鴨坦布蘇病毒囊膜e蛋白特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，其氨基酸序列為：THRSWQGNSWYM。該特異性結(jié)合肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖，在不同濃度下均能顯著下調(diào)鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)，同時(shí)顯著降低鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒滴度，而其本身對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼料添加劑中具有良好的應(yīng)用前景，可用于鴨坦布蘇病毒病的防治。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，同時(shí)還涉及該特異性結(jié) 合肽的應(yīng)用，屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，中國(guó)南方爆發(fā)了一種新的鴨病毒性傳染病，主要引起鴨產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降，該 病傳播迅速、涉及范圍廣，發(fā)病前期為持續(xù)高熱，發(fā)病后期出現(xiàn)一定比例的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn) 為癱瘓、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟(jì)失調(diào)等，有些病鴨甚至在數(shù)日內(nèi)死亡。剖檢死亡鴨，多數(shù)呈現(xiàn) 脾臟和腎臟明顯腫大，蛋鴨表現(xiàn)為出血性卵巢炎。該病首先在江浙一帶爆發(fā)，隨后蔓延到福 建和安徽等地，之后在江西、山東、湖南、河南、河北相繼爆發(fā)。對(duì)于此病，國(guó)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)其病原進(jìn)行了分離、形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測(cè)定、RT-PCR檢測(cè)及序列分析， 現(xiàn)已確定該病病原為鴨坦布蘇病毒，故稱(chēng)該病為鴨坦布蘇病毒病。該病發(fā)病率高、傳播迅 速，發(fā)病范圍極廣，已給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV)是一種新型黃病毒，屬于黃病毒科不 分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約45?50nm，有囊膜和纖突，病毒約 由10990個(gè)核苷酸組成。該病毒對(duì)熱、脂溶劑和去氧膽酸鈉敏感，pH〈5或pH>10時(shí)便失去 感染活性，50°C以上加熱60min即被滅活。DTMUV能在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細(xì)胞及Vero、 BHKX6/36等部分傳代細(xì)胞系上增殖。其病毒基因組由5'端、3'端的非編碼區(qū)和中間的一 個(gè)開(kāi)放閱讀框組成，5'端的非編碼區(qū)長(zhǎng)度為142nt，含I型m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，3'端非編 碼區(qū)長(zhǎng)618nt，沒(méi)有poly (A)尾巴，開(kāi)放閱讀框編碼由3410個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多聚蛋白 前體。前體蛋白在宿主信號(hào)肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的作用下被切割成3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、 prM 和 E)和 7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
[0004] E蛋白是一種囊膜蛋白，編碼501個(gè)氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守區(qū)和變 異區(qū)。E蛋白位于成熟病毒顆粒表面，在病毒吸附受體、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過(guò) 程中具有重要的作用，且含有多種抗原表位，這些表位與病毒識(shí)別宿主細(xì)胞膜受體、吸附和 進(jìn)入細(xì)胞，病毒的致病性和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答等密切相關(guān)，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋 白還具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，是宿主抗感染免疫的主要保護(hù)性抗原，也是檢測(cè)該 病毒特異性抗體的理想靶抗原。
[0005] 噬菌體展示技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)分子間相互作用的有效手段，具 有快捷、高效、表型和基因型一致等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于肽類(lèi)藥物、抑制肽、抗原模擬 表位的篩選等研究領(lǐng)域。利用噬菌體展示技術(shù)篩選鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合的 多肽，并研究該多肽對(duì)DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖方面的影響，可為DTMUV的防治提供一 個(gè)新的途徑，具有較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽。
[0007] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
[0011] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽的應(yīng)用，具體為特異性結(jié)合肽在制備抗鴨 坦布蘇病毒?。ㄒ种气喬共继K病毒增殖，如抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖）的 藥物或飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明通過(guò)基因工程方法獲得DTMUV HN1株E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作 為靶標(biāo)，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，其氨基 酸序列為：THRSWQGNSWYM。該特異性結(jié)合肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞 的增殖。標(biāo)準(zhǔn)MTT法檢測(cè)E蛋白特異性結(jié)合肽對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，多 肽本身對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。熒光定量PCR和TCID50檢測(cè)E蛋白特異性 結(jié)合肽對(duì)鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖方面的影響，結(jié)果顯示，該多肽在不同濃度 (0. 02 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)下均能顯著下調(diào)鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維 細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)，同時(shí)顯著降低鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒滴度。結(jié)果 表明，E蛋白特異性結(jié)合肽能抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖，在鴨坦布蘇病毒 病的防治中具有良好的應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E構(gòu)建示意圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ELISA檢測(cè)噬菌體展示肽對(duì)靶分子的結(jié)合活性；
[0016] 圖3為實(shí)施例1中噬菌體陽(yáng)性克隆競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果；
[0017] 圖4為試驗(yàn)例中DRMUV HN1株E蛋白特異性結(jié)合肽對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影 響；
[0018] 圖5為試驗(yàn)例中特異性結(jié)合肽對(duì)DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響 (Real time PCR)；
[0019] 圖6為試驗(yàn)例中特異性結(jié)合肽對(duì)DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響 (TCID50)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 本實(shí)施例中鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽的篩選，包括以下步驟：
[0023] 1)常規(guī)方法制備DTMUV HN1株囊膜E蛋白
[0024] (1)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_E的構(gòu)建
[0025] 根據(jù)GenBank發(fā)表的DTMUV HN1株E蛋白的基因序列（序列號(hào)：JQ669731)，利用 DNAStar軟件分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1和P2,引物兩端分別加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I 和Xba I及保護(hù)性堿基（Takara公司合成），下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn)。
[0026] 上游引物 PI :5' -CCG GAATTC TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'（如 SEQ ID NO: 2,下劃 線(xiàn)部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）；
[0027] 下游引物 P2 :5' -CGATCTAGA ATTGACATTTACTGCCAGG-3'（如 SEQ ID NO: 3,下劃線(xiàn) 部分為Xba I酶切位點(diǎn)）。
[0028] 常規(guī)方法提取DTMUV HN1株RNA (病毒RNA提取試劑盒，南京Tiangen有限公司）， 通過(guò)常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR獲取E蛋白的基因全長(zhǎng)序列（Invitrogen -步法RT-PCR試劑盒），將 獲取的E蛋白基因克隆入pMD18-T載體中，并進(jìn)行測(cè)序。將pMD18-T載體上的E蛋白基因 目的片段經(jīng)EcoR I與Xba I酶切后，克隆入pET32a載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E，并 用EcoR I與Xba I雙酶切和PCR進(jìn)行鑒定，鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒即為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E， 送上海Invitrogen公司測(cè)序（見(jiàn)圖1)。
[0029] (2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_E的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0030] 采用CaCl2轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pET32a-E轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞 中，篩選陽(yáng)性克隆，即為含DTMUV HN1株E蛋白的基因的陽(yáng)性基因工程菌株。將陽(yáng)性基因工 程菌株于37°C培養(yǎng)，待A_值達(dá)到0. 5時(shí)（0. 4?0. 6均可），加 IPTG至終濃度為0. 8mM， 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)的菌體，超聲波破碎，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，并以鴨抗DTMUV-1血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG為二抗對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn) 行Western blot分析，最后用DAB顯色試劑盒顯色。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心并收獲沉淀， 以洗滌液（5mM咪唑，0. 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7. 9)重懸菌體后，經(jīng)超聲波裂解后離 心，將可溶性表達(dá)上清用蛋白質(zhì)Ni柱親和層析進(jìn)行純化，具體操作過(guò)程參照Novagen公司 His .bind purification kit說(shuō)明書(shū)，E蛋白經(jīng)鎳柱純化后，即獲得DTMUV HN1株E蛋白。
[0031] 2)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)的親和篩選
[0032] (1)包被純化的DTMUV HN1株E蛋白
[0033] 將上述基因工程表達(dá)的E蛋白以TBS稀釋為10 μ g/mL，取稀釋后的E蛋白包被酶 標(biāo)板，100 μ L/孔，放置濕盒中4°C過(guò)夜；次日傾棄包被液，加入含0. 05 % Tween20的TBST洗 滌3次（每次靜置3min)，叩干，然后以含5 %脫脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔，置濕 盒中37°C封閉2h ;傾棄封閉液，以含0. 05% Tween20的TBST溶液洗滌3次，叩干，將包被 好的酶標(biāo)板封口，于4°C保存待用。
[0034] (2)親和篩選
[0035] 以TBST稀釋原始文庫(kù)（購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs，NEB公司）至1 X 10npfu/ mL，取稀釋后的文庫(kù)液100 μ L加入到預(yù)先包被E蛋白的酶標(biāo)板孔內(nèi)，放置濕盒中4°C過(guò)夜。 次日棄孔內(nèi)液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0. 2M Glycine-HCl (pH2. 2)，于室 溫溫和搖動(dòng)l〇min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，加入15yLlM Tris-HCl(pH9. 1)中 和上述洗脫液。測(cè)定少量（?1 μ L)洗脫物的滴度，剩余洗脫物加入到20mL ER2738培養(yǎng)物 中（菌體處于對(duì)數(shù)前期），37°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4. 5h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，4°C 12,000rpm 離心10min。上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再離心。取80%上清轉(zhuǎn)入新管中，加入1/6體積 的PEG/NaCl，4°C沉淀過(guò)夜。次日，4°C 12,000rpm離心PEG沉淀15min。棄上清，再短暫離 心，棄去殘留上清。沉淀物重懸于lmL TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C離心5min使殘 余細(xì)胞沉淀。上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育 30min(15?60min均可）。4°C離心10min，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸棄殘余上 清。沉淀物重懸于200 μ L TBS、0. 02% NaN3中。離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn) 入新的離心管中，即為第一輪擴(kuò)增后的噬菌體洗脫物。根據(jù)常規(guī)M13方法用LB/IPTG/Xgal 平板測(cè)定擴(kuò)增后洗脫物的滴度。將第一輪擴(kuò)增后的噬菌體液以TBS稀釋為IX 10npfu/mL， 取100 μ L加入到預(yù)先包被E蛋白的酶標(biāo)板孔中進(jìn)行第二輪篩選，37°C溫育2h，棄孔內(nèi)液， 并用含0. 05% Tween20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體的擴(kuò)增和滴度的測(cè) 定，重復(fù)以上步驟進(jìn)行第三輪篩選。
[0036] 在篩選過(guò)程中，將每輪投入篩選的噬菌體量記為Input、洗脫得到的噬菌體量記為 Output,分析比較每輪產(chǎn)出/投入比（Input/Output)情況，來(lái)反映特異性結(jié)合噬菌體的富 集程度。經(jīng)過(guò)3輪篩選發(fā)現(xiàn)：淘選獲得的噬菌體越來(lái)越多，特異性越來(lái)越強(qiáng)，其中第三輪噬 菌體滴度為2. 3X 106pfu/mL。噬菌體產(chǎn)出投入比逐輪提高（見(jiàn)下表1)，表明具有特異性結(jié) 合作用的噬菌體顯示較好的富集效果。
[0037] 表1三輪親和篩選對(duì)噬菌體的富集
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽，其特征在于：所述 的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
3. -種如權(quán)利要求1或2所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽的應(yīng)用，其特 征在于：所述鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼 料添加劑中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽的應(yīng)用，其特征在于： 所述鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結(jié)合肽在制備抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞 增殖的藥物或飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104193804SQ201410361045
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】王臣, 張才, 何雷, 牛明媚, 張春杰 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)