天麻素防治骨質疏松的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了天麻素防治骨質疏松的應用，天麻素對成骨細胞前體細胞無毒性作用，不影響細胞增殖；對過氧化氫造成的MC3T3-E1的凋亡具有保護作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導的氧化應激狀態(tài)；對H2O2造成的MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護作用；可以抑制骨吸收因子的表達，從而通過改善成骨細胞凋亡和分化抑制及間接抑制破骨細胞活化來對骨質疏松起保護作用。在去勢小鼠骨松模型中，天麻素可以改善血清中的氧化應激狀態(tài)，改善股骨遠端和腰椎的松質骨骨微結構，提高股骨遠端的骨生成速率，表明天麻素能夠通過抑制氧化應激而改善骨微結構，發(fā)揮防治骨質疏松的作用。
【專利說明】天麻素防治骨質疏松的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于骨質疏松的防治【技術領域】，涉及天麻素防治骨質疏松的應用。

【背景技術】
[0002]骨質疏松癥(osteoporosis，0P)是退行性、全身性、代謝性骨骼疾病，是由多種病因導致的骨組織骨量丟失、結構改變和生物力學性能減退，容易發(fā)生骨折，嚴重威脅中老年人的身心健康。
[0003]氧化應激(oxidative stress)是機體內高活性物質如R0S(Reactive oxygenspecies)產生過多，超出了機體的清除能力，導致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。生理范圍內的ROS在調節(jié)人體正常的功能如細胞凋亡、基因表達、信號轉導等方面起著重要的作用。然而，高濃度的ROS可以導致核酸、蛋白質、脂質產生氧化反應，損害細胞的結構和功能，弓丨起疾病的發(fā)生。
[0004]近年來，研究發(fā)現氧化應激在骨質疏松發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過量氧自由基(ROS)的產生可以抑制骨髓基質干細胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨細胞(OB)凋亡，促進破骨細胞(OC)活化和功能增強，導致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結構改變和骨量降低。
[0005]天麻是一種具有高度生物活性的藥用植物，廣泛應用于傳統(tǒng)中藥中。天麻素(gastrodin)是其主要活性成分，天麻的大部分功效是通過天麻素發(fā)揮的。天麻素具有多項生理功能:松弛肌肉、抗凋亡、神經保護和抗氧化等。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供天麻素防治骨質疏松的應用。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案:
[0008]天麻素在制備用于防治骨質疏松的藥物中的應用。
[0009]含天麻素的植物提取物在制備用于防治骨質疏松的藥物中的應用。
[0010]天麻素在制備用于改善成骨細胞前體細胞氧化應激狀態(tài)的藥物中的應用。
[0011]天麻素在制備用于抗成骨細胞前體細胞凋亡的藥物中的應用。
[0012]天麻素在制備用于抗成骨細胞前體細胞分化抑制的藥物中的應用。
[0013]天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中ALP活性的藥物中的應用。
[0014]天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中促成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達水平的藥物中的應用。
[0015]天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中抑制RANKL和IL_6水平的藥物中的應用。
[0016]天麻素的給藥量至少為lmg/kg。
[0017]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:
[0018]天麻素對成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)無毒性作用jiMC3T3_El的凋亡具有保護作用；并且可以改善氧化應激狀態(tài)J^MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護作用；可以抑制骨吸收因子的表達。在去勢小鼠模型中，天麻素可以改善血清中的氧化應激狀態(tài)，改善股骨遠端和腰椎的松質骨骨微結構，提高股骨遠端的骨生成速率。
[0019]MC3T3-E1細胞是研究成骨細胞生長、分化的較常用的細胞模型，鑒于天麻素對MC3T3-E1的作用，其對成骨細胞具有保護作用，促進骨形成，并通過抑制骨吸收因子來抑制破骨細胞的活化，降低骨吸收，最終起到防治骨質疏松的作用。卵巢切除小鼠模型為常用的絕經后骨松模型，通過連續(xù)腹腔注射給與不同劑量天麻素，明顯改善了血清氧化應激狀態(tài)，對松質骨骨微結構有保護作用，表明其能夠發(fā)揮預防及治療絕經后骨松的作用。
[0020]天麻素為純天然物質，用藥較安全，毒副作用小。
[0021]因此，天麻素可應用于骨質疏松的防治，尤其是應用在防治骨質疏松藥物的制備中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1-1為不同濃度天麻素對細胞增殖作用的影響。
[0023]圖1-2為天麻素對H2O2造成的細胞凋亡的保護作用。
[0024]圖2為天麻素改善細胞氧化應激ROS水平的檢測結果。
[0025]圖3-1為天麻素在H2O2作用后，對細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的作用。
[0026]圖3-2為天麻素在H2O2作用后，對細胞基質鈣鹽沉積的作用。
[0027]圖3-3為天麻素對4種細胞成骨分化基因表達水平的影響。
[0028]圖4A和圖4B為天麻素在H2O2作用后對兩種骨吸收因子RANKL和IL_6表達的影響。
[0029]圖5-1A和圖5-1B為天麻素改善小鼠血清中氧化應激指標MDA和GSH水平的檢測結果。
[0030]圖5-2為天麻素改善OVX小鼠股骨遠端和第四腰椎松質骨骨微結構的Micro-CT結果。
[0031]圖5-3為天麻素提高OVX小鼠股骨遠端的骨生成速率的檢測結果。

【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0033]MC3T3-E1為成骨細胞前體細胞系，可以向成骨細胞進行分化，是研究成骨細胞生長、分化的較常用的細胞模型，過氧化氫(H2O2)處理也是較常用的體外氧化應激模型，出于觀察天麻素對成骨細胞凋亡和分化的影響，及其抗氧化損傷的作用，所以選擇MC3T3-E1作為細胞模型，H2O2處理為體外氧化應激模型。卵巢切除(去勢)小鼠模型作為動物模型，是常用的模擬婦女絕經后骨松模型。
[0034]1、天麻素對氧化應激導致MC3T3-E1凋亡的保護作用
[0035]1.1單純天麻素對細胞的毒性作用
[0036]將MC3T3-E1細胞以2 X 13個/mL接種到96孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為:a -MEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素))，加含濃度O (空白對照組)、0.1、1、10 μ M天麻素的無血清培養(yǎng)基至孔板中，分別培養(yǎng)24h、48h和72h，觀察天麻素對細胞增殖作用的影響。在觀察點，利用MTT法對細胞活性進行檢測。
[0037]結果如圖1-1所示，橫坐標為不同濃度的天麻素作用時間，縱坐標為細胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，不同濃度的天麻素在觀察時間內，對細胞的增殖并無明顯影響。
[0038]1.2天麻素對氧化應激導致MC3T3-E1凋亡的保護作用
[0039]分組情況:空白對照組；單純H2O2處理組；0.I μ M天麻素+H2O2 ；1 μ M天麻素+H2O2 ；10 μ M 天麻素 +H2O2。
[0040]將MC3T3-E1細胞以2 X 13個/mL接種到96孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加含濃度O、0.1、1、10 μ M天麻素的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)24h，加入H2O2 (300 μ M)，再培養(yǎng)24h，利用MTT法進行細胞活性檢測。
[0041]結果如圖1-2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為細胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2作用后，細胞活性降低，經不同濃度天麻素作用后細胞活性增加，同單純H2O2處理組相比，具有統(tǒng)計學差異。圖中的#號表示:同空白對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05，< 0.01。這表明用天麻素處理后能夠保護氧化應激導致MC3T3-E1的凋亡。
[0042]綜上所述，經天麻素對MC3T3-E1細胞作用，即不同濃度天麻素對細胞進行預處理，然后施加H2O2干預，通過MTT細胞活性檢測，結果表明單純H2O2作用可以導致細胞活性降低，造成細胞凋亡，而0.1、1、10μΜ天麻素預處理，對這種損傷具有保護作用。因此，天麻素對H2O2誘導的氧化應激導致的細胞凋亡具有保護作用。
[0043]2、天麻素抗氧化作用檢測
[0044]MC3T3-E1細胞鋪滿后，在天麻素和/或H2O2作用下，處理方法同上(1.2中)，進行氧化應激相關檢測。
[0045]根據ROS檢測試劑盒，利用熒光探針DCFH-DA對細胞內的活性氧進行檢測。細胞爬片，0.1、1、10 μ M天麻素預處理24h，300 μ M H2O2作用24h，然后進行原位裝載探針，加入10 μ M DCFH-DA,孵育20min，用a -MEM培養(yǎng)液洗3次，去除未結合的探針，利用熒光酶標儀進行檢測。
[0046]結果如圖2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為ROS生成，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，細胞內的ROS水平升高很明顯，而0.1、1、10μΜ天麻素預處理后,細胞內的ROS水平降低。圖中的#號表示:同空白對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2處理組相比，*Ρ < 0.05，#Ρ < 0.01。因此，天麻素可以改善細胞氧化應激ROS水平。
[0047]3、天麻素對氧化應激造成MC3T3-E1成骨分化抑制的保護作用
[0048]天麻素對氧化應激造成MC3T3-E1成骨分化抑制的保護作用:實驗分組同上(1.2中)，將細胞鋪于6孔板上，鋪滿后，加入地塞米松0.1uM, 1mM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進行成骨誘導培養(yǎng)。在6和14天，給予0.1、1、10μΜ天麻素預處理24h，然后加入300 μ M H2O2 處理 24h。
[0049]3.1根據堿性磷酸酶定量試劑盒(上海杰美)進行ALP定量，收集細胞，裂解后，提取蛋白。測定蛋白濃度，然后根據試劑盒的說明，進行ALP定量檢測。
[0050]結果如圖3-1所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為ALP活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。單純H2O2作用后，細胞ALP活性表達同空白對照組相比顯著下降，天麻素作用后，ALP活性表達升高，同單純H2O2作用組相比具有統(tǒng)計學差異，并呈劑量依賴性。圖中的#號表示:同空白對照組相比，#P<0.05,##P<0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05，#P < 0.01。ALP為成骨細胞分化中期的關鍵表達蛋白，為檢測成骨細胞分化的特異性指標，氧化應激導致ALP活性降低，對成骨分化為抑制作用，但經天麻素作用后，ALP表達增加，改善了氧化應激對細胞成骨分化的抑制作用。
[0051]3.2鈣化結節(jié)染色:用PBS沖洗培養(yǎng)細胞，多聚甲醛固定后，I %茜素紅染色30min，用水沖洗5次，倒置顯微鏡下觀察鈣結節(jié)沉積。
[0052]分組情況:①空白對照組；②單純H2O2處理組過0.1 μ M天麻素+H2O2 ;(D I μ M天麻素 +H2O2 ； (5) 10 μ M 天麻素 +H2O2。
[0053]結果如圖3-2所示，單純H2O2作用后鈣化結節(jié)形成較少，但是天麻素預處理后，結節(jié)面積有增加。鈣結節(jié)形成為成骨分化的礦化階段，氧化應激可以抑制成骨細胞分化，而天麻素可以通過改善氧化應激來改善成骨分化。
[0054]3.3成骨基因的RT-PCR檢測:實驗分組同上(1.2中)，將細胞鋪于6孔板上，鋪滿后，加入0.1uM地塞米松，1mM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進行成骨誘導培養(yǎng)。6天后，給予0.1、1、10 μ M天麻素預處理24h，然后加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細胞，提取細胞內的mRNA，根據實時定量RT-PCR的程序，對目的基因Alp、Collal、0cn及Opn進行定量檢測。
[0055]結果如圖3-3所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為mRNA的相對表達水平，以各組相對于空白對照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用后，細胞成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達水平下降，天麻素作用后，可以顯著促進成骨基因表達。圖中的#號表示:同空白對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2處理組相比，*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。Alp、CollaU Ocn及Opn基因分別為成骨細胞分化中期和后期的關鍵基因，決定著細胞的分化水平。H2O2抑制成骨分化基因的表達，而天麻素作用后，成骨分化基因表達有上調，說明天麻素可以改善H2O2導致的成骨細胞分化抑制。
[0056]4、天麻素對骨吸收因子的表達影響
[0057]天麻素對氧化應激刺激骨吸收因子增加的抑制作用:分組同上(1.2中)，將細胞鋪于6孔板上，鋪滿后，進行成骨誘導培養(yǎng)，6天后，給予天麻素處理，然后加入H2O2,裂解細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，根據酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測RANKL和IL-6的表達情況。
[0058]結果如圖4所示(其中圖4Α為RANKL的檢測結果，圖4Β為IL_6的檢測結果)，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為骨吸收因子的相對表達量，以各組相對于空白對照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用后，細胞表達的RANKL和IL-6水平增加，天麻素預處理可以抑制骨吸收因子的表達。圖中的#號表示:同空白對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05, #P < 0.01。RANKL和IL-6為成骨細胞分泌的細胞因子，可以活化破骨細胞，進而引起骨吸收增強，導致骨量降低，因此，天麻素可以通過抑制RANKL和IL-6的表達，來抑制破骨細胞的活化，進而減少骨量的丟失。
[0059]綜合以上表明:天麻素對成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)無毒性作用，不影響細胞增殖；對H2O2造成的成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)的凋亡具有保護作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導的氧化應激狀態(tài)；對H2O2造成的MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護作用；可以抑制骨吸收因子的表達，從而通過改善成骨細胞凋亡和分化抑制間接抑制破骨細胞活化來對骨質疏松起保護作用。
[0060]5.動物骨松模型的建立
[0061]40只8周大BALB/c雌性小鼠，體重為20_22g。本實驗中四組小鼠的初始體重無統(tǒng)計學差異。在切除卵巢前，先將它們置于實驗室條件下I周(即通氣良好的20°C恒溫環(huán)境中，每12小時光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)。適應I周后，用戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)進行麻醉,小鼠被切除卵巢(去勢，η = 30)或者假手術(η = 10)。卵巢切除是通過背側入路切除雙側卵巢。假手術意味著手術找到雙側卵巢，但不切除，直接縫合關閉切口。小鼠被隨機分為四組:不處理組(假手術組，Sham);不處理組(單純卵巢切除組，0VX);低劑量天麻素給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予lmg/kg體重的天麻素溶液，OVX+Gastrodind));高劑量天麻素給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予10mg/kg體重的天麻素溶液，OVX+Gastrodin (10))。天麻素溶解于去離子水中，通過腹腔注射對不處理組小鼠注射同體積去離子水。手術后I周開始給藥，連續(xù)給藥12周時間。給藥完成后，麻醉下通過心臟采血獲得血液標本，并進行離心。提取每只小鼠的左側股骨和第四腰椎，清除粘連的肌肉組織，妥善固定。
[0062]5.1使用脂質過氧化物MDA檢測試劑盒檢測各組血液樣本。在脂質過氧化過程中硫代巴比妥酸與MDA結合生成顯色復合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶標儀在此處讀數。同樣，使用GSH檢測試劑盒檢測各組血液樣本。GSH的檢測是根據GSH與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應形成一個產物，此產物通過酶標儀在412nm處讀數檢測。
[0063]結果如圖5-1A和圖5-1B所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標分別為MDA活力和GSH活力，以各組的吸光度OD值同假手術組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，血清中的MDA水平明顯升高，GSH水平明顯降低；而給予高、低劑量天麻素處理后，血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。圖中的#號表示:同假手術組相比，#Ρ〈0.05，##Ρ〈0.01 ;圖中的*號表示:同單純卵巢切除組相比，*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。因此，天麻素可以改善血清中的氧化應激狀態(tài)。
[0064]5.2顯微CT檢測骨微結構:第四腰椎和股骨遠端的骨微結構通過探索軌跡SP預臨床標本顯微CT進行檢測。分辨率為8mm,管電壓為50kV,管電流為0.1mA。通過一個桌面顯微CT處理軟件進行重建和3D定量分析。所有標本的掃描環(huán)境和分析方法相同。股骨掃描區(qū)域限定為遠端干垢端，并且向近端的初級松質近末端區(qū)域延伸2.0mm0在排除了顱骨及尾終板區(qū)后，椎體的松質骨區(qū)域被包含在每一個顯微CT選區(qū)中。在這些待掃描的區(qū)域中，松質骨與皮質骨的分界為內皮質骨面。選定的感興趣區(qū)的3D參數用于數據分析，包括:骨礦物質密度、連接密度、結構模型指數、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對骨體積分數。進行掃描分析的操作者對標本的處理過程單盲。
[0065]結果如圖5-2所示，分組:a:假手術組；b:單純卵巢切除組；c:卵巢切除+天麻素(lmg/kg) ；d:卵巢切除+天麻素(10mg/kg)。相對于假手術組，卵巢切除導致了小鼠松質骨骨微結構的損害，表現為骨礦物質密度、連接密度、骨小梁數量、骨小梁厚度及相對骨體積分數的下降。同時，卵巢切除后結構模型指數和骨小梁分離度明顯提高。結果具有統(tǒng)計學差異。然而，高、低劑量天麻素給藥明顯逆轉了卵巢切除引起的骨微結構參數的變化趨勢，起到保持第四腰椎及股骨遠端小梁骨骨量的作用。因此，天麻素能夠對絕經后骨質疏松發(fā)揮預防及治療作用。
[0066]5.3突光素雙標記法檢測骨生成速率(bone format1n rate):在小鼠處死前的第12天和第2天分別肌肉注射四環(huán)素(20mg/kg)和鈣黃綠素(5mg/kg)來進行熒光素標記。處死小鼠后取左側股骨，依次進行固定、脫水、包埋和切片(ΙΟμπι)。在放大200倍條件下，測定四環(huán)素標線與鈣黃綠素標線間的距離。得到平均距離后，再除以天數，即可確定骨生成速率。
[0067]結果如圖5-3所示，所有組中，新生骨被標記上了四環(huán)素和鈣黃綠素熒光。相對于假手術組，單純卵巢切除組的骨生成速率明顯降低。然而，高、低劑量天麻素處理后，骨生成速率明顯升高。綜上，天麻素能夠通過提高骨生成速率而起到保護松質骨骨微結構的作用。
[0068]因此，天麻素可應用于骨質疏松的防治，尤其是在防治骨質疏松藥物的制備中應用。
[0069]而天麻素是天麻中主要活性成分之一，那么含有天麻素的天麻提取物也具有相應的應用。
【權利要求】
1.天麻素在制備用于防治骨質疏松的藥物中的應用。
2.含天麻素的植物提取物在制備用于防治骨質疏松的藥物中的應用。
3.天麻素在制備用于改善成骨細胞前體細胞氧化應激狀態(tài)的藥物中的應用。
4.天麻素在制備用于抗成骨細胞前體細胞凋亡的藥物中的應用。
5.天麻素在制備用于抗成骨細胞前體細胞分化抑制的藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中ALP活性的藥物中的應用。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中促成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達水平的藥物中的應用。
8.如權利要求5所述的應用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細胞前體細胞中抑制RANKL和IL-6水平的藥物中的應用。
9.如權利要求1?8中任意一項所述的應用，其特征在于，天麻素的給藥量至少為lmg/kg0
【文檔編號】A61P19/08GK104127425SQ201410314697
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權日:2014年7月3日
【發(fā)明者】孟國林, 黃強, 高博, 楊柳, 羅卓荊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學