一種柴黃口服液的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種柴黃口服液的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的柴黃口服液的制備方法，由柴胡500g、黃芩500g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得黃芩苷含量有很大提高。本發(fā)明還提供了柴黃口服液在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】 一種柴黃口服液的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種柴黃口服液的制備方法及其在抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]柴黃口服液標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-133(Z-021)-95_2013Z，屬于山東福膠集團(tuán)有限公司自控標(biāo)準(zhǔn)，2013年12月23日經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。柴黃口服液柴胡500g、黃芩500g作為原料藥制成，具有清熱解表的功效。用于輕、中型風(fēng)熱感冒引起的發(fā)熱，周身不適，頭痛目眩，咽喉腫痛。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有柴黃口服液在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報(bào)道，而中藥的水蒸氣蒸餾提取、直接水提醇沉的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種柴黃口服液的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種柴黃口服液在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞
S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
一種柴黃口服液的制備方法，由柴胡500g、黃芩500g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:取柴胡、黃芩加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力20-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180-220min，得超臨界萃取物，備用；C02超臨界萃取的藥渣，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5_10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加鹿糖60g,苯甲酸鈉Ig,加水至500ml,攪勻，灌裝，即得，共制備100支，每支5ml。
[0007]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0008]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為40°C。
[0010]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.min。
[0011]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
[0012]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013]上述的柴黃口服液的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0014]上述的柴黃口服液在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)中，柴黃口服液每次1ml，一日3次。柴黃口服液因其治療風(fēng)熱感冒效果好而廣泛應(yīng)用，尤其多用于小兒。小兒普遍存在吃藥難的問題，很多家長都用滴管滴灌，因此給小兒敷藥，體積越小越好。采用本發(fā)明方法制備成的柴黃口服液每支5ml，每次I支，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。
[0016]試驗(yàn)一、不同方法制備的柴黃口服液中黃岑苷含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明柴黃口服液:按實(shí)施例1方法制備，使用100g原料藥，經(jīng)提取制100支，每支5ml。原柴黃口服液，按照WS-133(Z-021)-95-2013Z標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；黃芩苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0017]2、方法
照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄V D)測(cè)定。
[0018]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2%磷酸溶液(44:55)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為280nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。
[0019]對(duì)照品溶液的制備取在60°C減壓干燥2小時(shí)的黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，力口50%甲醇制成每Iml含0.1mg的溶液，即得。
[0020]本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的柴黃口服液，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理(功率500W，頻率40kHz) 20分鐘，放置至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0021]對(duì)照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的柴黃口服液，精密量取lml，置10ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理(功率500W，頻率40kHz) 20分鐘，放置至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0022]測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0023]3、結(jié)果
結(jié)果表明，本發(fā)明柴黃口服液中黃芩苷的含量為21-38mg/ml ;而原柴黃口服液中黃芩苷的含量為0.38mg/ml，每次服用量I支的黃芩苷含量為原口服液含量的2_4倍，在服用量減少的情況下，黃芩苷含量有很大提高。
[0024]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的柴黃口服液，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-133 (Z-021)-95-2013Z標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的柴黃口服液。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026]實(shí)施例1
取柴胡500g、黃芩500g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；C02超臨界萃取的藥渣，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加蔗糖60g，苯甲酸鈉lg，力口水至500ml,攪勻，灌裝，即得，共制備100支，每支5ml。
[0027]經(jīng)檢測(cè)，成品中黃芩苷的含量為40.2mg/ml。
[0028]實(shí)施例2
取柴胡500g、黃芩500g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力20MPa，溫度50°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時(shí)間220min，得超臨界萃取物，備用；C02超臨界萃取的藥渣，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加蔗糖60g，苯甲酸鈉lg，力口水至500ml,攪勻，灌裝，即得，共制備100支，每支5ml。
[0029]經(jīng)檢測(cè)，成品中黃芩苷的含量為22.5mg/ml。
[0030]實(shí)施例3
取柴胡500g、黃芩500g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度30°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；C02超臨界萃取的藥渣，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加蔗糖60g，苯甲酸鈉lg，力口水至500ml,攪勻，灌裝，即得，共制備100支，每支5ml。
[0031]經(jīng)檢測(cè)，成品中黃芩苷的含量為35.4mg/ml。
[0032]對(duì)比例I 參照 WS-133 (Z-021) -95-2013Z 標(biāo)準(zhǔn)制備
稱取取柴胡500g、黃芩500g，取黃芩加水煎煮一次，每次I小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液用硫酸調(diào)節(jié)PH值至2，靜置，濾取沉淀，沉淀用乙醇適量洗滌后干燥，備用；柴胡用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器保存:藥渣加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次I小時(shí)，合并并煎液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.16-1.24(600C ),加入乙醇使含醇量達(dá)60%，攪勻，冷藏24小時(shí)，濾過，濾液同收乙醇，得相對(duì)密度為I 14-1 16 (60°C )的濃縮液，加入上述黃芩提取物，調(diào)節(jié)pH值5.6-5.8，加水至約900ml，冷藏48小時(shí)，加入上述柴胡揮發(fā)油和蒸餾液，濾過，加蔗糖150g，苯甲酸鈉3g，加水至100ml，攪勻，灌裝，即得。
[0033]經(jīng)檢測(cè)，成品中黃芩苷的含量為10.2mg/ml。
[0034]實(shí)施例4:柴黃口服液抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
小鼠肛門肉瘤細(xì)胞s-180細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0035]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
研究藥物:本發(fā)明柴黃口服液:按實(shí)施例1方法制備及對(duì)比例I方法制備。
[0036]藥液儲(chǔ)液:稱取10ml柴黃口服液，0.2μπι濾器過濾，500μ Idoff管分裝，_20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0037]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
DMEM(GIBC0公司Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin(AMRESC0 公司)；EDTA(AMRESC0 公司)!Penicillin G SodiumSalt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司);MTT(B1sharp批號(hào):0793):PBS(實(shí)驗(yàn)室自配)；
1.4實(shí)驗(yàn)器材
萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號(hào):DMIL);可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國MD公司型號(hào):SPECTRAMAX 190) ;CO2培養(yǎng)箱(F0RMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號(hào):S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):KA-1000) ;0.2 μ m濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ；lcm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0038]2.實(shí)驗(yàn)方法
l)s-180細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(1cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.0496EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，100rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 14個(gè)/ml。
[0039]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0040]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入柴黃口服液溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0041]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0042]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0043]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0044]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0045]3.統(tǒng)計(jì)處理
采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以mean土S.D.表不O
[0046]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)S-180細(xì)胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0047]表I柴黃口服液對(duì)S-180細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土SD)

【權(quán)利要求】
1.一種柴黃口服液的制備方法，由柴胡500g、黃芩500g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取柴胡、黃芩加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶齊U，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力20-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間180_220min，得超臨界萃取物，備用；C02超臨界萃取的藥渣，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加鹿糖60g,苯甲酸鈉Ig,加水至500ml,攪勻，灌裝，即得,共制備100支，每支5ml ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為40 °C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴黃口服液的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
9.權(quán)利要求1所述的柴黃口服液在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/08GK104161803SQ201410351445
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】王京娥, 楊福安 申請(qǐng)人:山東福膠集團(tuán)有限公司