Carabin在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Carabin在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，通過主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)模擬心肌肥厚疾病模型研究Carabin基因的表達(dá)與心肌肥厚之間的關(guān)系，結(jié)果表明Carabin基因過表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能，即Carabin基因具有能夠保護(hù)心臟功能和抑制心肌肥厚的作用?；贑arabin基因的作用，Carabin可用于制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，為心肌肥厚的治療提供了一條有效的新途徑。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種Carabin (TBC1D10C)在治療心 肌肥厚中的功能和應(yīng)用，具體是在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚藥物中的應(yīng)用。 Carab i η在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，心血管疾病已成為威脅人類生命健康的全球性慢性非傳染 性疾病之一。目前，慢性心力衰竭病死率迅速增長，毫無疑問地成為威脅人類生命的重要病 癥之一?；A(chǔ)和臨床研究證實(shí)心力衰竭往往是由心肌肥厚（Cardiac Hypertrophy)演變而 來的，研究表明，心肌肥厚是冠心病、高血壓、心律失常、心臟瓣膜病及心肌病等多種心血管 疾病的共同病理生理過程，顯著增加心力衰竭的發(fā)病率和病死率，且是多種心血管并發(fā)癥 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，隨著左室肥厚的進(jìn)展，心肌缺血、惡性室性心律失常、心力衰竭、心 源性猝死等心血管事件的發(fā)生率增加6-10倍。因此，闡明心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對(duì)防治 慢性心力衰竭等心血管疾病具有重要意義，研究其分子機(jī)制能為未來尋找防治心肌肥厚的 新靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)，并產(chǎn)生深遠(yuǎn)的臨床實(shí)踐意義和廣大的社會(huì)價(jià)值。
[0003] 心肌肥厚是指心臟在遺傳、環(huán)境、多種生理及病理因素的作用下，為了適應(yīng)心臟做 功增加而出現(xiàn)的心臟重量和體積增加，主要以心肌細(xì)胞體積增大和細(xì)胞外基質(zhì)增多為特 征。心肌肥厚由多種因素調(diào)節(jié)，且是一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。研究表明持續(xù)的壓力和/或容 量負(fù)荷過度，可增加室壁應(yīng)力，導(dǎo)致心肌肥厚。大體可見心臟重量明顯增加、心室結(jié)構(gòu)改變； 細(xì)胞水平上可見，心肌細(xì)胞長度和/或?qū)挾仍龃?，肌?jié)數(shù)量增加、排列紊亂，膠原含量增加， 纖維組織過度增生，細(xì)胞排列紊亂松散；分子水平上，轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管緊張素 II、內(nèi) 皮素、兒茶酚胺等各種胞外刺激信號(hào)可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)胚胎型基因的表達(dá)，從而促使細(xì) 胞發(fā)生肥大表型變化，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。然而，現(xiàn)有的研究并不能完全詮釋心肌肥厚 的發(fā)生機(jī)制。因此，尋找抑制心肌肥厚的特異性分子，對(duì)于進(jìn)一步闡述心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展 機(jī)制，具有重大的理論意義，可為臨床防治心肌肥厚提供新靶點(diǎn)和新策略。
[0004] Carabin又稱TBC1D10C，是TBC域家族成員10C，最開始在鼠和人系統(tǒng)性紅斑狼 瘡的B細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄體組鑒定，Carabin在細(xì)胞中的低表達(dá)，引起學(xué)者對(duì)Carabin在B細(xì) 胞中的蛋白功能的研究。有研究表明Carabin作為calcineurin (|丐調(diào)神經(jīng)磷酸酶）的內(nèi) 源性抑制劑，可以負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，通過其羧基末端域與鈣神經(jīng)素相互作用，抑制 calcineurin的活化及Ras信號(hào)通路【1】；在B細(xì)胞中Carabin免疫缺陷會(huì)增加 BCR (B細(xì) 胞受體）-TLR9 (Toll樣受體）共同刺激誘導(dǎo)的自身免疫，缺失Carabin的B細(xì)胞經(jīng)TLR9 (Toll樣受體9)激動(dòng)劑CpG-DNA刺激后，會(huì)加速B細(xì)胞的早期響應(yīng)，從而使小鼠更易得抗 dsDNA產(chǎn)物和狼瘡腎耀斑【2】。已有研究表明calcineurin介導(dǎo)的通路是心肌肥厚發(fā)生、發(fā) 展的關(guān)鍵性途徑【3,4,5】;Madhu Gupta等發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中富集表達(dá)的microRNA-378通 過靶向Ras信號(hào)通路，參與抑制心肌肥厚的發(fā)生【6】。因此，Carabin可能在心肌肥厚中起 到重要作用，為心肌肥厚引起的心臟疾病的治療研究提供的新的思路。
[0005]【參考文獻(xiàn)】 1、 Pan F，Sun L，Kardian DB，et al. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin. Nature. 2007 Jan 25;445(7126):433-6. 2、 Schickel JN，Pasquali JL，Soley A，et al. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity. EMBO Mol Med. 2012 Dec;4(12) :1261-75. 3、 Booz GW. Putting the brakes on cardiac hypertrophy ：exploiting the N〇-cGM P counter-regulatory system. Hypertension，2005,45 :341-346. 4、 Wilkins BJ，Molkentin JD. Calcineurin and cardiac hypertrophy ：where have we been? Where are we going? J physiol,2002,541 ：l-8. 2 5、 Frey N，Katus HA，Olson EN，et al.Hypertrophy of the heart :a new therapeutic target. Circulation，2004,109 :1580-1589. 6、 Nagalingam RS， Sundaresan NR, Gupta MP， et al. A cardiac enriched microRNA, miR-378 blocks cardiac hypertrophy by targeting Ras-signaling. J Biol Chem. 2013 Apr 19;288(16):11216-32〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定Carabin的表達(dá)和心 肌肥厚的相互關(guān)系，提供一種Carabin在篩選保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/治療心肌 肥厚的藥物中的應(yīng)用，提供一個(gè)用于保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的 革巴基因 Carabin的新用途。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明通過試驗(yàn)確定Carabin表達(dá)與心肌肥厚之間的關(guān)系： Carabin基因過表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能：本發(fā)明選用心臟 特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手 術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后 通過對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進(jìn)行心心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究 Carabin基因過表達(dá)對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明過表達(dá)Carabin基 因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護(hù)心功能（圖1、圖2、圖3、圖4)。
[0008] 由以上結(jié)果可知Carabin基因過表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能。 因此Carabin基因具有保護(hù)心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是Carabin基因 能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病發(fā)生的作用。
[0009] -種Carabin在心肌肥厚中的功能，主要體現(xiàn)在Carabin基因具有保護(hù)心功能和 抑制心肌肥厚的作用，特別是Carabin基因能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚發(fā)生的 作用。
[0010] 針對(duì)Carabin的上述功能，提供一種Carabin的應(yīng)用，主要體現(xiàn)為Carabin在保護(hù) 心臟和治療心肌肥厚中的應(yīng)用，特別是Carabin在制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/ 或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
[0011] -種保護(hù)心臟功能的藥物，包含Carabin。
[0012] 一種預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，包含Carabin。
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Carabin基因的新功能，即Carabin基因具有能夠保護(hù)心臟功能和抑制 心肌肥厚的作用。
[0014] (2)基于Carabin在保護(hù)心臟功能和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制 備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是NTG和TG小鼠 AB模型8周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié) 果顯示 Carabin 過表達(dá)會(huì)抑制 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL (* :p <0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0016] 圖2是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心臟組織HE染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì) 柱狀圖，結(jié)果顯示Carabin過表達(dá)會(huì)抑制心肌細(xì)胞肥大（* :p < 0. 05 vs NTG Sham組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0017] 圖3是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示Carabin 過表達(dá)會(huì)抑制心臟的纖維化。
[0018] 圖4是NTG和TG小鼠 AB模型4周后超聲檢測心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示 Carabin過表達(dá)顯著保護(hù)心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期 內(nèi)徑、EF為射血分?jǐn)?shù)、FS為短軸縮短率（* :p < 0· 05 vs NTG Sham組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0020] 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g，雄性，心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠 (TG，心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠由武漢大學(xué)心血管病研究所李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建） 及非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG，同齡同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0021] 心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGGCCCAGGCCCTGGGAGA ;下游引物： GCCAAGCTTAGAATCGGGTGTCCAGGAAA)擴(kuò)增小鼠 Carabin 全長基因（NCBI，Gene ID: 108995, NM_178650)，把擴(kuò)增的Carabin全長基因連接于心肌肌球蛋白重鏈（α-MHC)啟 動(dòng)子下游，將構(gòu)建的序列通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心臟特異 性Carabin轉(zhuǎn)基因老鼠。（上述的轉(zhuǎn)基因小鼠參照下述文獻(xiàn)制備：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF 級(jí)大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24°C之間，濕度在 40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0022] 實(shí)施例1心肌肥厚（AB)模型獲得 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)和非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG)，通過 主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型。隨機(jī)分為4組，分組如下：非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（NTG Sham)及AB術(shù)組（NTG AB)、心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（TG Sham)及AB術(shù)組 (TG AB)。
[0023] 2.心肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，模型操作流程： 2. 1術(shù)前準(zhǔn)備 (1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計(jì)算所需麻藥（3%戊巴比妥鈉）量，通過腹 腔注射，并記錄注射時(shí)間點(diǎn)。夾尾、夾趾無明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)(一般 注射后約lOmin無明顯反應(yīng)，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng)，麻醉后30min左右為最佳 手術(shù)時(shí)間）。
[0024] (2)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備：將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗 布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，以不影響手術(shù)視野為宜。
[0025] (3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng) 聲門準(zhǔn)確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管 與呼吸機(jī)連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致，說明氣管插管成功。
[0026] 2. 2主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù) 取右側(cè)臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊 入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分?jǐn)?shù)為75%酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。左手持眼科鑷 將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約lcm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水 平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器針頭，將血管及 針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達(dá)到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完畢后依次縫合，關(guān)閉胸 腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出lcc氣體以恢復(fù)胸腔內(nèi)負(fù)壓，拔出注射器后迅速縫 合皮膚切口。假手術(shù)組（Sham)在游離出主動(dòng)脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同心肌肥厚 (AB)模型組。
[0027] 2.3術(shù)后護(hù)理 主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)，拔出氣管插管，并 將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。非 轉(zhuǎn)基因小鼠及心臟特異性Carabin轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后8周分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。
[0028] 實(shí)施例2小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纖維化檢測 1.取材 (1)前期工作：預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號(hào)、 組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KC1溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分 析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。
[0029] (2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KC1 溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后， 稱重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測。
[0030] (3)相關(guān)測量及計(jì)算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后 肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計(jì)算心重與體重的比值（HW/BW)，肺重與體重的比值 (LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值（HW/TL)。
[0031] 2.病理學(xué)檢測 2. 1制備石錯(cuò)標(biāo)本切片 主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一 切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0032] 2.2蘇木精-伊紅（HE)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氫鈉 0. 35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸饋水）lmin -水洗 lmin -伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024) 3_5min -蒸饋水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s - 95%酒 精I(xiàn)s - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干， 顯微鏡拍照。
[0033] HE染色圖片統(tǒng)計(jì)：每張圖片選擇3個(gè)以上邊界清楚，核大致位于中央的細(xì)胞，用 Image-Pro Plus 6. 0軟件圈細(xì)胞面積。
[0034] 2. 3天狼星紅（PSR)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水沖洗lOmin -雙蒸水lmin -質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 2%磷鑰酸 2min - 0. 1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min -去除殘液一0. 01N鹽 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0035] 心肌組織由心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細(xì)胞失去增 殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細(xì)胞反應(yīng)，只能是單個(gè)細(xì)胞的體積增大而不能 在數(shù)量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，肌節(jié) 數(shù)量增多，細(xì)胞排列紊亂，心臟間質(zhì)改變包括心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，膠原纖維密度 增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調(diào)等。
[0036] 圖1、圖2、圖3是NTG和Carabin-TG小鼠 AB模型后的表型結(jié)果。結(jié)果表明NTG 小鼠 AB術(shù)后8周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后8周TG小鼠的HW/BW、 LW/BW及HW/TL增大的程度明顯小于NTG小鼠（圖1)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均 增大，且AB術(shù)后TG小鼠心臟增大的程度遠(yuǎn)小于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：Sham組 心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密，形態(tài)完整，胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；AB組肌絲排列紊亂、 松散，心肌細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，TG小鼠 AB術(shù) 后心肌細(xì)胞橫截面積大于Sham組，顯著小于NTG小鼠 AB組（圖2)。PSR染色可見，發(fā)現(xiàn)AB 組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加，動(dòng)脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排 列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀；TG小鼠 AB術(shù)后心肌間質(zhì)膠原含量及血管周圍膠原含量均小于NTG小鼠 AB組（圖3)。以上結(jié)果說明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，Carabin-TG小鼠的心 肌肥厚程度小于NTG小鼠。
[0037] 實(shí)施例3心肌肥厚（AB)模型小鼠超聲檢測心功能 1前期準(zhǔn)備 (1)麻醉機(jī)準(zhǔn)備：先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口，再擰開麻醉機(jī)上加藥口密封 蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調(diào)整流量控制閥的旋 鈕，出氣壓力維持在〇· 2-0. 3mPa。
[0038] (2)待測小鼠準(zhǔn)備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的 小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1. 5-2. 0%異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。
[0039] 2心功能檢測 小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司）。采用 高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內(nèi)徑 (LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD)、射血分?jǐn)?shù)（EF)及短軸縮短率（FS)。
[0040] 本實(shí)施例運(yùn)用Μ型超聲心動(dòng)圖檢測評(píng)價(jià)心肌肥厚和心功能。圖4是NTG和 Carabin-TG小鼠 ΑΒ模型后的超聲檢測結(jié)果。與NTG Sham組相比，NTG小鼠 ΑΒ術(shù)后8周 表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD增大，而反映心 功能的指標(biāo)EF、FS則下降。AB術(shù)后8周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、 LVESD增大的程度及反應(yīng)心功能的指標(biāo)EF、FS下降的程度則小于NTG組。這些結(jié)果與TG小 鼠心肌肥厚被抑制的結(jié)果一致。
[0041] 由以上結(jié)果可知，在主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，Carabin基因過表 達(dá)顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能。因此Carabin基因具有保護(hù)心功能和抑制心 肌肥厚及纖維化的作用，特別是Carabin基因能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān) 疾病發(fā)生的作用。
[〇〇42] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 SEQUENCE LISTING 〈110>武漢大學(xué) 〈120〉Carabin在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用 <130> 1 <160> 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 〈223>上游引物 <400> 1 gttgtcgacg ccaccatggc ccaggccctg ggaga 35 <210> 2 〈211〉 29 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence 〈220〉 〈223>下游引物 〈400> 2 gccaagctta gaatcgggtg tccaggaaa 29
【權(quán)利要求】
1. Carabin在制備保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
2. -種保護(hù)心臟功能的藥物，其特征在于：包含Carabin。 3. Carabin在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中應(yīng)用。
4. 一種預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，其特征在于：包含Carabin。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104107418SQ201410377412
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】李紅良, 蔣丁勝, 鄧克窮, 張曉東 申請人:武漢大學(xué)