腫瘤抑制因子cylindromatosis在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種腫瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）在治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用。通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)的模型研究CYLD基因的功能，發(fā)現(xiàn)與野生型C57小鼠對(duì)比，CYLD基因敲除小鼠的體重、空腹血糖水平均高于對(duì)照組WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYLD基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯減弱；從小鼠肝臟大體外觀、肝臟重量、肝臟/體重比值以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說(shuō)明HFD組的CYLD-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加，這些結(jié)果表明A20基因敲除顯著惡化脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。針對(duì)CYLD的上述作用，其可用于制備治預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物。
【專利說(shuō)明】腫瘤抑制因子cy I i ndromatos i s在治療脂肪肝和II型糖尿病中的功能和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤抑制因子cylindromatosis (CYLD)在治療脂肪肝、II型糖尿病中的功能和應(yīng)用，以及CYLD作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和II型糖尿病疾病的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是嚴(yán)重危害人民健康的代謝性疾病，已經(jīng)成為全球的第三大非傳染性疾病。世界衛(wèi)生組織按糖尿病病因和發(fā)病機(jī)制將其大致分為I型糖尿病、II型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。II型糖尿病又稱非胰島素依賴型糖尿病，約占糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上。II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，胰島β細(xì)胞功能障礙與胰島素抵抗被公認(rèn)為是II型糖尿病發(fā)病的兩個(gè)重要機(jī)制。
[0003]糖尿病疾病本身，同時(shí)加上它可怕的且不易逆轉(zhuǎn)的并發(fā)癥對(duì)患者的生活質(zhì)量和生命健康影響極大，也是當(dāng)前臨床與研究界的重要難題。糖尿病慢性并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘的主要原因，不僅累及心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等重要臟器和組織，肝臟也是其重要的靶器官之一。肝臟是糖代謝最主要的器官之一，是物質(zhì)代謝的中樞，它具有許多重要的生理功能，如葡萄糖的合成和分解，脂質(zhì)合成和分解，膽汁合成和分泌等。肝臟是人體生化工廠，脂質(zhì)由肝臟合成和輸出。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，發(fā)生肝臟病變的危險(xiǎn)性及其病變程度也隨之增加。糖尿病性肝損傷是指糖尿病引起的肝臟組織學(xué)和功能變化，是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥。糖尿病的早期診斷，防治糖尿病慢性并發(fā)癥對(duì)減輕患者負(fù)擔(dān)尤為重要。
[0004]腫瘤抑制因子cylindromatosis (CYLD)是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,這個(gè)基因可編碼含3個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)甘氨酸蛋白保守結(jié)構(gòu)域(CAP-GLY)，具有去泛素化酶活性。多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤等基因突變和CYLD有關(guān)聯(lián)。CYLD在經(jīng)典的NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，影響炎癥、免疫反應(yīng)及腫瘤的形成，參與多種皮膚病的發(fā)生發(fā)展，在細(xì)胞的分裂及遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一員，TRAF2如果發(fā)生Lys48相互連接的多聚泛素化，則導(dǎo)致其自身的降解；如果發(fā)生Lys63相互連接的多聚泛素化，則能開(kāi)啟NF- κ B的下游信號(hào)通路。CYLD很可能是通過(guò)把TRAF2上Lys63相互連接的多聚泛素鏈去掉，而在NF- κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起負(fù)調(diào)節(jié)物的作用，阻止下游信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)(I)。CYLD與肝癌患者中癌癥細(xì)胞的發(fā)展有密切關(guān)系(2，3);乳腺癌患者中CYLD的表達(dá)明顯下調(diào)，是通過(guò)激活NF-κ B從而促進(jìn)促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移(4) ；CYLD可通過(guò)抑制NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)性調(diào)控艾滋病病毒轉(zhuǎn)錄(5) ；CYLD和微管相關(guān)末端結(jié)合蛋白I相互作用，可共同調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞遷移(6);CYLD在調(diào)控紡錘體有絲分裂和細(xì)胞分裂的方向，以及在健康和疾病方面發(fā)揮重要作用(J)。
[0005]參考文獻(xiàn):
1.徐德立。一種新的腫瘤抑制因子Cylindromatosis。細(xì)胞生物學(xué)雜志ChineseJournal of Cell B1logy 2004.26:591-93.2.Kinoshita H, et al.(2013) CYLD downregulat1n is correlated withtumor development in patients with hepatocellular carcinoma.Mol Clin Oncol.1(2):309-314.3.Pannem RR, et al.(2014) CYLD controls c-MYC express1n through theJNK—dependent signaling pathway in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis.35(2):461-8.4.Hayashi M, et al.(2013) Clinical significance of CYLD downregulat1n inbreast cancer.Breast Cancer Res Treat.143 (3):447-57.5.Manganaro L, et al.(2014)Tumor Suppressor Cylindromatosis (CYLD) ControlsHIV Transcript1n in an NF-κ B-Dependent Manner.J Virol.88(13):7528-7540.6.Li D, et al.(2014) CYLD coordinates with EBl to regulate microtubuledynamics and cell migrat1n.Cell Cycle.13 (6):974-83.7.Yang Y, et al.(2014) CYLD regulates spindle orientat1n by stabilizingastral microtubules and promoting dishevelled-NuMA-dynein/dynactin complexformat1n.Proc Natl Acad Sci US A.1ll (6):2158-63。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種CYLD基因的表達(dá)與脂肪肝、II型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療脂肪肝、II型糖尿病的靶基因CYLD的新用途，進(jìn)而把CYLD基因應(yīng)用于脂肪肝、II型糖尿病的治療。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明以野生型C57小鼠與CYLD基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(diet induced obesity, D10)模型研究CYLD基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對(duì)比，CYLD基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且CYLD基因敲除小鼠的體重及空腹血糖水平均高于對(duì)照組WT小鼠，CYLD基因敲除小鼠的肝功能明顯差于WT小鼠。進(jìn)一步通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYLD基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟大體外觀，肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說(shuō)明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的CYLD KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明CYLD基因敲除會(huì)加劇脂肪肝、II型糖尿病的發(fā)生，CYLD基因能夠改善脂肪肝、II型糖尿病的發(fā)生。
[0008]一種CYLD基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病中的功能，具體體現(xiàn)在CYLD具有維持糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善脂肪肝、II型糖尿病的功能。
[0009]針對(duì)CYLD的改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，CYLD可在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物方面應(yīng)用。
[0010]一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，包含CYLD。
[0011]針對(duì)CYLD的改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，CYLD可在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物方面應(yīng)用。
[0012]一種預(yù)防、緩解和/或治療糖尿病的藥物，包含CYLD。
[0013]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CYLD基因的新功能，即CYLD基因具有能夠改善脂肪肝、II型糖尿病疾病的作用。
[0014](2)基于CYLD在改善脂肪肝、II型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、II型糖尿病的藥物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是WT和CYLD-KO小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖(*:P < 0.05 vs WT NC 組，#:p < 0.01 vs WT NC 組，#:p < 0.05 vsWT HFD 組，##:p < 0.01 vs WT HFD 組)。
[0016]圖2是WT和CYLD-KO小鼠通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；A為通過(guò)腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under thecurve, AUC)比較圖(**:p < 0.01 vs WT NC 組，##:p < 0.01 vs WT HFD 組)。
[0017]圖3是CYLD-KO和WT小鼠的肝臟大體外觀結(jié)果圖；A為肝臟大體結(jié)果圖，B為肝臟重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖(## Φ < 0.01 VS WT HFD組)。
[0018]圖4是WT和CYLD-KO小鼠的HE和油紅O染色圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0020]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng):
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來(lái)源:C57BL/6 (WT)小鼠和CYLD-KO小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司；CYLD基因敲除小鼠(CYLD-K0，購(gòu)自European Mouse Mutant Archive (EMMA),貨號(hào):EMMA07405)。
[0021]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方:高脂飼料(High fat diet, HFD)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942):熱量百分比:蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%，脂肪60% ;總的熱量質(zhì)量比5.24kcal/g。低脂飼料(Normal chow,NC)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B):熱量百分比:蛋白質(zhì)20%，碳水化合物70%，脂肪10% ;總的熱量質(zhì)量比3.85kcal/g°
[0022]動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)=SYXK(鄂):2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2°C，濕度40-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食。
[0023]實(shí)施例1小鼠脂肪肝、II型糖尿病模型(diet induced obesity, D1)獲得 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:選用8周齡，雄性，WT小鼠和CYLD-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料 D12942 高脂飼料(High fat diet，HFD)和 D12450B 低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。
[0024](2)模型通過(guò)高脂飼料誘導(dǎo)操作流程:
采用WT和KO小鼠，建立D1模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確CYLD基因?qū)χ靖巍I型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和CYLD-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942 高脂飼料(Highfat diet, HFD)和 D12450B 低脂飼料(Normal chow, NC)飼養(yǎng)，即 WTNC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測(cè)I次。實(shí)驗(yàn)第14周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力。第16周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或0.C.T冰凍切片包埋劑(Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用。
[0025]實(shí)施例2小鼠體重、血糖水平測(cè)定 (I)小鼠空腹體重，食量檢測(cè)
O體重檢測(cè)。
[0026]①禁食:上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。
[0027]②稱重:分別在第O周、4周、8周、12周、16周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測(cè)量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測(cè):待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動(dòng)態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。
[0028](2)空腹血糖水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時(shí)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。
[0029]①血糖儀準(zhǔn)備:檢查血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司，0NET0UCH)電池，按右側(cè)開(kāi)關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測(cè)狀態(tài) 。
[0030]②固定小鼠:右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。
[0031]③剪尾:眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。
[0032]④血糖檢測(cè):將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙,血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。
[0033]II型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開(kāi)始體重明顯高于其NC飼料組，給與CYLD-KO小鼠16周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開(kāi)始HFD組的CYLD-KO小鼠體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第16周(見(jiàn)圖1A);經(jīng)空腹血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第4周、8周、12周、16周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，HFD組的CYLD-KO小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT組小鼠空腹血糖水平(見(jiàn)圖1B)。表明CYLD基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，CYLD基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明CYLD基因在高脂誘導(dǎo)引起的II型糖尿病中起到重要作用。
[0034]實(shí)施例3 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 實(shí)驗(yàn)第14周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。
[0035](I)在測(cè)血糖之前，先測(cè)量小鼠的空腹體重，根據(jù)10 μ L/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。
[0036](2)先檢測(cè)葡糖糖注射前即O分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測(cè)完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。
[0037](3)腹腔注射操作方法:①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無(wú)名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射:從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過(guò)腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。
[0038](4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測(cè)小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測(cè)時(shí)間。
[0039]進(jìn)一步通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucosetolerancetests, IPGTT)來(lái)評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第14周,通過(guò)注射
1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和CYLD-KO小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(O分鐘時(shí)血糖)，在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且CYLD-KO小鼠血糖水平從O分鐘至2小時(shí)一直處于高于WT小鼠的血糖水平(圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve, AUC),發(fā)現(xiàn) WT 小鼠 HFD 組的 AUC 顯著高于 NC 組,CYLD-KO HFD 組的AUC顯著大于WT HFD組的AUC (圖2B)，表明CYLD對(duì)維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的調(diào)控能力。
[0040]實(shí)施例4肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測(cè)定
(I)終末肝臟組織取材
O小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤(rùn)濕。
[0041]2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開(kāi)皮膚至劍突下，向尾端剪開(kāi)皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開(kāi)腹腔，充分暴露各臟器。
[0042]3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱重。
[0043]4)石蠟標(biāo)本:切取部分肝臟置于10%中性福爾馬林中固定。冰凍標(biāo)本:切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。
[0044]2.肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實(shí)驗(yàn) I)肝臟脫水，透明，浸蠟
切取10%中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標(biāo)記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機(jī)器上設(shè)置以下程序，①脫水:75%酒精(45分鐘)一75%酒精(45分鐘)一85%酒精(45分鐘)一85%酒精(45分鐘)一95%酒精(45分鐘)一95%酒精(45分鐘)一無(wú)水酒精(I小時(shí))一無(wú)水酒精(I小時(shí))；②透明:二甲苯(I小時(shí))一二甲苯(I小時(shí))；③浸蠟(65°C):石蠟(I小時(shí))一石蠟(I小時(shí))。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進(jìn)機(jī)器籃筐內(nèi)，啟動(dòng)上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時(shí)清洗機(jī)器備用。
[0045]2)肝臟組織切片
使用切片機(jī)切片(切片厚度5 μ m)。
[0046]3 )肝臟組織蘇木精-伊紅(HE )染色
將肝臟組織石蠟切片放入65°C烘箱(30分鐘)一二甲苯中(5分鐘X3次)一100%酒精(I分鐘)一90%酒精(I分鐘)一70%酒精(I分鐘)一蒸餾水洗一蘇木素(5分鐘)一自來(lái)水洗去切片上的浮色一1%鹽酸酒精(I至3秒)一自來(lái)水洗數(shù)下一Scott促藍(lán)液(碳酸氫鈉
0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水10mL) (I分鐘)一自來(lái)水洗數(shù)下一伊紅(I分鐘)一蒸餾水洗去切片上的浮色一70%酒精一下一90%酒精一下一100%酒精(30秒X3次)一二甲苯(2分鐘X 3次)一在二甲苯未干時(shí)封片，拍照。
[0047]4)肝臟組織油紅O染色
①將冰凍肝臟組織切片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干30分鐘，4%多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。
[0048]②以60%異丙醇處理I分鐘。
[0049]③用油紅O (公司sigma，貨號(hào)00625，濃度0.5克/10mL 100%異丙醇)染色30分鐘。
[0050]④之后以60%異丙醇漂洗I分鐘X 3次，直至背景干凈。
[0051]⑤用Mayer’ s蘇木素染液(5滴)淡染細(xì)胞核。
[0052]⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，充分水洗，水洗至細(xì)胞核藍(lán)化。
[0053]⑦用甘油明膠封片，拍照。
[0054]肝臟大體外觀結(jié)果見(jiàn)圖3所示，通過(guò)大體取材拍照，觀察到在HFD組的CYLD-KO小鼠的肝臟體積稍較HFD組的WT小鼠的肝臟大，且CYLD-KO肝臟色澤泛黃，油脂較多(如圖3A)。在HFD組的CYLD-KO小鼠無(wú)論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高(如圖3B)。 進(jìn)一步通過(guò)組織切片，進(jìn)行HE和油紅O染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過(guò)肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，WT小鼠和CYLD-KO小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到NC組小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細(xì)胞形態(tài)已幾乎完全破壞，而CYLD-KO組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)變化更為嚴(yán)重(如圖4上)。通過(guò)肝臟油紅O染色來(lái)檢測(cè)肝組織中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的WT小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積，而在HFD組的CYLD-KO小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著(如圖4下)。這些結(jié)果說(shuō)明CYLD基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。
[0055]上述結(jié)果顯示CYLD-KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的II型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明CYLD基因?qū)Ω纳艻I型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發(fā)明結(jié)果說(shuō)明CYLD基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。
[0056]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.CYLD在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病藥物中的應(yīng)用。
2.一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，其特征在于:包含CYLD。
3.CYLD在制備預(yù)防、緩解和/或治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
4.一種預(yù)防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物，其特征在于:包含CYLD。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK104069483SQ201410322174
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】李紅良, 張曉東, 汪濤, 杜成 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)