原兒茶醛在制備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應用的制作方法
【專利摘要】吸煙造成肺損害已經(jīng)是公認的事實，保護或減輕長期吸煙者的肺損害，是預防肺癌等吸煙并發(fā)癥的一個重要的保健措施，本研究組發(fā)現(xiàn)原兒茶醛對吸煙導致的肺損傷有明顯的保護作用，據(jù)此，本發(fā)明提出用原兒茶醛制備為一種可供臨床作為防護吸煙導致肺損傷的保健食品或藥品應用，這種應用是指原兒茶醛可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液，噴霧劑，注射劑，供臨床作為防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應用。
【專利說明】原兒茶醛在制備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面 的應用
[0001]

【技術領域】原兒茶醛是中藥丹參的主要活性成分之一，本發(fā)明涉及原兒茶醛在制 備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應用。
[0002] 研究背景吸煙有害健康，但全球仍有11億人在吸煙，占世界人口的1/6。世界衛(wèi) 生組織估計，與吸煙相關的疾病每年導致大約500萬人過早死亡，其中有大約60萬非吸煙 者死于二手煙的危害。而我國的肺癌發(fā)病率和死亡率一直呈顯著上升趨勢，預計2025年每 年死于肺癌的人數(shù)將接近100萬，其中90%肺癌的發(fā)生與吸煙有關。長期吸煙可引起機體 的氧化應激和炎癥反應，而氧化損傷和慢性炎癥正好是肺部疾病發(fā)生的重要因素。針對吸 煙誘導肺損傷的毒性作用及機制，本課題一直在尋找對吸煙致肺損傷有保護作用的物質(zhì)， 通過大量的動物實驗，發(fā)現(xiàn)了原兒茶醛對吸煙導致的肺損傷具有十分明顯的保護作用。
[0003] 原兒茶醒（Protocatechuic aldehyde, PCA)，化學名為3,4_二輕基苯甲醒，是丹 參水溶性成分丹酚酸B降解的主要產(chǎn)物之一，也可從四季青葉、鼠尾草等活血化瘀藥物中 提取，常作為質(zhì)量檢測指標控制丹參相關制劑的質(zhì)量。由于原兒茶醛的抗氧化活性來自其 鄰二酚的母核，因此它具有多種生理活性，如擴張動脈、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、 抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用。目前對原兒茶醛的藥理學研究主要有如下幾個方面：
[0004] 1.原兒茶醛保護心肌細胞作用：原兒茶醛對心肌的保護作用，有如下觀點：
[0005] (1)原兒茶醛可以減輕鈣超載，保護心?。盒募∪毖叭毖俟嘧p傷所造成的 心肌細胞損傷均與細胞內(nèi)Ca2+超載有關。心肌細胞的電生理研究表明：缺血后細胞內(nèi)的無 氧代謝導致細胞內(nèi)pH降低而引發(fā)的細胞內(nèi)Na+超載，進一步引起的Ca2+超載，在心肌的缺 血性以及再灌注性損傷中均占有重要的地位。采用熒光探針Fura-2定量分析法，分別測定 丹參注射液及其活性成分丹參素、PCA對離體健康成人紅細胞胞漿Ca2+濃度的影響，結(jié)果 顯示丹參素和PCA均具有降低成人紅細胞胞漿Ca2+濃度的作用，并呈劑量依賴性，二者合 并用藥，藥效相加，作用與丹參注射液相似；而且PCA的鈣拮抗作用強于丹參素，紅細胞胞 漿ca濃度最大抑制率可達80%以上，且無鐘形曲線特點（沈玲紅，等，2004)。
[0006] (2)原兒茶醛能夠心肌損傷特異性的酶活性：最近有報道原兒茶醛對大鼠心肌缺 血/再灌注損傷有明顯的保護作用，研究發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠顯著降低該動物模型的心肌 梗塞面積，對心肌損傷特異性的酶CK-MB，cTnl和LDH有明顯的降低作用，這些酶是細胞 內(nèi)重要的能量代謝酶，是急性心肌損傷的血清標志物，心肌缺血/再灌注損傷大鼠血清中 的CK-MB，cTnl，LDH含量均明顯升高，應用原兒茶醛能夠降低大鼠血清中的CK-MB. cTnl和 LDH水平，提示原兒茶醛對心肌的保護作用可能是與降低這些酶的活性有關（袁曉峰，等， 2013)。
[0007] (3)原兒茶醛有抗氧化作用，原兒茶醛具有鄰二酚的母核結(jié)構(gòu)，該藥效基團是其顯 著抗氧化活性的物質(zhì)基礎。有人利用體外抗氧化模型，定量比較丹參藥材的代表成分丹參 素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B的體外抗氧化能力的強弱，4種酚性化合物清除· OH的Ic 值大小順序為：丹參素>咖啡酸>原兒茶醛>丹酚酸B，表明丹酚酸B的作用最強，原兒茶 醛的作用次于丹酚酸B，這些成分可能是丹參通過清除氧自由基治療心血管疾病的重要活 性成分（劉梅，等，2009)。
[0008] 2原兒茶醛抗動脈粥樣硬化的作用：動脈粥樣硬化是常見的心血管疾病，近年來 被認為是一種慢性炎癥反應。血管內(nèi)皮細胞的炎性損傷是動脈粥樣硬化的始動因素，許多 炎性刺激因子如脂多糖、腫瘤壞死因子等都可以造成血管內(nèi)皮的炎性損傷；血管內(nèi)皮細胞 損傷、凋亡會導致內(nèi)皮失去其完整性，是動脈粥樣硬化的危險因素之一，已證明原兒茶醛可 抑制某些炎癥因子及介導炎癥反應的細胞信號，從而抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應；原兒茶醛 還有抑制細胞凋亡作用，可通過增加 NO, NOS的分泌來保護內(nèi)皮細胞免受氧化修飾低密度 脂蛋白降低NO介導的血管損傷，導致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、凋亡和壞死。
[0009] 3原兒茶醛抗血栓形成的作用：原兒茶醛體內(nèi)、體外給藥對家兔和大鼠血小板用 ADP或凝血酶誘導的聚集以及5-HT釋放，均有明顯的抑制作用，并能降低血小板TXA，所以 原兒茶醛抑制血小板聚集可能與抑制血小板PGs代謝、減少TXA，生成有關，可能是通過抑 制PGs代謝系統(tǒng)環(huán)氧化酶的活性等作用所致。原兒茶醛還有促進微循環(huán)的作用。
[0010] 還有報道原兒茶醛對神經(jīng)細胞的有保護作用，抗肝纖維化作用，抗敗血癥、抗病 毒、神經(jīng)保護等作用。但關于原兒茶醛對吸煙誘導肺損傷的保護研究尚未發(fā)現(xiàn)。本項目組 利用已經(jīng)建立起來的吸煙導致肺損傷的動物模型，對原兒茶醛是否對吸煙誘導的肺損傷具 有保護作用進行了探討，結(jié)果證明原兒茶醛對吸煙造成的肺損傷具有明顯的保護作用。


【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本研究組發(fā)現(xiàn)原兒茶醛對吸煙導致的肺損傷有明顯的保護作用，據(jù)此， 本發(fā)明提出用原兒茶醛制備為一種口腔含片，供臨床作為防護吸煙致肺損傷的保健食品及 藥品方面的應用，同時，原兒茶醛還可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液， 噴霧劑，注射劑，供臨床作為防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應用。
[0012] 進一步的研究證明原兒茶醛作為臨床作為防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品 時，當制備成含片，膠囊，軟膠囊，片劑時，每粒含原兒茶醛60?150mg為佳，較佳的劑量為 66. 5mg或133mg ;制備為顆粒劑，沖劑時，每包含原兒茶醛60?150mg為佳，較佳的劑量為 66. 5mg或133mg ;制備為口服液時，每瓶含原兒茶60?150mg為佳，較佳的劑量為66. 5mg 或 133mg。

【具體實施方式】：
[0013] 為證明原兒茶醛對吸煙導致的肺損傷有保護作用，本研究采用C57BL/6小鼠進行 建模研究，C57BL/6小鼠是目前國內(nèi)外最常用于吸煙誘導肺損傷的實驗動物之一，本課題組 預實驗發(fā)現(xiàn)將C57BL/6小鼠的吸煙量設為每天Sg煙絲，暴露20d，能導致小鼠肺損傷，本實 驗擬通過C57BL/6小鼠暴露于煙草煙霧中，建立吸煙誘導的肺損傷模型，探索原兒茶醛干 預后吸煙誘導肺損傷的氧化應激和炎癥反應的變化及病程中的組織病理學的改變，進一步 研究原兒茶醛作為抗氧化劑對吸煙誘導的肺損傷的保護作用及其機制。
[0014] 1研究目的
[0015] I. 1吸煙致肺損傷的小鼠模型建立及發(fā)病機制的探討
[0016] 參考國內(nèi)外有關吸煙致肺損傷的文獻，結(jié)合本實驗的基本條件，確定吸煙致肺損 傷的各個因素，如每次使用的煙絲重量，每天吸煙的時間，每天吸煙的次數(shù)以及造模的天數(shù) 等。通過模型組肺部的氧化應激、炎癥反應和纖維化情況，判斷造模是否成功。
[0017] 1. 2觀察三個劑量的PCA對吸煙小鼠肺損傷的影響
[0018] 觀察原兒茶醛治療吸煙致肺損傷的量效關系，并比較原兒茶醛與維生素 C治療肺 損傷的效果。通過觀察各個實驗組小鼠肺部組織病理學變化，肺羥脯氨酸含量及Masson 纖維化染色情況，評價原兒茶醛對肺損傷的保護作用，同時，通過觀察抗氧化酶SOD、MDA、 GSH-PX活性的影響，評價探討推測原兒茶醛對吸煙致小鼠肺損傷的藥理作用及作用機制。
[0019] 2材料與方法
[0020] 2. 1實驗材料
[0021] 實驗動物：本實驗使用8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，共60只，體重為（20 ±2) g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，廣東省實驗動物質(zhì)量合格證：SCXK (粵）2008-0002
[0022] 飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于清潔動物房，室溫保持24°C?28°C，濕度在50%?60%之內(nèi)，每 天12h光照，自由飲水與攝食（廣東醫(yī)學院動物中心提供的標準飼料），每周稱重一次。
[0023] 實驗藥物原兒茶醒的配制：準確稱取60mg，120mg，180mg原兒茶醒分別溶于60ml 雙蒸水（配藥時按比例縮減，按需要量配制），充分振蕩溶解，配成溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0024] 2. 2實驗方法
[0025] 2. 2. 1設計與分組
[0026] 60只8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，由廣東省實驗動物中心提供。動物適應性 喂養(yǎng)1周后按體重隨機分成6組，分別為正常組（Control組）、模型組（TS組）、原兒茶醛 低劑量組（PCA-L組）、原兒茶醛中劑量組（PCA-M組）、原兒茶醛高劑量組（PCA-H組）和維 生素 C陽性對照組（VC組）。小鼠進行為期30d的吸煙誘導肺損傷觀察，吸煙即煙草煙霧暴 露方法如下：每天煙草的用量為8g，每天進行煙霧暴露4次，每次完全燃燒2g煙絲，每次暴 露15min，每次吸煙完畢后中途間隔5min再繼續(xù)進行下一次吸煙。每天吸煙前一小時分別 對小鼠進行灌胃給藥，給藥量均按照小鼠體重〇. Iml · IOg' TS組給予生理鹽水，PCA-L組 給予原兒茶醒IOmg · kg< · (Γ1，PCA-M組給予原兒茶醒20mg · kg< · (Γ1，PCA-H組給予原兒 茶醛30mg · kg4 · cf1，VC組給予維生素 ClOOmg · kg4 · cf1。最后一次給藥完畢24h后，取左 肺進行超氧化歧化酶（SOD)，過氧化氫酶（CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX)和過氧化物 髓化酶（MPO)的活力檢測，以及丙二醛（MDA)水平檢測，提取蛋白進行相關炎癥、凋亡和氧 化因子檢測。右肺去部分組織做病理切片，進行HE、MASSON、粘液染色和免疫組化檢測。
[0027] 2. 2. 2造模方法
[0028] 動物被放置于吸煙箱（由透明有機玻璃制成，長48cm，寬36cm，高30cm)，吸煙箱 蓋為可活動門，該門有兩個Icm的圓形排氣孔，并裝有一個小型抽風機。抽風機進風口處連 接一個IL的塑料儲藏室，其上方放置著一個15ml圓柱形的金屬煙絲槽。開始實驗時，煙絲 被放置于煙絲槽中，點燃煙絲，啟動小型抽風機，煙霧被吸到塑料儲藏室與空氣混勻，然后 勻速排進吸煙室內(nèi)。每天小鼠吸煙4次，每次15min，每次吸煙結(jié)束后，打開吸煙箱蓋驅(qū)走 箱內(nèi)煙霧，間隔5min再繼續(xù)下一次吸煙。每天煙絲使用量8g，每次燃燒2g煙絲，2g煙絲約 2min會燃燒殆盡，小鼠總吸煙時間為60min。
[0029] 2. 2. 3小鼠肺組織的處理
[0030] 取小鼠肺組織放置于0°C生理鹽水中漂洗，出去血液，濾紙拭干，稱重，放入玻璃勻 漿器內(nèi)。用移液槍量取預冷的〇. 9%生理鹽水（生理鹽的體積總量為組織塊重量的9倍）， 用移液管取總量1/2的生理鹽水于玻璃勻漿器圓頸壁中，用眼科剪將肺組織快速剪碎，然 后在玻璃勻漿管中快速研磨，勻漿器的下端插入盛有碎冰的器皿中，充分研碎后，將勻漿液 分裝到2ml的離心管內(nèi)。剩余的1/2冷生理鹽水沖洗殘留在勻漿器中的勻漿液，然后倒入 對應的離心管。將制備好的10%勻漿，用低溫離心機在4°C環(huán)境中以2500r/min轉(zhuǎn)速，離心 15min，用移液槍分離上清液，分裝后放入-80°C超低溫冰箱儲藏備用。
[0031] 2. 2. 4小鼠肺組織SOD，CAT，GSH-PX和MPO活性檢測
[0032] 小鼠肺組織SOD活性采用WST-I法測定；小鼠肺組織CAT活性采用鑰酸銨法測 定，肺組織GSH-PX活性檢測用谷胱甘肽過氧化物酶的酶促反應速度法測定。小鼠肺組織 MPO(髓過氧化物酶）活性檢測采用鄰連茴香胺供氫法測定。
[0033] 2. 2. 5小鼠肺組織羥脯氨酸含量檢測
[0034] 小鼠肺組織羥脯氨酸含量測定根據(jù)羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn) 物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色的原理，用相關的試劑盒進行測定。
[0035] 2. 2. 6小鼠肺組織病理評分
[0036] 每張切片采用盲法評估。通過400倍的顯微鏡下觀察300個肺泡進行評分，每一 個視野按照下表的標準進行評分。所有的得分累加并根據(jù)重要性進行加權(quán)計算，最終得分 按照以下公式進行：肺損傷分數(shù)=[肺泡出血得分/視野數(shù)+2X (肺泡浸潤得分/視野 數(shù)）+3 X (纖維沉積得分/視野數(shù)）+ (肺泡壁充血/視野數(shù)）]/總肺泡數(shù)。見表2. 1 :
[0037] 表2. 1肺組織病理評分表
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 原兒茶醛在制備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應用。
2. 如權(quán)利要求1所述的原兒茶醛在制備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的 應用，其特征是指原兒茶醛可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液，噴霧劑， 注射劑，供臨床應用。
3. 如權(quán)利要求1所述的原兒茶醛在制備防護吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面 的應用，其特征是指原兒茶醛制備為含片，膠囊，軟膠囊，片劑時，每粒含原兒茶醛60? 150mg，制備為顆粒劑，沖劑時，每包含原兒茶醛60?150mg，制備為口服液時，每瓶含原兒 茶醒60?150mg。
【文檔編號】A61P11/00GK104288132SQ201410327516
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】吳鐵, 鄭志明, 崔燎, 鄒麗宜, 張新樂 申請人:廣東醫(yī)學院