樹突狀細(xì)胞及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了樹突狀細(xì)胞及其制備方法和用途。具體的，本發(fā)明提出了樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者抑制肝癌，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合能夠有效治療或者抑制肝癌。
【專利說(shuō)明】樹突狀細(xì)胞及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞及其制備方法和用途，更具體的，本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合在制備藥物中的用途、制備樹突狀細(xì)胞的方法、藥物以及樹突狀細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002]肝癌是中國(guó)第二位腫瘤殺手，每年死亡人數(shù)30多萬(wàn)，占全世界肝癌死亡總數(shù)的55%。目前治療肝癌的主要手段為手術(shù)切除、肝移植、局部消融治療、肝動(dòng)脈介入治療、放射治療、化學(xué)治療和其他治療。
[0003]在世界任何地區(qū)都同樣發(fā)現(xiàn)，任何原因?qū)е碌穆愿尾《伎赡茉诟伟┌l(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究均表明病毒性肝炎與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有著特定的關(guān)系，目前比較明確的與肝癌有關(guān)系的病毒性肝炎有乙型、丙型和丁型3種，其中以乙型肝炎與肝癌關(guān)系最為密切，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn):肝細(xì)胞癌與HBsAg攜帶者的發(fā)生率相平行。
[0004]然而，現(xiàn)有肝癌的治療手段仍有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有能夠有效治療肝癌的手段。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(cytokine-1nduced killer, CIK)的組合在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者抑制肝癌，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。
[0007]樹突狀細(xì)胞是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，成熟的樹突狀細(xì)胞能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，并能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。
[0008]細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞是將人的外周血PBMC (Peripheral BloodMonoclonal Cells)在體外經(jīng)過(guò)多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的T淋巴細(xì)胞，由于該細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)樣T淋巴細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，在體外培養(yǎng)兩周左右可以使主要效應(yīng)細(xì)胞(CD3+、CD56+)增值1000倍以上；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞毒作用強(qiáng)，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的LAK細(xì)胞和細(xì)胞因子Y干擾素、白細(xì)胞介素2 ;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞具有廣泛的殺瘤作用，在不傷害正常細(xì)胞的條件下通過(guò)多種途徑靶向殺死腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)作用。DC與CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用將完成識(shí)別腫瘤細(xì)胞、殺滅腫瘤細(xì)胞的全過(guò)程。研究表明DC細(xì)胞能夠使抑制T細(xì)胞(CD4+CD25+)的數(shù)量減少、活性減弱，所以共同培養(yǎng)DC、CIK細(xì)胞與單純培養(yǎng)CIK細(xì)胞相比在細(xì)胞增殖能力、效應(yīng)細(xì)胞(⑶3+、⑶8+、CD3+CD56+)數(shù)量以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等方面顯著增強(qiáng)。
[0009]腫瘤的DC-CIK免疫細(xì)胞治療是繼手術(shù)、放療、化療后的第四種抗腫瘤治療模式，是向腫瘤患者輸入自體的、在體外擴(kuò)增并激活的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。對(duì)于實(shí)體瘤手術(shù)后病人，該治療可清除體內(nèi)殘余腫瘤細(xì)胞、明顯降低腫瘤手術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)幾率；對(duì)于放化療病人，該治療可清除殘存腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)放化療的敏感性、減輕放化療的毒副作用；對(duì)于無(wú)法手術(shù)及放化療的中晚期腫瘤患者，該治療可以抑制腫瘤的增長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力、改善生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生命周期。腫瘤免疫細(xì)胞治療在全球的累計(jì)治療病例超過(guò)數(shù)萬(wàn)例，療效和安全性都比較令人滿意。
[0010]因此，樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞免疫療法即DC-CIK免疫療法引入到抗肝癌的治療中，改善現(xiàn)有技術(shù)中抗肝癌免疫效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用，通過(guò)細(xì)胞因子的添加，尋找新的樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞培養(yǎng)方法，在生物【技術(shù)領(lǐng)域】意義重大。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樹突狀細(xì)胞可以是通過(guò)下列步驟獲得的:(I)獲取外周血，所述外周血來(lái)自于攜帶所述病灶的個(gè)體；(2)從所述外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞；(3)刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞，其中，在步驟(3)中包括將所述單個(gè)核細(xì)胞與所述病灶的特異性抗原接觸，所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述個(gè)體進(jìn)一步患有慢性乙肝。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞(DC)與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合能夠有效的治療慢性乙肝性肝癌。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3)進(jìn)一步包括:(3-1)利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白細(xì)胞介素4刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化；(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細(xì)胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1 ;以及(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細(xì)胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞。
[0014]原發(fā)性肝癌患者血清中甲胎蛋白(a-fetoprotein)AFP升高可達(dá)250ug?6mg/ml,(甚至達(dá)到9mg/ml)，相當(dāng)于正常人的數(shù)十倍乃至數(shù)萬(wàn)倍，因此血清AFP的測(cè)定是目前診斷原發(fā)性肝癌最常用、較敏感、特異性較強(qiáng)的早期診斷方法，現(xiàn)已廣泛用于肝癌的普查、診斷、判斷治療效果、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)中。AFP與腫瘤大小有一定的相關(guān)性，即腫瘤越小，陽(yáng)性率越低，AFP也與病理類型相關(guān)，癌細(xì)胞分化I級(jí)和II級(jí)，AFP相對(duì)較低，III級(jí)時(shí)相對(duì)較高。近年來(lái)采用AFP異質(zhì)體和AFP同時(shí)測(cè)定，可使肝癌診斷陽(yáng)性率提高至92%，假陽(yáng)性低于15%。
[0015]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用AFP (甲胎蛋白)進(jìn)行刺激而得到樹突狀細(xì)胞能夠顯著提高所得到的樹突狀細(xì)胞對(duì)肝癌病灶的特異性識(shí)別。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL，所述重組人白細(xì)胞介素4的濃度為500U/mL。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨(dú)立地為40?
60微克/毫升,最優(yōu)選50微克/毫升。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合是通過(guò)將所述樹突狀細(xì)胞和所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)獲得的，其中，在所述共培養(yǎng)時(shí)，所述樹突狀細(xì)胞與所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的接種比例為1:8?12，優(yōu)選 1:10。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞是通過(guò)下列步驟獲得的:(4-1)利用IFN-Y刺激步驟(2)中所獲得的單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)，其中，所述IFN-Y的濃度為1000U/ml ;以及(4-2)將步驟(4_1)中所得到的細(xì)胞與CD3單克隆抗體和重組人白細(xì)胞介素2接觸，以便獲得所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞，其中，所述CD3單克隆抗體的濃度為50ng/ml，重組人白細(xì)胞介素2的濃度500U/ml。
[0020]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括:(I)獲取外周血，所述外周血來(lái)自于攜帶所述病灶的個(gè)體；(2)從所述外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞；(3)刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞方向分化，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞，其中，在步驟(3)中包括將所述單個(gè)核細(xì)胞與所述病灶的特異性抗原接觸，所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3)可以進(jìn)一步包括:(3-1)利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白細(xì)胞介素4刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化；(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細(xì)胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1 ;以及(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細(xì)胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL，所述重組人白細(xì)胞介素4的濃度為500U/mL。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨(dú)立地為40?
60微克/毫升,最優(yōu)選50微克/毫升。
[0024]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種藥物，所述藥物用于治療或者預(yù)防肝癌。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物包括:樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樹突狀細(xì)胞是通過(guò)前面所述的方法制備的。
[0026]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種樹突狀細(xì)胞，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樹突狀細(xì)胞是通過(guò)前面所述的方法制備的。
[0028]具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種用于抗肝癌的樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括下列步驟:
[0029]步驟a:自體血漿的制備
[0030]在生物安全柜中將注射器中的40ml-60ml抗凝全血平均分裝到2支50mL無(wú)菌離心管中，用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，離心lOmin，離心完成后吸取上層血漿，56°C，30min滅活補(bǔ)體，置于4°C水浴中放置15分鐘，再用離心機(jī)離心，離心速度為2500rpm，離心20分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。標(biāo)記，置于_20°C冰箱中保存；
[0031]步驟b:單個(gè)核細(xì)胞的分離
[0032]向步驟a中所述的離心后未被吸取的血細(xì)胞中加入緩沖鹽溶液25mL，稀釋血細(xì)胞，邊吹打邊旋轉(zhuǎn)離心管，混勻。取30ml混勻的稀釋血緩慢加到裝有淋巴細(xì)胞分離液的50mL離心管內(nèi)。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為210rpm離心30分鐘；吸出白膜層至裝有30ml緩沖鹽溶液的離心管中，用離心機(jī)離心，離心速度為2100rpm，離心15分鐘；
[0033]步驟C:離心洗滌、計(jì)數(shù)
[0034]將上述步驟b中得到的細(xì)胞懸液，棄上清，每管加5mL緩沖鹽溶液，重懸細(xì)胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至一管，再吸取適量緩沖鹽溶液漂洗各管后收集殘留細(xì)胞，定容至30mL，留樣計(jì)數(shù)。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速1500rpm,離心10分鐘；
[0035]步驟d:重懸細(xì)胞、接種
[0036]將上述步驟c中得到的細(xì)胞懸液，棄上清，取5mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，移入表面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，每瓶l*106/mL的密度，置于37°C、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)；
[0037]步驟e:DC細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
[0038]從上述步驟d所述的培養(yǎng)瓶中吸出懸浮細(xì)胞備用，加入rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4 500U/ml，刺激細(xì)胞向DC細(xì)胞分化，擴(kuò)瓶；在培養(yǎng)的第5天加入甲胎蛋白及乙肝疫苗50 μ g/ml ;在培養(yǎng)的第6天加入IL- β、IL-6,TNF α細(xì)胞因子；第7天收獲DC細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞CDla、CDllc和CD83免疫表型標(biāo)記；
[0039]步驟f:CIK細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
[0040]將步驟e中的所述的懸浮細(xì)胞重新接種于培養(yǎng)瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ;24h后加入⑶350ng/ml單克隆抗體和rhIL_2500U/ml ;培養(yǎng)；第7天取樣，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞⑶3+⑶56+免疫表型標(biāo)記。
[0041 ] 步驟g: DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)
[0042]將收集的DC細(xì)胞加入CIK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，最后一次補(bǔ)加培養(yǎng)基后取樣進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素檢測(cè)、確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果陰性后第4天收獲細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞⑶3+⑶56+免疫表型標(biāo)記；
[0043]步驟h:細(xì)胞收獲
[0044]將細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞懸液混勻后分裝到50ml離心管中，45ml/管，配平。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為1500rpm, 1min0棄上清,每管加5ml含有稀釋血衆(zhòng)的生理鹽水,吹打均勻，每8管合I管，再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細(xì)胞，配平。用離心機(jī)離心,離心轉(zhuǎn)速為1500rpm, lOmin。棄上清,加生理鹽水重懸,合為I管,配平。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為1500rpm, lOmin。棄上清,輕彈離心管底,用移液管加1mL細(xì)胞重懸液,輕輕吹打，重懸細(xì)胞，先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打，再加1mL細(xì)胞重懸液和5mL白蛋白混勻。準(zhǔn)備生理鹽水袋放入超凈臺(tái)，酒精紗布擦拭管口處，打開管口塑料蓋露出軟塞，打開50ml注射器包裝，傾斜離心管將注射器伸入吸出細(xì)胞懸液。更換注射器的針頭為9號(hào)針頭，鹽水袋向上，將細(xì)胞懸液注入，注射完后抽出氣體，裝入包裝袋，傳遞窗傳出。
[0045]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基還可以具有如下附加的技術(shù)特征:所述步驟b中所述的緩沖鹽溶液為PBS溶液。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟a中所述的淋巴細(xì)胞分離液為ficoll分離液。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟b中的白膜層為離心完成后分為3層的中間層。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟d中的培養(yǎng)液為GT-T551培養(yǎng)液。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟e中所述的擴(kuò)瓶是指在培養(yǎng)的第3天I瓶擴(kuò)3瓶，第6天3瓶擴(kuò)9瓶。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟f中所述的培養(yǎng)為擴(kuò)瓶培養(yǎng)。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟f中所述的培養(yǎng)為培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟g中所述的DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞聯(lián)合的比例為1:10。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟h中所述的稀釋血漿的含量為4%。

【具體實(shí)施方式】
[0054]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過(guò)參考描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0055]實(shí)施例1
[0056]肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌術(shù)后患者自體血DC-CIK免疫細(xì)胞治療，具體內(nèi)容如下:
[0057]1、臨床資料
[0058]病例1，女，69歲，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，為手術(shù)后病理檢查確診病例。
[0059]2、主要材料
[0060](a)耗材:淋巴細(xì)胞分離液(GE healthcare)，GT-T551培養(yǎng)基(購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL-β、IL-6, IFN-Y、TNF α、甲胎蛋白、乙肝疫苗、⑶3單克隆抗體(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)責(zé)任有限公司)，50ml離心管、1ml離心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)袋(Thermo)，慶大霉素(購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)責(zé)任有限公司)。
[0061](b)儀器:流式細(xì)胞儀(beckman)、生物安全柜(力康)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(力康)、高速離心機(jī)(久保田)、倒置顯微鏡(江南)、超低溫冰箱(海爾)、液氮儲(chǔ)存罐(Thermo)。
[0062]具體步驟:
[0063](I)用含有抗凝劑的注射器抽取肝癌患者外周血45mL ；
[0064](2)在生物安全柜中將50mL抗凝全血平分到兩支50mL的無(wú)菌離心管中，2500rpm離心1min ；
[0065](3)離心完成后將上層血漿(每管約1mL)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，56°C，30min滅活補(bǔ)體，4°C水浴15min，2500rpm*20min離心去除纖維蛋白，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，置于-20°C冰箱備用；
[0066](4)向剩余的血細(xì)胞中加入PBS每管25mL，邊吹打邊旋轉(zhuǎn)離心管至混勻重點(diǎn)吹打管壁和管底，留ImL稀釋血做乙肝五項(xiàng)、梅毒、艾滋、丙肝檢測(cè)。
[0067](5)將混勻的稀釋血每30ml緩慢加到裝有15mLficoll的50ml離心管內(nèi)。2100rpm離心30min,慢升慢降；
[0068](6)離心完成后分為3層，用巴氏吸管小心吸取中間的白膜層轉(zhuǎn)至裝有30mlPBS的離心管中，每管42.5mL,配平離心2100rpm, 1min ；
[0069](7)棄上清，每管加5mL的PBS重懸細(xì)胞，輕柔吹打合為一管，再用5mL的PBS漂洗各管定容至30ml,留樣計(jì)數(shù),抒緊蓋子離心2100rpm, 1min ；
[0070](8)棄上清，用GT-T551重懸細(xì)胞，步驟(7)中細(xì)胞計(jì)數(shù)為7.3*107,按每瓶1*106/ml的密度接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，種2瓶，置于溫度為37°C、CO2%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h(記為第O天)。
[0071](9)吸出非貼壁細(xì)胞備用，向貼壁細(xì)胞中加入rhGM-CSF 1000U/ml (濃度均為終濃度)、rhIL-4500U/ml，刺激細(xì)胞向DC細(xì)胞分化，培養(yǎng)的第3天細(xì)胞貼壁率約為85%，培養(yǎng)液顏色變?yōu)殚冱S，I瓶擴(kuò)3瓶；第6天細(xì)胞貼壁率約為80%，培養(yǎng)液顏色變?yōu)殚冱SI瓶再擴(kuò)3瓶；在培養(yǎng)的第5天加入乙肝疫苗50 μ g/ml，按照1:1的濃度加入甲胎蛋白，刺激抗原特異性細(xì)胞的產(chǎn)生；在培養(yǎng)的第6天加入IL-β、IL-6、TNFa細(xì)胞因子，每種細(xì)胞因子的終濃度為10-100ng/ml，刺激DC細(xì)胞成熟；第7天收獲DC細(xì)胞；取樣，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞⑶la、⑶I Ic和⑶83免疫表型標(biāo)記；
[0072](10)將步驟(9)中的懸浮細(xì)胞重新接種于培養(yǎng)瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ；
[0073]a、I天后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和rhIL_2500U/ml刺激CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；
[0074]b、第4天鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量多、結(jié)團(tuán)較大、培養(yǎng)基顏色變?yōu)殚冱S色，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，體積擴(kuò)增到200ml ；
[0075]C、第5天鏡下觀察細(xì)胞體積增大、胞漿少、核大，結(jié)團(tuán)多，培養(yǎng)基變?yōu)殚冱S色補(bǔ)液至 600ml ；
[0076]d、第6天鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)基顏色金黃補(bǔ)液至1200ml，混勻，取樣涂板做細(xì)菌、真菌檢測(cè)；
[0077](11)將DC細(xì)胞按1:10的比例加入CIK細(xì)胞培養(yǎng)袋中混勻，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0078](12)第9天擴(kuò)袋。將1200ml培養(yǎng)液分裝至兩個(gè)培養(yǎng)袋中，其中將600ml的培養(yǎng)液分裝至a袋中，并利用補(bǔ)充培養(yǎng)基至1200ml，將另外600ml的培養(yǎng)液分裝至b袋中，并利用補(bǔ)充培養(yǎng)基至1500ml，兩袋都要取樣質(zhì)檢；
[0079](13)第12天收獲a袋細(xì)胞
[0080]a、分裝:將細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞懸液混勻后分裝到支50ml離心管中，45ml/管，共27管，配平。留5ml細(xì)胞懸液樣品做內(nèi)毒素和革蘭氏染色檢測(cè)及計(jì)數(shù)；
[0081]b、離心收集細(xì)胞:1500rpm*10min ;
[0082]C、第一次離心洗滌:棄上清，每管加5ml生理鹽水(含有4 %的稀釋血漿)，吹打均勻，每8管合I管，共4管，再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細(xì)胞，配平，lSOOrpm^lOmin ；
[0083]d、第二次離心洗滌:棄上清，加生理鹽水重懸，合為I管，配平。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為1500rpm,離心1min ；
[0084]e、重懸細(xì)胞:棄上清，先輕彈離心管底，使細(xì)胞沉淀松散。再用1ml移液管加1ml細(xì)胞重懸液，輕輕吹打，重懸細(xì)胞，開始不要直接吸出沉淀，要先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打(檢查是否有顆粒沉淀，如果吹不散要使用70um過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞沉淀)再加5mll0細(xì)胞重懸液和5ml白蛋白混勻。
[0085]f、將細(xì)胞懸液注入將生理鹽水袋:準(zhǔn)備生理鹽水袋放入超凈臺(tái)，酒精紗布擦拭管口處，打開管口塑料蓋露出軟塞，打開50ml注射器包裝，不要碰到注射器刻度線以下的管體，傾斜離心管將注射器伸入吸出細(xì)胞懸液，保證無(wú)菌操作。更換注射器的針頭為9號(hào)針頭，鹽水袋向上，將細(xì)胞懸液注入，同時(shí)觀察是否有沉淀，注射完后抽出相應(yīng)體積的氣體。
[0086]g、檢查確認(rèn):再次檢查是否有沉淀，檢查注射針孔處是否有液體滲出確定無(wú)誤后裝入包裝袋，傳遞窗傳出。
[0087](14)第13天收獲b袋細(xì)胞，方法同步驟(13)
[0088](15) a、b 細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為 3.54*109、4.57*109 ；
[0089]實(shí)施例2:
[0090]原發(fā)性肝癌II期患者自體血DC-CIK免疫細(xì)胞治療，具體內(nèi)容如下:
[0091]1、臨床資料
[0092]病例2，男，66歲，原發(fā)性肝癌II期，為手術(shù)后病理檢查確診病例。
[0093]2、主要材料
[0094](a)耗材:淋巴細(xì)胞分離液(GE healthcare)，GT-T551培養(yǎng)基(來(lái)源于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL- β、IL-6, IFN- Y、TNF α、乙肝疫苗、CD3單克隆抗體(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)責(zé)任有限公司)，50ml離心管、1ml離心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)袋(Thermo fisher)，慶大霉素(來(lái)源于宜昌人福藥業(yè)責(zé)任有限公司)。
[0095](b)流式細(xì)胞儀(bekman)、生物安全柜(力康)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(力康)、高速離心機(jī)(久保田)、倒置顯微鏡(江南)、超低溫冰箱(海爾)、液氮儲(chǔ)存罐(Thermo)。
[0096](I)用含有抗凝劑的注射器抽取肝癌患者外周血55ml ；
[0097](2)在生物安全柜中將50ml抗凝全血平分到兩支50ml的無(wú)菌離心管中，2500rpm離心1min ；
[0098](3)離心完成后將上層血漿(每管約12.5ml)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，56°C，30min滅活補(bǔ)體，4°C水浴15min，2500rpm*20min離心去除纖維蛋白，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，置于-20°C冰箱備用；
[0099](4)向剩余的血細(xì)胞中加入PBS每管25ml，邊吹打邊旋轉(zhuǎn)離心管至混勻重點(diǎn)吹打管壁和管底，留Iml稀釋血做乙肝五項(xiàng)、梅毒、艾滋、丙肝檢測(cè)。
[0100](5)將混勻的稀釋血每30ml緩慢加到裝有15ml ficoll的50ml離心管內(nèi)。2100rpm離心30min,慢升慢降；
[0101](6)離心完成后分為3層，用巴氏吸管小心吸取中間的白膜層轉(zhuǎn)至裝有30mlPBS的離心管中，每管42.5ml,配平離心2100rpm, 1min ；
[0102](7)棄上清，每管加5mlPBS重懸細(xì)胞，輕柔吹打合為一管，再用5mlPBS漂洗各管定容至30ml,留樣計(jì)數(shù),抒緊蓋子離心2100rpm, 1min ；
[0103](8)棄上清，用GT-T551重懸細(xì)胞，步驟(7)中細(xì)胞計(jì)數(shù)為8.1*107按按照每瓶l*106/ml的密度接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，種2瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C、C02%孵育2h(記為第O天)。
[0104](9)吸出非貼壁細(xì)胞備用，加入rhGM-CSF 1000U/ml (濃度均為終濃度)、rhIL-4500U/ml，刺激細(xì)胞向DC細(xì)胞分化，在培養(yǎng)的第3天細(xì)胞貼壁率約為75%，培養(yǎng)液顏色變?yōu)殚冱S，I瓶擴(kuò)3瓶；;在培養(yǎng)的第5天加入乙肝疫苗50 μ g/ml，刺激抗原特異性細(xì)胞的產(chǎn)生；在培養(yǎng)第6天細(xì)胞貼壁率約為80 %，培養(yǎng)液顏色變?yōu)殚冱SI瓶再擴(kuò)3瓶，加入IL- β、IL-6,TNFa細(xì)胞因子，每種細(xì)胞因子的終濃度為10_100ng/ml，刺激DC細(xì)胞成熟；第7天收獲DC細(xì)胞；取樣，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞CDla、CDllc和CD83免疫表型標(biāo)記；
[0105](10)將步驟(9)中的懸浮細(xì)胞重新接種于培養(yǎng)瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ；
[0106]a、I天后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和rhIL_2500U/ml刺激CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖
[0107]b、第4天鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量多，結(jié)團(tuán)較大、多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)榻瘘S色，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，體積擴(kuò)增到300ml ；
[0108]C、第5天鏡下觀察細(xì)胞體積增大、胞漿少、核大，結(jié)團(tuán)多，培養(yǎng)基變?yōu)殚冱S色補(bǔ)液至 600ml ；
[0109]d、第6天鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)基顏色金黃補(bǔ)液至1200ml，混勻，取樣涂板做細(xì)菌、真菌檢測(cè)；
[0110]e、第7天收獲CIK細(xì)胞；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞⑶3+CD56+免疫表型標(biāo)記；
[0111](11)將DC細(xì)胞按1:10的比例加入CIK細(xì)胞培養(yǎng)袋中混勻，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0112](12)第9天擴(kuò)袋。將1200ml培養(yǎng)液分裝至兩個(gè)培養(yǎng)袋中，其中將600ml的培養(yǎng)液分裝至a袋中，并利用補(bǔ)充培養(yǎng)基至1200ml，將另外600ml的培養(yǎng)液分裝至b袋中，并利用補(bǔ)充培養(yǎng)基至1500ml，兩袋都要取樣質(zhì)檢；
[0113](13)第12天收獲a袋細(xì)胞。
[0114]a、分裝:將細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞懸液混勻后分裝到支50ml離心管中，45ml/管，共27管，配平。留5ml細(xì)胞懸液樣品做內(nèi)毒素和革蘭氏染色檢測(cè)及計(jì)數(shù)；
[0115]b、離心收集細(xì)胞:1500rpm*10min ;
[0116]C、第一次離心洗滌:棄上清，每管加5ml生理鹽水(含有4%的稀釋血漿)，吹打均勻，每8管合I管，共4管，再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細(xì)胞，配平，1500rpm*10min ；
[0117]d、第二次離心洗滌:棄上清，加生理鹽水重懸，合為I管，配平。1500rpm*10min ；
[0118]e、重懸細(xì)胞:棄上清，先輕彈離心管底，使細(xì)胞沉淀松散。再用1ml移液管加1ml細(xì)胞重懸液，輕輕吹打，重懸細(xì)胞，開始不要直接吸出沉淀，要先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打(檢查是否有顆粒沉淀，如果吹不散要使用70um過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞沉淀)再加5mll0細(xì)胞重懸液和5ml白蛋白混勻。
[0119]f、將細(xì)胞懸液注入將生理鹽水袋:準(zhǔn)備生理鹽水袋放入超凈臺(tái)，酒精紗布擦拭管口處，打開管口塑料蓋露出軟塞，打開50ml注射器包裝，不要碰到注射器刻度線以下的管體，傾斜離心管將注射器伸入吸出細(xì)胞懸液，保證無(wú)菌操作。更換注射器的針頭為9號(hào)針頭，鹽水袋向上，將細(xì)胞懸液注入，同時(shí)觀察是否有沉淀，注射完后抽出相應(yīng)體積的氣體。
[0120]g、檢查確認(rèn):再次檢查是否有沉淀，檢查注射針孔處是否有液體滲出確定無(wú)誤后裝入包裝袋，傳遞窗傳出。
[0121](14)第13天收獲b袋細(xì)胞，方法同步驟(13)。
[0122](15)細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為 3.7*109、4.72*109。
[0123]在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0124]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者抑制肝癌，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶， 優(yōu)選地，所述樹突狀細(xì)胞是通過(guò)下列步驟獲得的: (1)獲取外周血，所述外周血來(lái)自于攜帶所述病灶的個(gè)體； (2)從所述外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞； (3)刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞， 其中， 在步驟(3)中包括將所述單個(gè)核細(xì)胞與所述病灶的特異性抗原接觸，所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一， 任選地，所述個(gè)體進(jìn)一步患有慢性乙肝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，步驟(3)進(jìn)一步包括: (3-1)利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白細(xì)胞介素4刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化； (3-2)將步驟(3-1)中所得到的細(xì)胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1 ;以及 (3-3)將步驟(3-2)中所得到的細(xì)胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞， 優(yōu)選地，所述巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL，所述重組人白細(xì)胞介素4的濃度為500U/mL， 優(yōu)選地，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨(dú)立地為40?60微克/毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合是通過(guò)將所述樹突狀細(xì)胞和所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)獲得的， 其中， 在所述共培養(yǎng)時(shí)，所述樹突狀細(xì)胞與所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的接種比例為1:8?12，優(yōu)選1:10。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞是通過(guò)下列步驟獲得的: (4-1)利用IFN-Y刺激步驟(2)中所獲得的單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)，其中，所述IFN-Y的濃度為1000U/ml ；以及 (4-2)將步驟(4-1)中所得到的細(xì)胞與CD3單克隆抗體和重組人白細(xì)胞介素2接觸，以便獲得所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞，其中，所述CD3單克隆抗體的濃度為50ng/ml，重組人白細(xì)胞介素2的濃度500U/ml。
5.一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶，所述方法包括: (1)獲取外周血，所述外周血來(lái)自于攜帶所述病灶的個(gè)體； (2)從所述外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞； (3)刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞方向分化，以便獲得所述樹突狀細(xì)胞， 其中， 在步驟(3)中包括將所述單個(gè)核細(xì)胞與所述病灶的特異性抗原接觸，所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一， 優(yōu)選地，步驟(3)進(jìn)一步包括: (3-1)利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白細(xì)胞介素4刺激所述單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化； (3-2)將步驟(3-1)中所得到的細(xì)胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1 ;以及 (3-3)將步驟(3-2)中所得到的細(xì)胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸，以便獲得成熟的樹突狀細(xì)胞， 優(yōu)選地，所述巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL，所述重組人白細(xì)胞介素4的濃度為500U/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨(dú)立地為40?60微克/暈升。
7.—種藥物，所述藥物用于治療或者預(yù)防肝癌，其特征在于，所述藥物包括: 樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞的組合， 其中，所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞是通過(guò)權(quán)利要求5或6所述的方法制備的。
9.一種樹突狀細(xì)胞,所述樹突狀細(xì)胞特異性識(shí)別肝癌病灶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的樹突狀細(xì)胞，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞是通過(guò)權(quán)利要求5或6所述的方法制備的。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104288179SQ201410356051
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】姚惟琦, 武棟成 申請(qǐng)人:武漢漢密頓生物科技股份有限公司