率，有研究顯示日本1993?1994年爆 發(fā)PED時，5個豬場仔豬死亡數(shù)就超過一萬，死亡率在30%?60% ;據(jù)報道從2010年2月到 2011年11月，我國爆發(fā)PED引起的仔豬死亡數(shù)在五萬以上，死亡率高達90%?100%。2013 年，美國也首次報道了 PEDV的存在，2014年持續(xù)爆發(fā)與流行。
[0003] PEDV在被發(fā)現(xiàn)后直至今日，不但沒有被有效控制，反而成了影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的 重大病毒，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對于PED的預防主要是接種疫苗，雖然國內(nèi)PEDV的 滅活苗及弱毒活疫苗得到了廣泛的推廣和應用，在一定程度上減少了 PED的發(fā)病率，但仍 無法完全控制。從目前國內(nèi)外對PEDV的研究結(jié)果及應用效果看，仔豬主要通過初乳獲得母 源slgA，產(chǎn)生對冠狀病毒性腹瀉的被動免疫保護，血清中的循環(huán)抗體IgG不能提供保護，也 就是經(jīng)非腸道免疫不能產(chǎn)生母源免疫。針對PEDV的快速變異和腸道粘膜免疫特點，不斷研 制安全的，可口服的新型疫苗來提高疫苗的免疫效果顯得尤為重要。
[0004] PEDV的部分保護性抗原基因（C0E基因）編碼的部分S糖蛋白具有抗原性，能夠誘 導機體產(chǎn)生中和抗體。由于血清抗體的免疫效果不理想，腸道粘膜免疫產(chǎn)生的分泌型抗體 (slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體。因此，選擇安全無毒，能夠在腸道中存活并能表達和 傳遞抗原物質(zhì)的載體系統(tǒng)，有效地刺激粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫應答對本病的防治具有 重要意義。
[0005] 乳酸乳球菌(Laciococci/s 是乳球菌屬中最重要和最典型的一個種，在食 品工業(yè)中應用廣泛，被公認為安全的（generally-regarded-as_safe，GRAS)食品級微生物。 以乳酸乳球菌作為宿主菌表達異源蛋白和酶，逐漸成為食品工業(yè)、生物制藥和疫苗研究的 執(zhí)占。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中針對PEDV疫苗免疫效果不佳的缺 陷，提供一種分泌表達PEDV核心抗原C0E蛋白重組乳酸乳球菌的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述方法制備得到的分泌表達PEDV核心抗原C0E蛋 白重組乳酸乳球菌。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述重組乳酸菌作為口服疫苗在預防豬流行性腹瀉 中的應用。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種預防豬流行性腹瀉口服疫苗。
[0010] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為設(shè)計多條引物，采用重疊延伸PCR的方 法將信號肽等序列連接到經(jīng)密碼子優(yōu)化的C0E基因上，以Usp45信號肽實現(xiàn)C0E蛋白的分 泌表達，以增強序列（LEISSTCDA)及其插入位置實現(xiàn)表達量的增加。
[0012] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 提供一種分泌表達豬流行性腹瀉病毒核心抗原C0E蛋白重組乳酸乳球菌的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟： 51. 人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化后的C0E基因，設(shè)計多條引物，采用重疊延伸PCR的方法將 Usp45信號肽序列連接到C0E基因上； 52. 將S1獲得的C0E基因連接至pNZ8048并篩選得到重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E ;采用電 轉(zhuǎn)化法將PNZ8048-C0E重組質(zhì)粒導入乳酸乳球菌Z. hciisNZgOOO中，獲得重組乳酸乳球菌 L. 7acii5NZ9000/pNZ8048-C0E ； S1所述經(jīng)密碼子優(yōu)化后的COE基因序列如SEQ IDN0:1所示，各引物序列如SEQ ID NO: 2?9所示；所述篩選重組質(zhì)粒的引物序列如SEQ ID NO :10?11所示。
[0013] 重疊延伸 PCR 技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，簡稱 S0E PCR) 由于采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過 重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進 行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它 依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。在PEDV疫苗的現(xiàn)有技術(shù)中，還未發(fā)現(xiàn)利用 重疊延伸PCR技術(shù)，并通過經(jīng)優(yōu)化的目的基因及增強序列等獲得乳酸乳球菌的表達體系。 重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計，發(fā)明人在重疊延伸PCR的技術(shù)原理 上，通過大量的實驗研究和條件摸索，獲得了上述可用于高效擴增的多條引物。
[0014] 優(yōu)選地，S1所述重疊延伸PCR的反應程序為：98°C預變性5min ;98°C變性10s， 55°C退火10s，72°C延伸5s，30個循環(huán)；72°C后延伸10min。
[0015] 優(yōu)選地，S2所述電轉(zhuǎn)化法為：取Z. hciis NZ9000感受態(tài)細胞，加入pNZ8048-C0E 重組質(zhì)粒，混勻并轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯，電擊后加入恢復培養(yǎng)基，冰浴后靜置培養(yǎng)，平板篩選高拷 貝轉(zhuǎn)化子。
[0016] 乳酸菌表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：緊密型表達系統(tǒng)，受控嚴格，非誘導條件下幾乎不 表達；乳酸乳球菌的胞外蛋白酶很少，通過信號肽介導的胞外分泌表達可以一定程度上消 除胞內(nèi)蛋白酶的降解，增加目標肽的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。
[0017] 作為一種優(yōu)選方式，上述分泌表達豬流行性腹瀉病毒核心抗原C0E蛋白重組乳酸 乳球菌的制備方法包括如下步驟： S1.分泌型重組質(zhì)粒PNZ8048-C0E的構(gòu)建 S11.相關(guān)基因序列的密碼子偏好性優(yōu)化與合成：將C0E基因、Usp45序列及其它修 飾DNA序列均經(jīng)過密碼子優(yōu)化，同時選擇增強序列的插入位置，設(shè)計多條引物Afc〇I-Uspl、 Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、C0E-His-歷ii/III-R，同時還設(shè)計了用于重組質(zhì) 粒的PCR檢測和測序的引物pNZ 1及pNZ2，優(yōu)化合成的Afco I-Usp 1、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、 Usp6-C0E-F、C0E-F、C0E-His-歷·fli/III-I^pNZUpNZZ 引物序列分別如 SEQ ID NO :2 ?11 所 示； 512. 無上游修飾的COE基因片段的PCR擴增：以含優(yōu)化合成的COE基因的質(zhì)粒為模板 進行PCR擴增； 513. C0E基因完整修飾片段的重疊延伸PCR擴增過程：以S12中回收的PCR產(chǎn)物為模 板，加入高保真 DNA 聚合酶 2XPrime STAR Mix 25yL，引物 AfcoI-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、 Usp5、Usp6-C0E-F、COE-His-歷·fli/III-R 各 1 μ L，模板 0· 5 μ L，用 ddH20 補至 50 μ L，PCR 反 應程序為：98°C預變性5min ;98°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸58,30個循環(huán)；72°〇后 延伸lOmin ; 514. 重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E的構(gòu)建：將S13中回收的PCR產(chǎn)物用Afcol、班/--/ΙΙΙ進 行雙酶切處理，以同樣的方法對ΡΝΖ8048空質(zhì)粒進行雙酶切，通過連接酶將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 萬.co/i MC1061感受態(tài)細胞，檢測獲取陽性質(zhì)粒，即為獲得了重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E ; S2.含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌的構(gòu)建 S21.乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備：將凍存的Z. hcii^NZgOOO乳酸乳球菌 進行復蘇，取3〇μ? Z. hciis NZ9000感受態(tài)細胞，冰浴上融解，加入1PL pNZ8048-C0E重 組質(zhì)粒，輕輕混勻；將以上混合物轉(zhuǎn)入冰預冷的電擊杯，迅速給予一個單脈沖，參數(shù)設(shè)置為 2kV，25PF，200 Ω，電擊后立即輕柔加入lmL冰預冷的恢復培養(yǎng)基G-M17MC，將菌液全部吸入 一滅菌離心管，蓋緊管蓋，冰浴5min后30°C靜置培養(yǎng)1?1. 5h ;將菌液涂布并挑取單個菌 落篩選鑒定得到陽性重組表達菌命名為A hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE ; 優(yōu)選地，S11所述增強序列的插入位置為Usp45信號肽之后，目的基因 COE之前，處 于中間，位置關(guān)系為：(PnisA :: 5PUsp45 :: LEISSTCDA :: C0E)，其中PnisA為啟動子， "LEISSTCDA"為增強序列的氨基酸序列。
[0018] 提供上述方法制備得到的重組質(zhì)粒PNZ8048-C0E和重組乳酸菌乳球菌 Ζ. 7<^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε。
[0019] 提供上述重組乳酸乳球菌Z .hciisNZgOOO/pNZSCMS-COE在制備預防豬流行性腹 瀉口服疫苗中的應用。
[0020] 提供一種預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，包括如下步驟：將重組乳酸乳 球菌Z jaciisNZgOOO/pNZSCMS-COE接種于G-M17C液體培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)過夜，取過夜培 養(yǎng)物以一定比例接種于G-M17液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細菌進入對數(shù)生長期，加入誘導劑 Nisin至終濃度為1?2 ng/mL，誘導一定時間，誘導后的全培養(yǎng)物直接作為口服疫苗。
[0021] 優(yōu)選地，所述靜置培養(yǎng)的溫度為30°C。
[0022] 優(yōu)選地，所述一定比例接種為將Z jac --Ζ9000/ρΝΖ8048_(：0Ε重組表達菌以 1:100的比例接種于G-M17C液體培養(yǎng)基。
[0023] 優(yōu)選地，所述對數(shù)生長期為所述細菌培養(yǎng)液的0D值為0. 4?0. 6。
[0024] 優(yōu)選地，所述誘導一定時間為3?6 h。
[0025] 作為一種優(yōu)選方式，上述預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，包括如下步驟： 將Ζ .^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重組表達菌以1:100的比例接種于G-M17C液體培養(yǎng)基， 30°C靜置培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物以1:50的比例接種于10mL G-M17C液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培 養(yǎng)約2. 5h至細菌進入對數(shù)生長期（0D_=0. 4?0. 6);分為誘導組和不誘導組，誘導組加入 lyg/mL的誘導劑（Nisin)至終濃度為1或2 ng/mL，誘導3?6 h后終止培養(yǎng)，采用梯度 稀釋涂板法測定重組菌的濃度達1012 CFU/mL數(shù)量級，誘導后的全培養(yǎng)物可直接作為口服疫 苗。
[0026] 提供上述方法制備得到的預防豬流行性腹瀉的口服疫苗。
[0027] 優(yōu)選地，上述口服疫苗可采用灌胃或飼喂的方式使用。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種分泌表達豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組乳酸乳球菌的 制備方法。即采用Z. hciisNZgOOO/pNZSCMS乳酸菌表達系統(tǒng)，并添加 Usp45信號肽和增強 序列等來進行PEDV核心抗原基因 C0E基因的分泌表達，誘導物Nisin是由乳酸菌產(chǎn)生的一 類抗生物肽，具有高效、安全、無毒的特性，加上乳酸菌作為益生菌的益生特性，使得此乳酸 菌表達系統(tǒng)成為一個食品級表達系統(tǒng)，可以連同菌體一起服用。
[0029] 將制備得到的乳酸乳球菌用于表達核心抗原C0E蛋白制備針對PED的疫苗，與市 場已有疫苗相比，在腸黏膜IgA抗體產(chǎn)生與維持上有優(yōu)勢，誘導后的全培養(yǎng)物直接作為口 服疫苗能夠刺激小鼠并引起較強的細胞免疫應答，該重組乳酸乳球菌可以作為一種具有良 好產(chǎn)業(yè)前景的新型口服疫苗產(chǎn)品，對減輕PEDV對養(yǎng)豬業(yè)的危害起到積極的作用，對促進養(yǎng) 豬業(yè)健康發(fā)展具有重要的實踐意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為無上游修飾的C0E基因片段的PCR擴增結(jié)果；Μ為DL2000 DNA Marker ;1 為無上游修飾的C0E基因片段的PCR擴增； 圖2為C0E基因完整修飾片段的重疊延伸PCR擴增結(jié)果；Μ為DL2000 DNA Marker ;1 為陰性對照；2為C0E基因完整修飾片段的重疊延伸PCR擴增； 圖3為重組大腸桿菌凡co/i MC1061/pNZ8048-C0E的PCR鑒定結(jié)果；Μ為DL2000 DNA Marker ;1為陰性對照；2為重組大腸桿菌凡co/i MC1061/pNZ8048-C0E的PCR鑒定； 圖4為重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E的雙酶切鑒定結(jié)果；Ml為DL5000 DNA Marker;M2為 DL2000 DNA Marker ;1為重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E的雙酶切鑒定； 圖5為重組乳酸乳球菌Z NZ9000/pNZ8048-C0E的PCR鑒定結(jié)果；Μ為DL2000 DNA Marker ;1為陰性對照；2為重組乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-C0E的PCR鑒 定； 圖6為重組乳酸乳球菌培養(yǎng)上清中蛋白的免疫印跡結(jié)果；1為無誘導劑的重組菌培養(yǎng) 上清的免疫印跡結(jié)果；2為終濃度為Ing/mL誘導劑的重組菌培養(yǎng)上清的免疫印跡結(jié)果；3 為終濃度為2ng/mL誘導劑的重組菌培養(yǎng)上清的免疫印跡結(jié)果； 圖7試驗小鼠腸道中特異性IgA抗體水平；NS為生理鹽水對照組簡寫；PEDV+TGEV 為商品化的二聯(lián)弱毒苗組簡寫；NZ9000-C0E為本試驗構(gòu)建的重組乳酸乳球菌Z. hcik NZ9000/pNZ8048-C0E 口服疫苗組的簡寫。

【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科 學用語與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。
[0032] 實施例1含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌的構(gòu)建 S1.分泌型重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E的構(gòu)建 S11.相關(guān)基因序列的密碼子偏好性優(yōu)化與合成：根據(jù)目的基因 PEDV C0E基因的序列 和表達載體PNZ8048的特點，以及為達到高效分泌表達的目的而增加的信號肽序列5PUsp45 和增強序列[(氨基酸序列為：LEISSTCDA，插入位置為Usp45信號肽之后，目的基因 COE之 前，處于中間，位置關(guān)系為：（PnisA :: 5PUsp45 :: LEISSTCDA :: C0E ])，及為便于檢測 添加的His (組氨酸）標簽序列，對整個預期的表達序列在專門的網(wǎng)站(http://Renomes. urv. es/OPTIMIZER)上進行乳酸菌表達密碼子偏好性優(yōu)化，將COE基因420bp的密碼子 優(yōu)化序列采用人工合成的方法送公司進行合成。采用重疊延伸PCR的方法進行信號肽和 增強序列的連接，設(shè)計多條引物 Afcol-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、 COE-His-班/^III-R，其中COE-F為從COE基因第一位開始的部分DNA序列，是為了方便重 疊延伸PCR進行修飾而設(shè)計的；COE-His-班為含有6XHis標簽和班/--/ΙΠ 酶切位 點的下游引物，在歷>/111的5'端加上3個保護堿基CCC，3'端加上反向互補的終止密碼 子CTA，再接6XHis標簽序列;Afcol-Uspl為含有與pNZ8048融合表達的酶切位點Afcol和 信號肽Usp45的5'端最初一段序列的上游引物，Afcol為含有起始密碼子ATG的融合表達 酶切位點，在其5'端加上4個保護堿基CATG，3'端加上兩個調(diào)整讀碼框的堿基AA ;Usp2~5 為信號肽中間段的重疊延伸拼接引物；Usp6-C0E-F為信號肽末段與COE基因起始段拼接處 的引物。同時還設(shè)計了用于重組質(zhì)粒的PCR檢測和測序的引物pNZ 1及pNZ2，是以pNZ8048 空質(zhì)粒的MCS上游和下游70?90bp左右的區(qū)域為依據(jù)設(shè)計的。優(yōu)化合成的C0E基因序列 如 SEQ ID N0 :1 所示；優(yōu)化合成的 AfcoI-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、 COE-His-歷·/7?/III-R、pNZl、pNZ2引物序列分別如SEQIDNO:2?ll所示。
[0033] S12.無上游修飾的C0E基因片段的PCR擴增：以含優(yōu)化合成的C0E基因的質(zhì)粒為 模板，加入高保真0嫩聚合酶？1^11165了41?1&--代111丨1(2\)25 4 1^，1(^]\1的引物〇^-卩、 COE-His-歷各 1 μ L，模板 0· 5 μ L，用 ddH20 補至 50 μ L，PCR 反應程序為：98°C預變 性511^11;981：變性1〇8,551：退火1〇8,721：延伸58,30個循環(huán)；721：后延伸1〇1^11。？0?反 應完成，將產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠觀察與回收，可見大小約450bp的擴增條帶，與預期結(jié) 果一致(如圖1)，回收的產(chǎn)物將作為重疊延伸PCR的模板用于獲得添加了信號肽等修飾序 列的完整片段。
[0034] S13. C0E基因完整修飾片段的重疊延伸PCR擴增過程：以S12中回收的PCR產(chǎn) 物為模板，加入高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix (2X) 25以1^，1(^]?的引物 價〇1州8?1、化？2川8?3、化？4川8?5、化？6-〇^-卩、〇^-把8-班/^111-1?各1以1^，模板0.5 4 1^， 用ddH20補至50 μ L，PCR反應程序為：98°C預變性5min ;98°C變性10s，55°C退火10s，72°C 延伸5s，30個循環(huán)；72°C后延伸10min。PCR反應完成，將產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠觀察與 回收，可見大小約580bp的擴增條帶，與預期結(jié)果一致(如圖2)。
[0035] S14.重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E的構(gòu)建：將S13中回收的PCR產(chǎn)物用Afcol、歷 進行雙酶切處理，膠回收大小約570bp的條帶；以同樣的方法對pNZ8048空質(zhì)粒進行雙酶 切，膠回收大小約3300bp的條帶。分別取4μ L雙酶切后膠回收的C0E基因完整修飾片段 和lyL雙酶切后膠回收的ρΝΖ8048空質(zhì)粒，加入5yL的DNA Ligation Kit高效連接酶 Solution I，混勻后置于4°C條件下連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凡MC1061感受態(tài)細胞， 在含有10 μ g/mL氯霉素（Chloramphenicol, Cm)的LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)兩天，然 后挑取單個菌落，分別接種于含有10 μ g/mL Cm的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振搖培 養(yǎng)3h以上，取菌液進行PCR鑒定。PCR鑒定以待檢菌液為模板，加入DNA聚合酶2XEsTaq MasterMix 10yL，引物 ρΝΖ1、ρΝΖ2 各 0.5yL，模板 0.5yL，用 ddH20 補至 20yL，PCR 反應 程序為：941：預變性51^11;941：變性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸458,30個循環(huán) ；72 1：后 延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可見大小約730bp的擴增條帶，與預 期結(jié)果一致(如圖3)。對檢測陽性的菌液用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒進行質(zhì)粒抽提，并進行雙酶 切鑒定和序列測定，雙酶切后電泳出現(xiàn)約570bp和3300bp兩條目的條帶，并且測序鑒定結(jié) 果與預期一致(如圖4)，即為獲得了重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E。
[0036] S2.含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌的構(gòu)建 S21.乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備：將凍存的Z. hciis NZ9000乳酸乳球菌 劃G-SGM17板復蘇，挑取單個菌落在G-SGM17液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)過夜，以1:100的比例 接入50 mL新的G-SGM17液體培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)，監(jiān)測0D6QQ至0. 2?0. 3,迅速置冰上冷卻， 4°C 6000Xg離心20 min，棄上清；用50 mL預冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重懸菌體，4°C 6000Xg離心20 min，棄上清；用25 mL預冷的0. 5M蔗糖、10%甘油、50mM EDTA溶液重懸菌 體，4°C 6000Xg離心15 min，棄上清；再用15 mL預冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重懸菌 體，4°C 6000Xg離心15 min，棄上清；最后用500 μ?預冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重懸 菌體，即為乳酸乳球菌感受態(tài)細胞，40 μ?每管分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037] S22.乳酸乳球菌的電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定：取3〇μ? Z. hciis NZ9000感 受態(tài)細胞，冰浴上融解，加入1KL PNZ8048-C0E重組質(zhì)粒，輕輕混勻；將以上混合物轉(zhuǎn)入冰 預冷的2mm電激杯，迅速給予一個單脈沖，參數(shù)設(shè)置為2kV，25PF，200 Ω，電擊后立即輕柔加 入lmL冰預冷的恢復培養(yǎng)基G-M17MC，將菌液全部吸入一滅菌離心管，蓋緊管蓋，冰浴5min 后30°C靜置培養(yǎng)1?1. 5h ;將菌液分為10μ?、100μ?、900μ?均勻涂布于G-M17C平板，30°C 靜置培養(yǎng)1?2天。挑取單個菌落，分別接種于G-M17C液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)5h 以上，取菌液進行PCR鑒定，具體操作過程如S14所述，只是模板換成待檢重組乳酸乳球菌 菌液，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可見約730bp的擴增條帶，陽性重組表達菌 命名為 Ζ·^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-〇)Ε (如圖 5)。
[0038] S3.含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌體外誘導表達過程：將Z jaciisNZgOOO/ PNZ8048-C0E重組表達菌以1:100的比例接種于G-M17C液體培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)過夜； 將過夜培養(yǎng)物以1:50的比例接種于10mL G-M17C液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約2. 5h至細菌進 入對數(shù)生長期（0D_=0. 4?0. 6);分為誘導組和不誘導組，誘導組加入1 μ g/mL的誘導劑 (Nisin)至終濃度為1或2 ng/mL，誘導3 h后終止培養(yǎng)，4°C lOOOOrpm離心5min，收集培 養(yǎng)上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳并進行Western Blot分析，結(jié)果顯示，與未誘導組相比，誘導組培 養(yǎng)上清中檢測到17. 38KDa的目的條帶(如圖6)，表明目的基因已經(jīng)得到分泌表達且具有免 疫活性。
[0039] 對比例1含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌的構(gòu)建 以實施例1所述方法構(gòu)建含C0E基因的分泌型重組乳酸乳球菌，唯一不同的是所用的 C0E基因為未經(jīng)密碼子優(yōu)化的C0E基因片段。
[0040] 不同的物種有其偏好性的密碼子，本試驗根據(jù)前人的研究結(jié)果，選取了 z. lactis MG1363來源的NZ9000表達菌，并研究了經(jīng)密碼子優(yōu)化和未經(jīng)密碼子優(yōu)化的COE基因所構(gòu) 建的乳酸乳球菌表達C0E蛋白的效率，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)密碼子優(yōu)化的C0E基因所構(gòu)建的乳 酸乳球菌表達的C0E蛋白表達量低于0. 001ug/mL，而優(yōu)化過的目的基因 C0E在乳酸乳球菌 NZ9000中獲得表達，表達產(chǎn)物占菌體總蛋白的2. 19%。濃度達到0. 62 ug/mL。
[0041] 實施例2乳酸乳球菌在制備PEDV疫苗中的應用 將實施例1制備得到的A hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重組乳酸乳球菌制成一種預防 豬流行性腹瀉的口服疫苗，并研究該疫苗的免疫效果，包括如下步驟： 31.Ζ.^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重組乳酸乳球菌口服疫苗的制備：將 Z. hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重組表達菌以1:100的比例接種于G-M17C液體培養(yǎng)基，30°C 靜置培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物以1:50的比例接種于10mL G-M17液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約 2. 5h至細菌進入對數(shù)生長期，加入1 μ g/mL的誘導劑（Nisin)至終濃度為2 ng/mL，誘導6 h后終止培養(yǎng)，此時的全培養(yǎng)物直接作為口服疫苗使用，采用梯度稀釋涂板法測定重組菌的 濃度達1〇12 CFU/mL數(shù)量級。
[0042] S2.Z jacii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重組乳酸乳球菌作為口服疫苗的使用方法：為 初步研究重組菌的免疫效果，將84只6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為3組飼養(yǎng)，每組28 只，第1組為生理鹽水對照，第2組免疫重組乳酸菌全培養(yǎng)物懸液（即口服疫苗)，第3組免 疫TGEV/PEDV二聯(lián)弱毒苗。預飼一周后，采用灌胃的方式分別于第1天、第14天進行口服免 疫，每次連續(xù)免疫兩天，劑量為160 μ L/只。分別于免疫前及初次免疫后第7、14、21、28、35、 42、49、56天進行樣品采集，每次每組采集3只小鼠，包括外周血血清和腸道樣品，并且在首 次免疫后第21d、第35d還分別采集了外周抗凝血，分離了脾臟細胞，用于不同指標的檢測。
[0043] 以C0E蛋白作為ELISA包被抗原，檢測發(fā)現(xiàn)，重組乳酸菌組試驗小鼠腸道中特 異性IgA抗體水平在第56天達到峰值，高于另外兩組，如圖7,顯示Ζ. /<3----Ζ9000/ PNZ8048-C0E重組菌可以作為誘導腸道局部粘膜免疫的候選疫苗。第35d的外周血⑶8+ Τ 細胞比例顯著高于NS組，高于TGEV/PEDV二聯(lián)弱毒苗組，脾細胞C0E刺激下T淋巴細胞中 ⑶8+細胞比例也最高；第21d脾細胞C0E蛋白刺激培養(yǎng)上清中的IFNY濃度顯著高于NS 組，高于TGEV/PEDV二聯(lián)弱毒苗組；第35d的IFN γ、IL-6濃度顯著高于NS組，高于TGEV/ PEDV二聯(lián)弱毒苗組，顯示Ζ .^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重組菌對于提高機體的細胞免疫 應答也有一定的作用。這些結(jié)果初步證實該重組乳酸菌具有作為口服疫苗的潛力，為開發(fā) 新型口服疫苗預防PED提供了一定的理論基礎(chǔ)。 SEQUENCE LISTING 〈110>華南農(nóng)業(yè)大學 〈120> -種分泌表達PEDV核心抗原COE蛋白重組乳酸乳球菌及其制備方法和應用 <130> <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 420 <212> DNA 〈213>優(yōu)化合成的C0E基因序列 <400> 1 gttactcttc catcatttaa tgatcattca tttgttaata ttactgtttc agctgctttt 60 ggtggtcatt caggtgctaa tcttattgct tcagatacta ctattaatgg tttttcatca 120 ttttgtgttg atactcgtca atttactatt actctttttt ataatgttac taattcatat 180 ggttatgttt caaaatcaca agattcaaat tgtccattta ctcttcaatc agttaatgat 240 tatctttcat tttcaaaatt ttgtgtttca acttcacttc ttgctggtgc ttgtactatt 300 gatctttttg gttatccaga atttggttca ggtgttaaat ttacttcact ttattttcaa 360 tttactaaag gtgaacttat tactggtact ccaaaaccac ttcaaggtgt tactgatgtt 420 〈210〉 2 〈211〉 42 〈212〉 DNA 〈213〉引物 Ncol-Uspl 序列 〈400> 2 catgccatgg aaaagaagaa aattatttca gctattctta tg 42 〈210〉 3 〈211〉 41 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp2序列 〈400〉 3 agctgaaaga ataacagttg acataagaat agctgaaata a 41 〈210〉 4 〈211〉 41 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp3序列 〈400〉 4 caactgttat tctttcagct gctgctccac tttcaggtgt t 41 〈210〉 5 〈211〉 44 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp4序列 〈400〉 5 atctgaatta gtatcagcat aaacacctga aagtggagca gcag 44 〈210〉 6 〈211〉 43 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp5序列 〈400〉 6 atgctgatac taattcagat cttgaaattt catcaacttg tga 43 <210> 7 <211> 44 <212> DNA 〈213> 引物 Usp6-C0E-F 序列 <400> 7 ttaaatgatg gaagagtaac agcatcacaa gttgatgaaa tttc 44 〈210〉 8 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉引物COE-F序列 〈400〉 8 gttactcttc catcatttaa tgatcattca tttgt 35 〈210〉 9 〈211〉 44 〈212〉 DNA 〈213〉引物 COE-His-HindIII-R 序列 〈400〉 9 cccaagcttc tagtggtggt ggtggtggtg aacgtccgtg acac 44 〈210〉 10 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉引物pNZl序列 〈400〉 10 taaacggctc tgattaaatt ctgaa 25 〈210〉 11 〈211〉 22 <212> DNA 〈213> 引物pNZ2序列 <400> 11 gtgctgtaat ttgtttaatt gc 22
【權(quán)利要求】
1. 一種分泌表達豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組乳酸乳球菌的制備方法，其 特征在于，包括以下步驟：
51. 人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化后的C0E基因，設(shè)計多條引物，采用重疊延伸PCR的方法將 Usp45信號肽序列連接到C0E基因上；
52. 將S1獲得的C0E基因連接至pNZ8048并篩選得到重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E ;采用電 轉(zhuǎn)化法將PNZ8048-C0E重組質(zhì)粒導入乳酸乳球菌Z. hciisNZgOOO中，獲得重組乳酸乳球菌 L. 7acii5NZ9000/pNZ8048-C0E ； S1所述經(jīng)密碼子優(yōu)化后的COE基因序列如SEQ IDN0:1所示，各引物序列如SEQ ID NO: 2?9所示；所述篩選重組質(zhì)粒的引物序列如SEQ ID NO :10?11所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組乳酸乳球菌的制備方法，其特征在于，S1所述重疊延伸 ?〇?的反應程序為：981：預變性51^11;981：變性1〇8,551：退火1〇8,721：延伸58,30個循環(huán) ； 72°C后延伸 lOmin。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組乳酸乳球菌的制備方法，其特征在于，S2所述電轉(zhuǎn)化法為： 取Z. hciis NZ9000感受態(tài)細胞，加入pNZ8048-C0E重組質(zhì)粒，混勻并轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯，電擊 后加入恢復培養(yǎng)基，冰浴后靜置培養(yǎng)，平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。
4. 權(quán)利要求1至3任一項所述方法制備得到的重組質(zhì)粒pNZ8048-C0E和重組乳酸菌乳 球菌 Z jac --·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-〇)Ε。
5. 權(quán)利要求4所述重組乳酸乳球菌Z. hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE在制備預防豬流行 性腹瀉口服疫苗中的應用。
6. -種預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將重組 乳酸乳球菌Z .hciisNZgOOO/pNZSCMS-COE接種于G-M17C液體培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)過夜，取過 夜培養(yǎng)物以一定比例接種于G-M17液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細菌進入對數(shù)生長期，加入誘 導劑Nisin至終濃度為1?2 ng/mL，誘導一定時間，誘導后的全培養(yǎng)物直接作為口服疫苗。
7. 權(quán)利要求6所述方法制備得到的預防豬流行性腹瀉的口服疫苗。
【文檔編號】A61P31/14GK104120142SQ201410303777
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】馬靜云, 李智麗, 曾喜多, 魏鐘艷, 孫寶麗, 謝青梅, 畢英佐 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學