脂質(zhì)修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包含脂質(zhì)修飾載體的微針陣列,用于疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)。微針陣列包括基底和若干固定于所述基底的微針；所述基底由糖類、聚維酮類、纖維素類、或淀粉類輔助材料組成；每一微針包含脂質(zhì)A修飾載體、上述輔助材料(賦型劑)和疫苗成分；所述脂質(zhì)A修飾載體為脂質(zhì)體、類脂體、微囊、或納米粒等；疫苗成分主要為病原體抗原蛋白。本發(fā)明相比已有疫苗制劑具有以下優(yōu)點：脂質(zhì)A修飾脂質(zhì)體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)能夠包含不同疫苗成分形成針對不同病原體的疫苗，適用范圍廣；選用可生物降解材料，安全性高；且微針陣列疫苗佐劑系統(tǒng)為固體制劑，穩(wěn)定性高；接種方便，能夠自行完成接種，且通過口腔粘膜接種，能夠避免疫苗隨唾液流失，能夠誘導(dǎo)機(jī)體建立粘膜免疫。
【專利說明】脂質(zhì)修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及預(yù)防感染性疾病的疫苗佐劑領(lǐng)域，尤其涉及新型疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)， 本質(zhì)為采用功能載體構(gòu)建微針陣列，用作疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗是能夠產(chǎn)生抗體的免疫原物質(zhì)，是用于預(yù)防傳染病的制劑。經(jīng)過多年發(fā)展，目 前疫苗從來源上分主要包括如下類型：1)滅活疫苗選用免疫原性好的細(xì)菌、病毒、立克次 體、螺次體等，經(jīng)人工培養(yǎng)，再用物理或化學(xué)方法將其殺滅制成。2)減毒活疫苗用人工定向 誘變方法，或從自然界篩選出毒力減弱或基本無毒的活微生物制成活疫苗。如卡介苗（BCG， 結(jié)核?。?、麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗（小兒麻痹癥）等。3)RNA/DNA疫苗RNA/DNA疫苗是 將蛋白抗原的表達(dá)基因克隆在表達(dá)載體上，注入體內(nèi)，使其抗原在體內(nèi)表達(dá)后激發(fā)機(jī)體產(chǎn) 生免疫反應(yīng)，其制備過程復(fù)雜，安全性較低。4)類毒素（外毒素）細(xì)胞外毒素經(jīng)甲醛處理 后失去毒性，仍保留免疫原性，為類毒素。其中加適量磷酸鋁和氫氧化鋁即成吸附精制類毒 素。5)亞單位疫苗（組分疫苗）除去病原體中無免疫作用甚至有害的成分（尤其是遺傳物 質(zhì)），保留其有效的免疫原性成分制成的疫苗。
[0003] 目前疫苗多通過傳統(tǒng)注射接種，系統(tǒng)免疫誘導(dǎo)效率高；但副作用多，生產(chǎn)成本高， 需專業(yè)接種人員，而無法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答降低了疫苗預(yù)防效率。
[0004] 可溶微針疫苗能高效傳遞Ag，無痛，作用時間較長，使用方便，最近備受矚目；但 目前微針疫苗多為皮膚貼劑，也難以誘發(fā)粘膜免疫；缺乏免疫細(xì)胞特異性傳遞；佐劑功能 弱。
[0005] 相比較而言，粘膜疫苗具有一些明顯優(yōu)勢：1)腔道含有大量粘膜相關(guān)淋巴組織 (MALT)，粘膜接種既能產(chǎn)生系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也能產(chǎn)生廣泛的（接種部位及遠(yuǎn)端）黏膜免疫 應(yīng)答；由于粘膜是病原體入侵主要途徑，因此粘膜免疫能夠?qū)Σ≡w形成二道防線；2)無 機(jī)械損傷，使用方便，消除了注射等器材及其污染，節(jié)省了專業(yè)人員培訓(xùn)費用，易于推廣；3) 生產(chǎn)成本較低。因此人們積極發(fā)展各種粘膜疫苗。
[0006] 口服疫苗使用方便，但需要較大劑量，既增加了成本也容易引起抗原耐受，而胃腸 道苛刻環(huán)境更成為難以逾越的障礙。肺部給藥存在肺囊纖維化危險，輝瑞Exubera? (吸 入胰島素）正因此而撤出市場[29]。鼻腔粘膜富含MALT卻緊鄰中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)，接種 風(fēng)險較高，例如，NasalHu?致部分接種者面癱（Bell's palsy),隨后撤出市場。
[0007] 口腔環(huán)境緩和，利于保持Ag活性；舌下接種能夠產(chǎn)生等同于鼻腔接種的預(yù)防效 果，但不會產(chǎn)生CNS毒性。然而，口腔粘膜被覆復(fù)層鱗狀上皮，且MALT距離接種表面相對較 遠(yuǎn)；而唾液及吞咽也導(dǎo)致Ag大量流失，接種時需麻醉動物，對人來說完全不可行。
[0008] 此外，發(fā)展粘膜疫苗還存在著一些普遍障礙：1)亞單位疫苗Ag被抗原提呈細(xì)胞 (APC)攝取后，一般通過MHC II呈遞，難以產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL)，無法消除侵入細(xì)胞 的病原體；且部分Ag被非APC攝取也降低效率。2)Ag易于接種部位失活。3)不斷分泌的 粘液不但阻礙APC攝取Ag而且流動、更新較快，往往導(dǎo)致疫苗未進(jìn)入機(jī)體即大量流失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有疫苗的不足，提供一種脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣 列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)。
[0010] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] 一種脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，所述微針陣列包括基底 和若干固定于所述基底的微針；每一所述的微針其成分包括脂質(zhì)A修飾載體、輔助材料和 疫苗成分，形成疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)。
[0012] 微針陣列包括基底和若干固定于基底的微針；每一微針其成分包括脂質(zhì)A修飾載 體（包含疫苗成分）及輔助材料（賦型劑）。
[0013] 脂質(zhì)A修飾載體，脂質(zhì)A包括單磷脂A，脂質(zhì)A及脂多糖；載體包括單層、寡層、多 層及多囊脂質(zhì)體，類脂體，微囊，或納米粒；載體體荷正電、負(fù)電或中性。
[0014] 作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述微針陣列的基底橫截面為方形（一般邊長小于 3厘米）或圓形（一般直徑小于3厘米），由糖類、聚維酮類（PVP)、淀粉類、纖維素類、或此 類可生物降解材料（賦型劑）組合構(gòu)成。
[0015] 作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述固定于基底的微針，數(shù)目一般大于3 ;高度為 50-500 μ m ;間距為100-400 μ m ;為椎體或頂端為椎體的柱體，底面直徑范圍為50-500 μ m。
[0016] 作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述疫苗成分選自亞單位疫苗抗原物質(zhì)、類毒素、滅 活或減毒病原體、包含抗原的疫苗載體及疫苗佐劑；所述包含抗原的疫苗載體為載抗原的 脂質(zhì)體（包括單層、多層、多囊脂質(zhì)體）、類脂體、納米?；蛭⒛遥凰鲆呙缱魟橹|(zhì)A、單 磷脂A、LPS (脂多糖）、CpG-ODN、鋁鹽、或菌毛蛋白。
[0017] 作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述疫苗成分或包封于所述脂質(zhì)A修飾載體內(nèi)、或 吸附于所述脂質(zhì)A修飾載體表面；或所述疫苗成分部分包封于所述脂質(zhì)A修飾載體內(nèi)、部 分吸附于所述脂質(zhì)A修飾載體、或與載體簡單混合。
[0018] 作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述的脂質(zhì)A修飾脂質(zhì)體微針陣列疫苗佐劑傳遞系 統(tǒng)通過口腔粘膜接種或皮膚接種。
[0019] 脂質(zhì)A修飾脂質(zhì)體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)的制備過程主要通過聚二甲氧硅 烷微針陣列模具完成。
[0020] (1)先制備脂質(zhì)A修飾載體（或載有疫苗成分）；
[0021] (2)將分散或溶解于溶劑的脂質(zhì)A修飾載體、輔助成分（或包括疫苗成分）填充于 微針陣列模具的針孔內(nèi)，再覆以基底成分；
[0022] (3)將填充后的微針陣列模具在常溫條件下置于干燥皿（含無水氯化鈣、五氧化 二磷等干燥劑）干燥除去水分或通過冰凍干燥除去水分，剝落，得到所述一種脂質(zhì)A修飾載 體微針陣列疫苗。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不同于傳統(tǒng)粘膜疫苗，也不同于已有的微針疫苗（均通 過皮膚接種），本發(fā)明克服二者之短又兼具二者之長；適用于不同病原體抗原的新型微針 陣列疫苗系統(tǒng)，具有以下優(yōu)點：
[0024] (1)適用范圍廣，本發(fā)明的脂質(zhì)A修飾載體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)能夠包含 不同疫苗成分形成針對不同病原體的疫苗；疫苗成分可以是抗原，減毒或滅活病原體；
[0025] (2)穩(wěn)定性高，本發(fā)明的脂質(zhì)A修飾載體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)為固體制劑， 穩(wěn)定性高;MAV可以保護(hù)抗原免遭（接種）環(huán)境物質(zhì)破壞，增強(qiáng)體內(nèi)外穩(wěn)定性；有望能夠成 為脫冷鏈或控溫鏈適用疫苗。
[0026] (3)安全性高，所用材料具有良好生物相容性，包封抗原物質(zhì)獲得亞單位疫苗，具 有較高安全性。
[0027] (4)免疫誘導(dǎo)效力強(qiáng)，脂質(zhì)A修飾載體微針陣列疫苗通過皮膚接種，方便而無痛， 能夠激活皮膚朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cell)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答，防御 病原體入侵；脂質(zhì)A修飾載體微針陣列疫苗通過口腔粘膜接種，能夠避免疫苗隨唾液流失， 也能夠消除口腔粘膜復(fù)層鱗狀細(xì)胞及表面粘液對于疫苗攝取的阻礙作用，提高抗原提呈細(xì) 胞對于疫苗的攝取及利用效率，有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。
[0028] (5)建立多重防御病原體，脂質(zhì)A修飾載體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)通過口腔 粘月旲接種能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，既能夠廣生系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也能夠廣生粘I吳免疫應(yīng)答，對 病原體入侵形成雙重防御屏障。通過皮膚接種，方便而無痛，能夠激活皮膚朗格漢斯細(xì)胞 (Langerhans cell)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答，防御病原體入侵。
[0029] 總之，本發(fā)明的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗（Microneedle Array Vaccine，MAV)，也是一種疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)（VacDAS)，通過荷載不同疫苗成分形成針對不 同病原體的安全、高效、穩(wěn)定的疫苗。本發(fā)明的微針陣列疫苗通過皮膚或口腔粘膜方便、無 痛、順從性良好。尤其是通過粘膜接種，微針陣列疫苗既克服了已有微針疫苗無法誘導(dǎo)粘膜 免疫應(yīng)答的缺陷，又克服了粘膜接種存在的粘液阻礙、成分流失、抗原傳遞效率低等諸多不 足。本發(fā)明的微針陣列疫苗通過皮膚接種，方便而無痛，能夠激活皮膚朗格漢斯細(xì)胞，誘導(dǎo) 機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答，防御病原體入侵。同時這兩種接種形式均較為安全。此外， 由于脂質(zhì)A修飾載體微針疫苗無水，穩(wěn)定性高，有望適用于控溫鏈，有利于普遍接種。本發(fā) 明為微針陣列疫苗探索接種新途徑，為口腔接種探尋新疫苗，也為發(fā)展新型CTC-VacDAS奠 定基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)研究意義和廣泛的臨床應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的脂質(zhì)A修飾載體（以脂質(zhì)體為例）構(gòu)建的微針的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實施方式】
[0031] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實施，給出了【具體實施方式】和操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
[0032] 參見圖1，為本發(fā)明的脂質(zhì)A修飾載體（以脂質(zhì)體為例）構(gòu)建的微針的結(jié)構(gòu)示意 圖。先制備脂質(zhì)A修飾載體用作抗原載體，再以所述載體及賦型劑構(gòu)建微針陣列，形成疫苗 佐劑傳遞系統(tǒng)。
[0033] 【實施例1】
[0034] 〈脂質(zhì)A修飾多層脂質(zhì)體構(gòu)建的微針陣列疫苗（MAV) >
[0035] 以 0VA 為抗原，以 SPC/LA (100:1，mole ratio)為膜材，總脂 /0VA (20:1，mass ratio)，以10%海藻糖、20% PVPk30 (賦型劑）溶液為水相，以薄膜分散法制備脂質(zhì)體，形 成平均粒徑為250納米、ζ電位6mV、包封率為10%的OVA/Lipid A-脂質(zhì)體（0VA/LL)。之 后將LL與磷酸鋁（平均粒徑500納米）混合（1 :5，W/W)，通過減壓填充入由聚二甲氧硅烷 制備的微針陣列模具的（5X5孔）針孔，再覆以10%海藻糖、20% PVPk30(賦型劑）溶液， 再凍干除水，剝脫，獲得OVA/LL-MAV (6 X 6微針，基底0. 65 X 0. 65cm2,固定于基底上每微針： 250 X 250 X 500微米3四方錐針體）。OVA/LL-MAV儲存2周后水化后恢復(fù)HIsAg-MLL，上述 指標(biāo)無顯著變化。OVA/LL-MAV儲存2周后，通過口腔粘膜給小鼠接種，與空白對照相比較， 3周后產(chǎn)生高水平OVA特異性抗體及CTL ;較高的IgGl/IgG2a及高水平IFN-γ，表明接種 鼠產(chǎn)生Thl/Th2混合型免疫應(yīng)答；同時在小鼠唾液、小腸沖洗液、產(chǎn)道沖洗液均檢測到高 水平IgA，表明小鼠既產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也產(chǎn)生了粘膜免疫應(yīng)答。（0VA，卵清蛋白；LPS， 脂多糖；SPC，豆憐脂醜膽喊；LA，lipid A,脂質(zhì) A ;MPC，mannose-PEG2000-cholesterol ; DOTAP，1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-p;ropane，1，2-二油醜基-N, N, N-三甲基-丙 胺；PVPk30,聚維酮）。
[0036] 【實施例2】
[0037] 〈甘露糖基/脂質(zhì)A雙重修飾脂質(zhì)體（荷正電）構(gòu)建的微針陣列疫苗〉
[0038] 以甲型 H1N1 流感病毒（influenza A(H1N1) virus)表面抗原（hemagglutininl antigen, HlsAg)為抗原，以 SPC/MPC/MPLA/DOTAP(20:1:0. 05:1，mole ratio)為膜材，總脂 /HlsAg(20:l，maSS ratio)，以10%海藻糖、20%PVPk30(賦型劑）溶液為水相，以逆向蒸發(fā) 法制備脂質(zhì)體，形成平均粒徑為320納米、ζ電位13mV、包封率為59%的MPC/Lipid A雙 重修飾脂質(zhì)體（MLL)。之后將MLL通過減壓填充入由聚二甲氧硅烷制備的微針陣列模具的 (6X6孔）針孔，再覆以10%海藻糖、20% PVPk30(賦型劑）溶液，再將模具置入無水氯化鈣 干燥皿干燥8小時，剝脫，獲得HIsAg-MLL-MAV (6 X 6微針，基底0. 65 X 0. 65cm2，固定于基底 上每微針：1〇〇Χ 100X3. 14X500/3微米3圓錐體微針）。HlsAg-MLL-MAV儲存2周后水化 后恢復(fù)HI sAg-MLL，上述指標(biāo)無顯著變化。HI sAg-MLL-MAV儲存2周后，通過口腔粘膜給小鼠 接種，與空白對照相比較，3周后產(chǎn)生高水平HlsAg特異性抗體及CTL ;較高的IgGl/IgG2a 及高水平IFN-γ，表明接種鼠產(chǎn)生Thl/Th2混合型免疫應(yīng)答；同時在小鼠唾液、小腸沖洗 液、產(chǎn)道沖洗液均檢測到高水平IgA，表明小鼠既產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也產(chǎn)生了粘膜免疫 應(yīng)答。（HlsAg,甲型H1N1流感病毒表面抗原；SPC，豆磷脂酰膽堿；MPLA，monophosphoryl 11卩1(1八，單憐脂質(zhì)4;]\^:>〇，1]1&1111〇86^^62000-。11〇168七61'〇1;00丁八？，1，2-(1;[016071-3-1：1'；[1116 thylammonium-propane，1，2-二油醜基-N, N, N-三甲基-丙胺；PVPk30,聚維酮）。
[0039] 【實施例3】
[0040]〈脂質(zhì)A修飾多囊脂質(zhì)體構(gòu)建的微針陣列乙肝疫苗〉
[0041]以 HBsAg 為抗原，以 SPC/GM0/LPS(20:4:0. 05，mole ratio)為膜材，總脂 / HBsAg(20:l，maSS ratio)，以10%蔗糖、30% PVPkl7(賦型劑）溶液為水相，以乳化-蒸 發(fā)法制備多囊脂質(zhì)體，形成平均粒徑為520納米、ζ電位-12mV、包封率為72 %的LPS修 飾多囊脂質(zhì)體（LML)。之后將MLL通過減壓填充入由聚二甲氧硅烷制備的微針陣列模具 的（6X6孔）針孔，再覆以10%蔗糖、30%PVPkl7(賦型劑）溶液，再將模具置入無水氯化 鈣干燥皿干燥8小時，剝脫，獲得HBsAg-LML-MAV(8X8微針，基底0. 75X0. 75cm2,固定于 基底上每微針=250X250X 500微米3四方柱針體+250X250X 50/3微米3四方錐針尖）。 HBsAg-LML-MAV儲存3天后水化后恢復(fù)HBsAg-LML，上述指標(biāo)無顯著變化。HBsAg-LML-MA 通過口腔粘膜給小鼠接種，與空白對照相比較，3周后產(chǎn)生高水平HBsAg特異性抗體及CTL ; 較高的IgGl/IgG2a及高水平IFN-γ，表明接種鼠產(chǎn)生Thl/Th2混合型免疫應(yīng)答；同時在小 鼠唾液、小腸沖洗液、產(chǎn)道沖洗液均檢測到高水平IgA，表明小鼠既產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也 產(chǎn)生了粘膜免疫應(yīng)答。（HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原；LPS，脂多糖；SPC，豆磷脂酰膽堿； GL, glycerin,甘油；GMO，glyceryl monooleate，單油酸甘油酯 LA，lipid A,脂質(zhì) A ;MPC， mannose-PEG2000_cholesterol ;D0TAP,1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, 1，2-二油?；?N，N，N-三甲基-丙胺；PVPk30,聚維酮）。
[0042] 【實施例4】
[0043] 〈HlsAg-脂質(zhì)A修飾脂質(zhì)體的微針陣列疫苗〉
[0044] 以 SPC/MPLA/D0TAP(20:0. 05:1，mole ratio)為膜材，以甲型 H1N1 流感病毒 (influenza A(HlNl)virus)表面抗原（HlsAg)、10%海藻糖、20%PVPk30(賦型劑）溶液 為水相，總脂/flu virus (20:1，mass ratio)，以逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，形成平均粒徑 為360、ζ電位13mV、包封率為53%的LL)。之后將flu-LL通過減壓填充入由聚二甲氧 硅烷制備的微針陣列模具的（9X9孔）針孔，再覆以10%海藻糖、20% PVPk30(賦型劑） 溶液，再將模具置入無水氯化鈣干燥皿干燥8小時，剝脫，獲得flu-LL-MAV (9X9微針，基 底0.85X0. 85cm2,固定于基底上每微針：100X 100X3. 14X500/3微米3圓錐體微針）。 flu-LL-MAV儲存2周后水化后恢復(fù)flu-LL，上述指標(biāo)無顯著變化。flu-LL-MAV儲存2周后， 通過貼皮膚給小鼠接種，與空白對照相比較，3周后產(chǎn)生高水平HlsAg特異性抗體及CTL ; 較高的IgGl/IgG2a及高水平IFN- γ，表明接種鼠產(chǎn)生Thl/Th2混合型免疫應(yīng)答。（HlsAg， 甲型H1N1流感病毒表面抗原；SPC，豆磷脂酰膽堿；MPLA，monophosphoryl lipid A,單磷脂 質(zhì) A ;MPC, mannose-PEG2000-cholesterol ;D0TAP,1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-p ropane，1，2-二油酰基-N，N，N-三甲基-丙胺；PVPk30,聚維酮）。
[0045] 【實施例5】
[0046] 〈脂質(zhì)A修飾微囊構(gòu)建的的微針陣列疫苗〉
[0047] 以HlsAg為抗原成分，以明膠/阿拉伯膠/LPS為囊材，采用復(fù)凝聚法制備微囊， 分散于10%海藻糖、20% PVPk30(賦型劑）溶液。之后通過減壓填充入由聚二甲氧硅烷制 備的微針陣列模具的^X6孔）針孔，再覆以10%蔗糖、20% PVPk30溶液，再將模具置入 無水氯化鈣干燥皿干燥10小時；或通過凍干除去水分，剝脫，獲得〇VA-MAW6X6微針，基 底0. 65 X 0. 65cm2,固定于基底上每微針：250 X 250 X 500微米3針體+250 X 250 X 50微米3 針尖）。隨后通過口腔粘膜給予小鼠接種，顯微觀察表明，微針針體能夠刺穿入粘膜。與空 白對照相比較，四周后小鼠產(chǎn)生高水平HlAg特異性抗體及CTL ;同時在小鼠唾液、小腸沖洗 液、產(chǎn)道沖洗液均檢測到高水平IgA，表明小鼠既產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也產(chǎn)生了粘膜免疫 應(yīng)答。接種^1認(rèn)8-10^的小鼠給予致死量甲型!11附流感病毒，1周后100%存活，而未接種 小鼠給予致死量甲型H1N1流感病毒僅存活10 %。
[0048] 【實施例6】
[0049] 〈類脂體佐劑構(gòu)建的微針陣列疫苗〉
[0050] 類脂體（niosome)佐劑-傳遞系統(tǒng)構(gòu)建的MAV :以0VA為抗原，MPLA，Span60/ LA (20:1:0.05:1, mole ratio)為膜材，總脂/HlsAg(20:l, mass ratio)，以 10 %海藻糖、 20% PVPk30 (賦型劑）溶液為水相，以逆向蒸發(fā)法制備類脂體囊泡，形成平均粒徑為300納 米、ζ電位-25mV、包封率為63%的類脂體。之后將類脂體通過減壓填充入由聚二甲氧硅 烷制備的微針陣列模具的（8X8孔）針孔，再覆以10%蔗糖、20% PVPk30(賦型劑）溶液， 再將微針陣列裝置置入無水氯化鈣干燥皿干燥8小時；或通過冷凍-干燥除水，剝脫，獲得 HlsAg-niosome-MAV(8X8 微針，基底 0· 75X0. 75cm2,固定于基底上每微針：250X 250X500 微米3針體+250 X 250 X 50微米3針尖）。HIsAg-niosome-MAV儲存2周后水化后恢復(fù) HlsAg-niosomes，上述指標(biāo)無顯著變化。HlsAg-niosome-MAV儲存2周后，通過口腔粘膜給 小鼠接種，顯微觀察表明，微針針體能夠刺穿入粘膜。與空白對照相比較，四周后小鼠產(chǎn)生 高水平OVA特異性抗體及CTL ;較高的IgGl/IgG2a及高水平IFN-γ，表明接種鼠產(chǎn)生Thl/ Th2混合型免疫應(yīng)答；同時在小鼠唾液、小腸沖洗液、產(chǎn)道沖洗液均檢測到高水平OVA特異 性IgA，表明小鼠既產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也產(chǎn)生了粘膜免疫應(yīng)答。（Span60,司盤60 ;LA， lipid A,脂質(zhì) A)。
[0051] 【實施例7】
[0052] 〈固體脂質(zhì)納米粒佐劑構(gòu)建的的微針陣列疫苗〉
[0053] 以0VA為抗原，以脂質(zhì)A為佐劑，以SPC/GMS/LA為材料，采用乳化-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法 制備固體脂質(zhì)納米粒，總脂/HlsAg(20:1，mass ratio)，分散于10%鹿糖、20% PVPk30 (賦 型劑）溶液，形成平均粒徑為200納米、ζ電位-31mV、包封率為42 %的固體脂質(zhì)納米粒 (SLNs)。之后將SLNs通過減壓填充入由聚二甲氧硅烷制備的微針陣列模具的（10X10 孔）針孔，再覆以10%蔗糖、20% PVPk30(賦型劑）溶液，再將微針陣列模具置入無水氯化 鈣干燥皿干燥8小時；或通過冷凍-干燥除水，剝脫，獲得HlsAg-SLN-MAV (10 X 10微針，基 底0. 85 X 0. 85cm2,固定于基底上每微針：250 X 250 X 500微米3針體+250 X 250 X 50微米 3針尖）。HlsAg-SLN-MAV儲存2周后水化后恢復(fù)HlsAg-niosomes，上述指標(biāo)無顯著變化。 HlsAg-SLN-MAV儲存2周后，通過背部剃毛后皮膚給小鼠接種，顯微觀察表明，微針針體能 夠刺穿入小鼠皮膚表皮。與空白對照相比較，四周后小鼠與空白對照相比較，3周后產(chǎn)生高 水平0VA特異性抗體及CTL ;較高的IgGl/IgG2a及高水平IFN- γ，表明接種鼠產(chǎn)生Thl型 免疫應(yīng)答。（GMS，單硬脂酸甘油酯）。
[0054] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征在于：微針陣列包括基 底和若干固定于基底的微針；每一所述微針其成分包括脂質(zhì)A修飾載體、輔助材料和疫苗 成分，形成疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述的基底由糖類、聚維酮類（PVP)、淀粉類、纖維素類或這些可生物降解材料組合 構(gòu)成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其 特征在于：所述的若干固定于基底的微針，數(shù)目一般大于3 ;高度為50-500μπι ;間距為 100-400 μ m ;為椎體或頂端為椎體的柱體，直徑范圍為50-500 μ m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述的脂質(zhì)A修飾載體，脂質(zhì)A包括單磷脂A，脂質(zhì)A及脂多糖；所述的載體包括單層、 寡層、多層或多囊脂質(zhì)體，類脂體，微囊，或納米粒；載體荷正電、負(fù)電或中性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特 征在于：所述的脂質(zhì)A修飾載體，可以進(jìn)一步采用功能分子修飾，例如以甘露糖基團(tuán)修飾載 體，以達(dá)到提高抗原傳遞目的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述輔助材料為能夠賦予所述微針強(qiáng)度、硬度、形狀的的賦型劑，選用糖類（例如蔗 糖、海藻糖、乳糖等）、PVP類、淀粉類、纖維素類，或這些材料的組合；所述輔助材料也包括 其他疫苗佐劑（例如鋁鹽、CpG-〇DN、CpG-〇DN、皂角苷、角鯊烯、咪喹莫特等及菌毛蛋白等）， 以提高疫苗佐劑功能。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述疫苗成分選自亞單位疫苗抗原物質(zhì)、類毒素、滅活或減毒病原體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述疫苗成分或包封于所述脂質(zhì)A修飾載體內(nèi)，或吸附于所述脂質(zhì)A修飾載體表面， 或為與載體簡單的機(jī)械混合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征 在于：所述的脂質(zhì)A修飾脂質(zhì)體微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)主要通過口腔粘膜接種或皮膚 接種。
10. 權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)A修飾載體構(gòu)建的微針陣列疫苗佐劑傳遞系統(tǒng)，其特征在 于，其制備方法主要依靠采用聚二甲氧硅烷制備的微針陣列反模具實現(xiàn)，包括如下步驟： (1)先制備脂質(zhì)A修飾載體（或載有疫苗成分）； (2) 將分散或溶解于溶劑（水溶液）的脂質(zhì)A修飾載體、輔助成分和疫苗成分填充于微 針陣列模具的針孔內(nèi)，再覆以基底成分（上述輔助材料的水溶液）； (3) 將填充后的微針陣列模具在常溫條件下置于干燥皿（含無水氯化鈣、五氧化二磷 等干燥劑）干燥除去水分或通過冰凍干燥除去水分，剝脫，得到所述脂質(zhì)A修飾微針陣列疫 苗。
【文檔編號】A61P37/04GK104083759SQ201410314283
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】王汀, 王寧 申請人:安徽醫(yī)科大學(xué)