有效的偶聯(lián)物和親水性連接體的制作方法
【專利摘要】用于將藥物與細(xì)胞結(jié)合劑結(jié)合的連接體通過(guò)并入聚乙二醇間隔物被修飾為親水性連接體。該細(xì)胞結(jié)合劑-藥物偶聯(lián)物在各種癌細(xì)胞類型中的效價(jià)或功效令人吃驚地增加數(shù)倍，包括在對(duì)治療有抗性的細(xì)胞表面或癌細(xì)胞上表達(dá)低數(shù)量抗原的那些癌細(xì)胞類型。
【專利說(shuō)明】有效的偶聯(lián)物和親水性連接體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年4月30日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980125295. 2、發(fā)明名稱為有效 的偶聯(lián)物和親水性連接體的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2008年4月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/049, 289的優(yōu)先權(quán)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及新的連接體，所述新的連接體以連接體有助于增加藥物活性的方式將 藥物（例如細(xì)胞毒劑）連接至細(xì)胞結(jié)合劑（例如抗體）。特別地，本發(fā)明涉及新的親水性連 接體的應(yīng)用，其中這樣的連接體在多種癌細(xì)胞類型中增強(qiáng)了細(xì)胞結(jié)合劑-藥物偶聯(lián)物的效 價(jià)或功效數(shù)倍，所述癌細(xì)胞類型包括在對(duì)治療具有抗性的細(xì)胞表面或癌上表達(dá)少量抗原的 那些。

【背景技術(shù)】
[0004] 細(xì)胞毒性藥物的抗體偶聯(lián)物正被開發(fā)為靶向特異性治療劑。針對(duì)多種癌細(xì)胞 表面抗原的抗體已與抑制各種主要細(xì)胞靶點(diǎn)的不同細(xì)胞毒劑偶聯(lián)，所述主要細(xì)胞靶點(diǎn)如 微管（美登木素生物堿、阿里他汀類（31!1^# &^118)、紫杉烷：美國(guó)專利號(hào)5,208,020; 5, 416, 064 ；6, 333, 410 ；6, 441, 163 ；6, 340, 701 ；6, 372, 738 ；6, 436, 931 ；6, 596, 757 ； 7,276,497)，DNA(加里剎霉素（calicheamicin)、阿霉素、CC-1065類似物；美國(guó)專利號(hào) 5, 475, 092 ;5, 585, 499 ;5, 846, 545 ;6, 534, 660 ;6, 756, 397 ;6, 630, 579)。與這些細(xì)胞毒 性藥物的一些的抗體偶聯(lián)物在臨床中正在積極地研究用于癌癥治療（Richart，A. D.，和 Tolcher, A. W. ,2007, Nature Clinical Practice,4,245-255) 〇
[0005] -般而言，抗體-細(xì)胞毒劑偶聯(lián)物通過(guò)對(duì)抗體上的反應(yīng)性部分進(jìn)行初始修飾進(jìn) 行制備，所述抗體上的反應(yīng)性部分如賴氨酸氨基或半胱氨酸基團(tuán)（通過(guò)使用分子生物學(xué) 方法在抗體上進(jìn)行天然二硫鍵的還原或其它非天然半胱氨酸殘基的改造產(chǎn)生的）。因此 抗體首先用異雙官能連接體試劑進(jìn)行修飾，這樣的試劑如之前描述的那些，示例為SPDB、 SMCC和SIAB(美國(guó)專利號(hào)6,913,758和美國(guó)專利公布號(hào)20050169933)，以將連接體與 反應(yīng)基如混合的吡啶基二硫、馬來(lái)酰亞胺或鹵代乙酰胺結(jié)合?？贵w中結(jié)合的反應(yīng)性連接 體基團(tuán)隨后與含有反應(yīng)性部分如硫羥基團(tuán)的細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。另一偶聯(lián)路線是通過(guò)含有 硫羥反應(yīng)基（如鹵代乙酰胺或馬來(lái)酰亞胺）的細(xì)胞毒劑衍生物與細(xì)胞結(jié)合劑上的硫羥 基團(tuán)的反應(yīng)。通過(guò)還原天然二硫殘基（R. Singh等，Anal. Biochem. ,2002, 304,147-156) 或還原結(jié)合的二硫部分（經(jīng)SPDP，琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯，隨后用 二硫蘇糖醇還原，D. G. Gilliland 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1980, 77,4539-4543)， 或通過(guò)并入另外的非天然半胱氨酸殘基（J.B. Stimmel等，J. Biol. Chem.，2000,275， 30445-30450)，將硫羥基團(tuán)引入細(xì)胞結(jié)合劑如抗體上，或者通過(guò)與2-亞氨基硫烷 (iminothiolane) (R. Jue 等，Biochemistry，1978,17, 5399-5406)或者甲基 3-疏基丙亞氨 酸酯（mercaptopropionimidate ester) (Τ· P. King等，Biochemistry，1978,17,1499-1506) 反應(yīng)并入硫羥基團(tuán)。
[0006] 具有二硫鍵或硫醚鍵的抗體-細(xì)胞毒劑偶聯(lián)物是細(xì)胞內(nèi)切割的，這大概在溶酶體 中進(jìn)行，以將活性細(xì)胞毒劑遞送至癌細(xì)胞內(nèi)（H.K. Erickson等，2006, Cancer Research, 66， 4626-4433)。除了殺死靶細(xì)胞之外，具有可還原的二硫鍵的抗體-細(xì)胞毒劑偶聯(lián)物還殺死 體外抗原陰性細(xì)胞和抗原陽(yáng)性細(xì)胞的混合種群中和體內(nèi)異種移植物模型中的鄰近的抗原 陰性細(xì)胞，這暗示靶細(xì)胞釋放的細(xì)胞毒劑增強(qiáng)對(duì)具有異源抗原表達(dá)的腫瘤中鄰近的非抗原 表達(dá)細(xì)胞的功效中的作用（Υ· V. Kovtun 等，Cancer Research，2006,66, 3214-3221)。
[0007] 盡管抗體-細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)物顯示出體外殺死細(xì)胞的活性和體內(nèi)抗癌活性，但 是在很多情況下其效力被減小，尤其是當(dāng)靶癌細(xì)胞上的抗原表達(dá)較低時(shí)，或者當(dāng)靶細(xì)胞對(duì) 治療具有抗性時(shí)。這在臨床情況中是很常見的情況，導(dǎo)致在患者中產(chǎn)生低至中度的抗癌活 性。嘗試克服抗性的可能方法是合成帶有親水性或疏脂性功能的新藥物（見G. Szokacs等， Nature Reviews，5 ;219-235, 2006)。但是，該方法是繁雜的，并且必須合成幾種類似物，并 且通常藥物結(jié)構(gòu)的修飾導(dǎo)致生物活性的損失。因此，需要不同的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 通過(guò)設(shè)計(jì)新的連接體以使藥物與細(xì)胞結(jié)合劑以連接體有助于增強(qiáng)藥物活性的方 式連接，本發(fā)明致力于解決抗性的問題。因此，本發(fā)明增強(qiáng)藥物與細(xì)胞結(jié)合劑連接的方式， 以使連接體設(shè)計(jì)提供對(duì)寬范圍的腫瘤有活性的偶聯(lián)物，特別是在低抗原表達(dá)或藥物抗性的 腫瘤中。
[0009] 本發(fā)明基于這樣的新發(fā)現(xiàn)：當(dāng)傳統(tǒng)的連接體（例如SMCC、SIAB等，在美國(guó)專利公布 號(hào)20050169933中所描述的）通過(guò)并入聚乙二醇[PEG n，（_CH2CH20)n)]分隔物被修飾為親 水性連接體，細(xì)胞結(jié)合劑-藥物偶聯(lián)物在多種癌細(xì)胞類型中的效價(jià)或功效令人驚奇地增加 數(shù)倍，所述多種癌細(xì)胞類型包括在細(xì)胞表面上表達(dá)較低數(shù)量抗原的那些。
[0010] 同樣，這些含PEG的偶聯(lián)物出乎意外地比前述的偶聯(lián)物對(duì)治療有抗性的細(xì)胞系更 有效。
[0011] 此外，在抗體偶聯(lián)物的情況下，并入親水性連接體允許每個(gè)抗體分子偶聯(lián)上至15 個(gè)藥物分子，具有高產(chǎn)量并且沒有聚集或沉淀。具有將上至15個(gè)藥物分子與每個(gè)抗體分子 連接的親水性連接體的這些偶聯(lián)物以高親合力連接至靶抗原（與未修飾抗體的靶抗原類 似）。
[0012] 因此，本發(fā)明提供式（1)的化合物或式（Γ )的具體化合物：
[0013] Z-X1-(_CH2 _CH2_0_) n_ Yp_D (I)
[0014] D_Yp_ (_CH2_CH2_0 _) n_X「Z (1，）
[0015] 其中：
[0016] Z表示能夠與細(xì)胞結(jié)合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團(tuán)；
[0017] D表示藥物；
[0018] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0019] Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價(jià)鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0020] L 為 0 或 1 ;
[0021] P為0或1;以及
[0022] η為1到2000的整數(shù)。
[0023] 本發(fā)明的另一方面為式（2)的細(xì)胞結(jié)合劑藥物偶聯(lián)物或式（2'）的具體化合物：
[0024] CB-[X1-(-CH2-CH2-O-) n-Yp_D]m (2)
[0025] [D-Yp-(-CH2-CH2-O-) n-Xjm-CB (2，）
[0026] 其中，CB表示細(xì)胞結(jié)合劑；
[0027] D表示藥物；
[0028] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0029] Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價(jià)鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0030] 1 為 0 或 1 ;
[0031] p 為 0 或 1;
[0032] m為2至Ij 15的整數(shù)；以及
[0033] η為1到2000的整數(shù)。
[0034] 本發(fā)明的另一方面為式（3)化合物或式（3'）的具體化合物：
[0035] Z_X「（_CH2_CH20 _) n_Y_D (3)
[0036] D_Y_ (_CH2_CH20_) n-XfZ (3，）
[0037] 其中：
[0038] Z表示能夠與細(xì)胞結(jié)合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團(tuán)；
[0039] D表示藥物；
[0040] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0041] Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、非芳香族雜環(huán)或芳香族雜環(huán)單元；
[0042] 1為0或1 ;以及
[0043] η為1到14的整數(shù)。
[0044] 本發(fā)明的另一方面為式（4)的細(xì)胞結(jié)合劑藥物偶聯(lián)物或式（4'）的具體化合物：
[0045] CB- (X1- (-CH2-CH2O-) n_Y_D) m (4)
[0046] [D_Y_ (-CH2-CH2O-) J1-Xjm-CB (4，）
[0047] 其中，CB表示細(xì)胞結(jié)合劑；
[0048] D表示藥物；
[0049] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0050] Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0051] 1為0或1;以及
[0052] m為3至8的整數(shù)；以及
[0053] η為1至14的整數(shù)。
[0054] 本發(fā)明的甚至進(jìn)一步的方面是用一種治療癌癥的方法，所述癌癥對(duì)用所述方法的 治療敏感，所述方法包括將有效劑量的含式（2)或（4)的偶聯(lián)物的組合物腸胃外給予需要 其的患者。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表示 (mAb =單克隆抗體）。
[0056] 圖2顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表示。
[0057] 圖3顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的二硫連接的化合物的結(jié)構(gòu)表示。
[0058] 圖4顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的合成方案。
[0059] 圖5顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的合成方案。
[0060] 圖6顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的化合物的合成方案：a.)合成用于與細(xì)胞 結(jié)合劑1步偶聯(lián)的含PEG二硫連接的化合物；和b.)合成異雙官能的含PEG二硫連接的交 聯(lián)化合物。
[0061] 圖7顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（一步偶 聯(lián)）。
[0062] 圖8顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（2步偶 聯(lián)）。
[0063] 圖9顯示本發(fā)明的含PEG的硫醚連接的（硫代乙酰胺基連接的）偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò) 程（1步偶聯(lián)）。
[0064] 圖10顯示本發(fā)明的含PEG的硫醚連接的（硫代乙酰胺基連接的）偶聯(lián)物的偶聯(lián) 過(guò)程（2步偶聯(lián)）。
[0065] 圖11顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（1步偶聯(lián)）。
[0066] 圖12顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（2步偶聯(lián)）。
[0067] 圖13顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成 方案。
[0068] 圖14顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（1步偶 聯(lián)）。
[0069] 圖15顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（2步偶 聯(lián)）。
[0070] 圖16顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰胺基連接的化合物的合成方案： a.)合成用于1步偶聯(lián)的含PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰胺連接的化合物；和b.)合成用于2 步偶聯(lián)的異雙官能的含PEG的巰基反應(yīng)性交聯(lián)化合物。
[0071] 圖17顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（1步偶聯(lián)）。
[0072] 圖18顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（2步偶聯(lián)）。
[0073] 圖19顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應(yīng)性硫代醚連接的化合物的合成方案：a)合 成用于1步偶聯(lián)的含PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰胺基連接的化合物；和b.)合成用于2步 偶聯(lián)的同雙官能的含PEG的巰基反應(yīng)性交聯(lián)化合物。
[0074] 圖20顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（1步偶聯(lián)）。
[0075] 圖21顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程（2步偶聯(lián)）。
[0076] 圖22顯示去糖基化HuAb-PEG4Mal-DMl偶聯(lián)物（10. 7DM1/Ab，平均）的質(zhì)譜圖 (MS)。
[0077] 圖23顯示HuAb-PEG4Mal-DMl偶聯(lián)物（1(λ 7DM1/Ab，平均）的體積排阻色譜（SEC)。
[0078] 圖24顯示與未修飾的抗體相似的HuAb-PEG4Mal_DMl偶聯(lián)物（10. 7美登木素生物 堿/抗體）的FACS結(jié)合。
[0079] 圖25顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)多耐藥性的C0L0205-MDR細(xì) 胞的細(xì)胞毒性。
[0080] 圖26顯示抗CanAg抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)多耐藥性的C0L0205-MDR細(xì) 胞的細(xì)胞毒性。
[0081] 圖27顯示抗⑶56抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)Molp-8多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的 細(xì)胞毒性。
[0082] 圖28顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)HCT15細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0083] 圖29顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)COLO 205mdr細(xì)胞的細(xì)胞毒 性。
[0084] 圖30顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)HCT15異種移植物的體內(nèi)抗 腫瘤活性。
[0085] 圖31顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)C0L0205mdr異種移植物的體 內(nèi)抗腫瘤活性。
[0086] 圖32顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)COLO 205異種移植物的體內(nèi) 抗腫瘤活性。
[0087] 圖33顯示抗CanAg抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)COLO 205mdr異種移植物的 體內(nèi)抗腫瘤活性。
[0088] 圖34顯示具有上至17個(gè)D/A的抗CanAg抗體（huC242) -PEG24-Mal-DM1偶聯(lián)物 的結(jié)合。
[0089] 圖35顯示具有4至17D/A的抗CanAg抗體（huC242)-PEG24-Mal-DMl偶聯(lián)物對(duì) COLO 205細(xì)胞的體外效價(jià)。
[0090] 圖36顯示具有4至17D/A的抗CanAg抗體（huC242) -PEG24-Mal-DM1偶聯(lián)物對(duì)多 耐藥性（PgP+)的C0L0205-MDR細(xì)胞的體外效價(jià)。
[0091] 圖37顯示抗EGFR抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對(duì)U0-31細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0092] 圖38顯示抗體-PEG4-Mal-DM1的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)。

【具體實(shí)施方式】
[0093] 本發(fā)明公開了這樣的新發(fā)現(xiàn)：通過(guò)聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體（(_CH2CH 20)n) 與藥物例如細(xì)胞毒劑連接的細(xì)胞結(jié)合劑如抗體的偶聯(lián)物，對(duì)靶癌細(xì)胞顯示出比基于與傳統(tǒng) 具有典型脂肪族連接體和類似藥物負(fù)載的細(xì)胞結(jié)合劑藥物偶聯(lián)物的比較所預(yù)期的大數(shù)倍 的細(xì)胞毒性。重要的是，本發(fā)明所述的偶聯(lián)物對(duì)于對(duì)用細(xì)胞毒性藥物治療具有低敏感性的 多耐藥性（mdr)的癌細(xì)胞是非常有力的或有效的。癌癥治療造成克服在用不同的化療劑進(jìn) 行多輪治療后經(jīng)常遇到的耐藥性機(jī)制的困難。一種稱為多耐藥性的在癌細(xì)胞中觀察到的這 類機(jī)制由ATP結(jié)合盒（ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引起的增強(qiáng)的藥物輸出造成（C. Drumond,B. I. Sikic, J. Clin. Oncology,1999,17,1061-1070, G, Szokacs 等，Nature Reviews, 5 ;219-234,2006)。 克服這些耐藥性機(jī)制的治療，如通過(guò)癌細(xì)胞干擾或克服藥物的這種流出將是非常有用的。 針對(duì)多耐藥性癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性藥物的PEG連接的偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性進(jìn)行 評(píng)估以檢測(cè)PEG連接體是否賦予針對(duì)這些抗性細(xì)胞的任何優(yōu)勢(shì)。在這些針對(duì)mdr細(xì)胞的分 析中，與傳統(tǒng)連接體衍生的非常低效偶聯(lián)物相比，細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性藥物的PEG連接 的偶聯(lián)物顯示出對(duì)mdr細(xì)胞的殺滅出乎意料地高效。另外，本發(fā)明的偶聯(lián)物還在用多耐藥 性的腫瘤類細(xì)胞所建立的動(dòng)物模式中顯示出顯著更高的抗腫瘤活性。
[0094] 使用親水的聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體（PEG或PEO ; (-CH2CH2O) n)還允許每個(gè) 細(xì)胞結(jié)合劑分子并入相對(duì)大量的藥物，在大于治療應(yīng)用期望的lmg/ml的濃度下具有大于 90%的高蛋白單體水平。此外，具有一定范圍的細(xì)胞毒性藥物負(fù)載（與每個(gè)細(xì)胞結(jié)合劑連 接的從較小值2到較大數(shù)字例如15個(gè)藥物）的細(xì)胞結(jié)合劑的聚乙二醇（PEG)連接的偶聯(lián) 物對(duì)靶癌細(xì)胞顯示出比基于偶聯(lián)物增加的藥物負(fù)載而在藥物遞送方面的化學(xué)計(jì)量增加所 預(yù)期的顯著增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。細(xì)胞結(jié)合劑和具有PEG間隔物的藥物的偶聯(lián)物在本發(fā)明中被 描述，與傳統(tǒng)由類似藥物負(fù)載制備的偶聯(lián)物相比，其顯示出對(duì)靶癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性的超化 學(xué)計(jì)量增加達(dá)到260-650倍的效力增強(qiáng)（參見例如圖29)。
[0095] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，描述了具有聚乙二醇間隔物（_〇12〇120) 11和能與細(xì) 胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)基的連接體的藥物。
[0096] 在該方面具體考慮的是式（1)的修飾化合物或式（Γ )的具體化合物。
[0097] Z-X1-(_CH2 _CH2_0_) n_ Yp_D (I)
[0098] D_Yp_ (_CH2_CH2_0 _) n_X「Z (1，）
[0099] 其中：
[0100] Z表示能夠與細(xì)胞結(jié)合劑結(jié)合形成酰胺或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團(tuán)：
[0101] D表示藥物；
[0102] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0103] Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價(jià)鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0104] 1 為 0 或 1;
[0105] p為0或1;以及
[0106] η為1到2000的整數(shù)。
[0107] 優(yōu)選地，將Y連接至藥物的共價(jià)鍵是硫醚鍵或酰胺鍵。
[0108] 優(yōu)選地η為1至100的整數(shù)。甚至更優(yōu)選地，η為1至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方 面中，η為1至4的整數(shù)。
[0109] 在本發(fā)明的第二方面，描述了具有聚乙二醇連接體（_CH2CH20) n的細(xì)胞結(jié)合劑與藥 物的新的偶聯(lián)物。這些偶聯(lián)物比具有傳統(tǒng)連接體和等同藥物負(fù)載的偶聯(lián)物對(duì)癌細(xì)胞更有效 力。
[0110] 在優(yōu)選的方面具體考慮的是細(xì)胞結(jié)合劑與式（2)的藥物或式（2'）的具體化合物 的偶聯(lián)物：
[0111] CB- [X1- (-CH2-CH2-O-) n-Yp-D] m (2)
[0112] [D-Yp-(-CH2-CH2-O-) J1-X1 ]m_CB (2，）
[0113] 其中：
[0114] CB表示細(xì)胞結(jié)合劑；
[0115] D表示藥物；
[0116] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0117] Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價(jià)鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0118] 1 為 0 或 1;
[0119] p 為 0 或 1;和
[0120] m為2到15的整數(shù)；以及
[0121] η為1到2000的整數(shù)。
[0122] 優(yōu)選地，共價(jià)鍵為硫醚鍵或酰胺鍵。
[0123] 優(yōu)選地，m為3至8的整數(shù)。
[0124] 優(yōu)選地，η為1至100的整數(shù)。甚至更優(yōu)選地，η為1至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方 面中，η為1至4的整數(shù)。
[0125] 本發(fā)明還基于新的發(fā)現(xiàn)：在抗體偶聯(lián)物的情況中，其中抗體經(jīng)二硫鍵連接至細(xì)胞 毒性藥物，在增強(qiáng)免疫連接物的效價(jià)或功效方面，在連接的藥物的數(shù)目和聚乙二醇間隔物 的長(zhǎng)度之間存在重要的相關(guān)性。這種連接體設(shè)計(jì)的其它優(yōu)點(diǎn)是，抗體-藥物偶聯(lián)物的期望 的高單體比例和最小化的聚集。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明基于這樣的重要發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用于二 硫連接的偶聯(lián)物的聚乙二醇間隔物由2至8個(gè)之間的乙烯氧基單元組成并且連接的藥物的 數(shù)目在3至8的范圍內(nèi)時(shí)，其賦予抗體-藥物偶聯(lián)物最高的生物學(xué)效價(jià)或功效，同時(shí)給予期 望的高單體含量。
[0126] 在優(yōu)選的方面，描述了經(jīng)二硫基（-S-S-)連接的細(xì)胞毒性藥物，其具有帶有能夠 與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的官能團(tuán)的短的聚乙二醇間隔物（(CH 2CH20)n = 1_14)。
[0127] 在該方面具體考慮的是式（3)的修飾的細(xì)胞毒性化合物或式（3'）的具體化合 物：
[0128] Z-X1- (_CH2_CH20_) n_Y_D (3)
[0129] D_Y_ (_CH2_CH20_) n-XfZ (3，）
[0130] 其中：
[0131] Z表示能夠與細(xì)胞結(jié)合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團(tuán)；
[0132] D表示藥物；
[0133] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0134] Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、非芳香族雜環(huán)或芳香族雜環(huán)單元；
[0135] 1為0或1;以及
[0136] η為1到14的整數(shù)。
[0137] 優(yōu)選地，η為2至8的整數(shù)。
[0138] 在另一優(yōu)選的方面，描述了經(jīng)二硫基（-S-S-)連接的細(xì)胞結(jié)合劑和藥物的偶聯(lián) 物，其具有帶有窄范圍的3-8個(gè)藥物負(fù)載的聚乙二醇間隔物（(CH 2CH20)n = 1_14)，其顯示出對(duì) 癌細(xì)胞相對(duì)高效力的生物學(xué)活性，并且具有期望的生物學(xué)性能：高偶聯(lián)產(chǎn)率、高單體比和最 小化的蛋白聚集。
[0139] 在該方面具體考慮的是式（4)的細(xì)胞結(jié)合劑藥物偶聯(lián)物或式（4'）的具體化合 物：
[0140] CB- (X1- (-CH2-CH2O-) n_Y_D) m (4)
[0141] [D-y- (-CH2-CH2O-) n-X1Jm-CB (4,）
[0142] 其中：
[0143] CB表示細(xì)胞結(jié)合劑；
[0144] D表示藥物；
[0145] X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；
[0146] Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；
[0147] 1 為 0 或 1;
[0148] m為3至8的整數(shù)；以及
[0149] η為1至14的整數(shù)。
[0150] 優(yōu)選地，m為3至6的整數(shù)。
[0151] 同樣，優(yōu)選地，η為2至8的整數(shù)。
[0152] 在本發(fā)明中，藥物是親脂性分子，當(dāng)其與細(xì)胞結(jié)合劑如抗體偶聯(lián)時(shí)，經(jīng)常由于蛋白 聚集或沉淀而導(dǎo)致產(chǎn)率損失。增加每個(gè)細(xì)胞結(jié)合劑的藥物的數(shù)目通常導(dǎo)致更嚴(yán)重的蛋白聚 集和沉淀，隨后是差的單體百分比和低的產(chǎn)率。與具有傳統(tǒng)連接體的典型偶聯(lián)物行為相比， PEG連接體導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)合劑與藥物的偶聯(lián)物在可用于治療應(yīng)用的lmg/ml或更高的高濃度 下單體百分比（> 90%單體）和產(chǎn)率（> 70% )的期望增加。此外，這些偶聯(lián)物在4°C下 延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)是穩(wěn)定的。
[0153] 在所有的方面，"脂肪族單元"被定義為烷基、烯基或炔基。烷基是脂肪族烴基，其 可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地在鏈中或環(huán)中具有1至20個(gè)碳原子，優(yōu)選地具有3至10個(gè) 碳原子。更優(yōu)選的烷基在鏈中具有1至12個(gè)碳原子。"支化"意指一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基 如甲基、乙基或丙基連接至直鏈烷基鏈。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正 丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
[0154] 烯基是含有碳碳雙鍵的脂肪族烴基，其可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地鏈中具有2 至15個(gè)碳原子。更優(yōu)選的烯基鏈中具有2至12個(gè)碳原子；更優(yōu)選地在鏈中具有約2至4 個(gè)碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正 戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。
[0155] 炔基是含有碳碳叁鍵的脂肪族烴基，其可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地鏈中具有2 至15個(gè)碳原子。更優(yōu)選的炔基鏈中具有2至12個(gè)碳原子；更優(yōu)選地在鏈中具有約2至4 個(gè)碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔 基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。
[0156] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)〃芳香族單元〃意指取代的或未取代的芳基，其由6至14個(gè)碳 原子--優(yōu)選6至10個(gè)碳原子--的芳香族單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)組成。示例性的芳基包 括苯基和蔡基。取代基包括但不限于燒基、齒素、硝基、氣基、輕基和燒氧基。
[0157] 鹵素包括氟、氯、溴和碘原子。氟和氯原子是優(yōu)選的。
[0158] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)單元"指飽和的、部分不飽和的或不飽和的、非芳香族穩(wěn)定 的3至14個(gè)，優(yōu)選地5至10個(gè)成員組成的單、雙或多環(huán)--其中環(huán)的至少一個(gè)成員為雜原 子，或者是芳香族的、優(yōu)選地5至10個(gè)成員組成的、帶有至少一個(gè)雜原子的單、雙或多環(huán)。通 常，雜原子包括但不限于：氧、氮、硫、硒和磷原子。優(yōu)選的雜原子是氧、氮和硫。
[0159] 優(yōu)選的雜環(huán)單元包括但不限于：吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、環(huán)氧乙烷基、 四氫!咲喃基、-氧戊環(huán)基、四氫!批喃基、-聰'燒基、-氧戊環(huán)基、脈陡基、脈嚷基、嗎琳 基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氫硫代吡喃基、二噻烷基、硫代 嗎啉基、二氫吡喃基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、四氫氮茚基 (tetrahydropyrinidinyl)、二氫硫代批喃基、氮雜環(huán)庚燒基（azepanyl)、批咯基、批陡基、 吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、噴哚基、喹啉基（quinolinyl)、嘌呤基、咪唑基、噻 吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2,4_噻二唑基（thiadiazolyl)、異噻唑 基、三唑基（triazoyl)、四唑基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯 并咪唑基和異嗯唑基、吡啶基-N-氧化物，以及與苯基縮合得到的稠合系統(tǒng)。
[0160] X和Y表示的脂肪族、芳香族和雜環(huán)單元也可具有帶電荷取代基。帶電荷取代基可 以是帶負(fù)電荷的一其選自但不限于：羧酸根、磺酸根和磷酸根，或者是帶正電荷的一選 自叔胺基團(tuán)或季胺基團(tuán)。
[0161] 如本文所用，表達(dá)"與細(xì)胞結(jié)合劑連接"指經(jīng)由合適的連接基團(tuán)或其前體與細(xì)胞結(jié) 合劑連接的包含至少一種藥物衍生物的偶聯(lián)物分子。優(yōu)選的連接基團(tuán)為硫羥或二硫鍵或其 前體。
[0162] 如本文所用，給定基團(tuán)的"前體"指通過(guò)任意去保護(hù)、化學(xué)改性或偶聯(lián)反應(yīng)可得到 該官能團(tuán)的任何基團(tuán)。例如，前體可以是適當(dāng)保護(hù)的官能團(tuán)，其實(shí)例為硫酯或硫醚作為硫羥 前體。
[0163] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)性官能團(tuán)"指胺_、硫羥-或羥基-反應(yīng)性官能團(tuán)。換句話 說(shuō)，反應(yīng)性官能團(tuán)可與細(xì)胞結(jié)合劑上存在的胺、巰基（硫羥）或羥基反應(yīng)。例如，對(duì)于胺反 應(yīng)性官能團(tuán)，該官能團(tuán)可以是反應(yīng)性羧酸酯（包括N-琥珀酰亞胺基酯、N-磺基琥珀酰亞胺 基酯、N-苯鄰二甲酰亞胺基酯、N-磺基苯鄰二甲酰亞胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基 酯、2，4-二硝基苯基酯、3-磺基-4-硝基苯基酯、3-羧基-4-硝基苯基酯、四氟苯基酯）、反 應(yīng)性磺酸衍生物或反應(yīng)性硫酯以生成酰胺鍵；對(duì)于硫羥反應(yīng)性官能團(tuán)，該官能團(tuán)可以是馬 來(lái)酰亞胺、鹵代乙酰胺或乙烯砜以生成硫醚鍵；對(duì)于羥基反應(yīng)性官能團(tuán)，該官能團(tuán)可以是反 應(yīng)性羧酸酯以生成酯鍵。
[0164] A.具有親水性連接體的修飾的藥物和修飾的細(xì)胞結(jié)合劑
[0165] 連接體是能夠以穩(wěn)定共價(jià)方式將藥物如美登木素生物堿連接至細(xì)胞結(jié)合劑的任 何化學(xué)部分。在藥物或細(xì)胞結(jié)合劑保持活性的條件下，連接體能夠易于進(jìn)行酸誘導(dǎo)切割、光 誘導(dǎo)切割、肽酶誘導(dǎo)切割、酯酶誘導(dǎo)切割和二硫鍵切割，或?qū)λ鼈兓旧夏褪堋D1、2和3 示例性地提供本發(fā)明的偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表示。
[0166] 在藥物和細(xì)胞結(jié)合劑間形成連接體的、包含親水性PEG鏈的合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng) 域熟知的或商業(yè)上可獲得的（例如來(lái)自Quanta Biodesign，Powell,Ohio)。也可以使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)技術(shù)由本身商業(yè)上可獲得的PEG合成合適的含PEG交 聯(lián)劑。通過(guò)本文所述的方法，藥物可與雙官能的含PEG交聯(lián)劑反應(yīng)以形成式（1)的化合物 Z-X1-GCH2-CH2-O-)n-Y p-D。例如，含硫羥的美登木素生物堿藥物可與帶有PEG間隔物的雙 馬來(lái)酰亞胺基交聯(lián)劑反應(yīng)以生成經(jīng)硫醚鍵與PEG間隔物連接的美登木素生物堿藥物（參見 例如圖13)。然后，帶有PEG間隔物和末端馬來(lái)酰亞胺基的該修飾的美登木素生物堿可以與 如圖14所示的細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)以提供本發(fā)明的式（2)的細(xì)胞結(jié)合劑-藥物偶聯(lián)物。
[0167] 可選地，細(xì)胞結(jié)合劑可以首先在帶有胺反應(yīng)基如N-羥基琥珀酰亞胺酯的雙官能 的含PEG的交聯(lián)劑的一端進(jìn)行反應(yīng)，以生成通過(guò)酰胺鍵與連接體共價(jià)連接的修飾的細(xì)胞結(jié) 合劑（參見例如圖15)。在下一步中，美登木素生物堿與PEG間隔物另一端上的馬來(lái)酰亞胺 基取代基進(jìn)行反應(yīng)，以生成本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)合劑-藥物偶聯(lián)物。
[0168] 圖16和17以示例的方式顯示PEG交聯(lián)劑的合成及其與美登木素生物堿通過(guò)硫代 乙酰胺基鍵的反應(yīng)。馬來(lái)酰亞胺基取代基然后被并入PEG以能夠經(jīng)硫醚鍵與細(xì)胞結(jié)合劑的 反應(yīng)。可選地，如圖18所示，細(xì)胞結(jié)合劑首先通過(guò)硫醚鍵與PEG交聯(lián)劑連接。該修飾的細(xì) 胞結(jié)合劑然后與美登木素生物堿藥物反應(yīng)以生成偶聯(lián)物。同雙官能PEG交聯(lián)劑的合成示于 例如圖19中，其中PEG間隔物的兩端都包括碘乙酰胺基部分，碘乙酰胺基部分能夠使細(xì)胞 毒性藥物和細(xì)胞結(jié)合劑經(jīng)硫醚鍵連接以生成含親水性PEG間隔物的偶聯(lián)物。提供本發(fā)明的 偶聯(lián)物的偶聯(lián)過(guò)程示于例如圖20和21中。
[0169] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它具有不同反應(yīng)基的含PEG的交聯(lián)劑可通過(guò)本文 所述的方法容易地合成。例如，具有羥基的藥物，如19-去甲基美登木素生物堿（美國(guó)專利 號(hào)4, 361，650)可與碘-乙酰-PEG連接體（圖5)在堿如碳酸鉀的存在下反應(yīng)以經(jīng)醚鍵與 美登木素生物堿連接。類似地，含胺的美登木素生物堿（如美國(guó)專利號(hào)7, 301，019中所述 的進(jìn)行合成）可與碘乙酰PEG(圖5所示）在堿如吡啶或三乙胺的存在下反應(yīng)以提供經(jīng)胺 鍵與PEG連接的美登木素生物堿。為了經(jīng)由酰胺鍵將藥物與PEG連接，羧基-PEG(示于圖 5)可與含胺的美登木素生物堿在縮合劑如二環(huán)己基碳二亞胺的存在下反應(yīng)，以提供酰胺鍵 合的PEG-美登木素生物堿。為了經(jīng)由氨基甲酸酯鍵將藥物與PEG間隔物連接，PEG首先與 雙光氣反應(yīng)以提供PEG氯甲酸酯，其然后與含胺的美登木素生物堿在堿如三乙胺的存在下 反應(yīng)以生成氨基甲酸酯連接的PEG-美登木素生物堿。
[0170] 合適的連接體的實(shí)例包括具有用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的N-琥珀酰亞胺基酯或 N-磺基琥珀酰亞胺基酯部分以及用于與藥物反應(yīng)的基于馬來(lái)酰亞胺基或鹵乙?；牟糠?的連接體。PEG間隔物可以通過(guò)本文所述的方法被并入本領(lǐng)域已知的任何交聯(lián)劑中。能 夠與PEG間隔物結(jié)合的包含馬來(lái)酰亞胺基部分的交聯(lián)劑包括但不限于：N-琥珀酰亞胺基 4_(馬來(lái)酰亞胺基甲基）環(huán)己烷羧酸酯（SMCC)、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲 基）_環(huán)己烷-1-羧基- (6-酰氨基己酸酯）--其是SMCC的"長(zhǎng)鏈"類似物（LC-SMCC)、 κ -馬來(lái)酰亞胺基i^一烷酸N-琥珀酰亞胺基酯（KMUA)、γ -馬來(lái)酰亞胺基丁酸N-琥珀酰 亞胺基酯（GMBS)、ε -馬來(lái)酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（EMCS)、間-馬來(lái)酰亞胺 基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯（MBS)、N-( α -馬來(lái)酰亞胺基乙酰氧基）_琥珀酰亞胺 酯（AMAS)、琥珀酰亞胺基-6-( β -馬來(lái)酰亞胺基丙酰胺基）己酸酯（SMPH)、Ν-琥珀酰亞胺 基4-(對(duì)-馬來(lái)酰亞胺基苯基）-丁酸酯（SMPB)和N-(對(duì)-馬來(lái)酰亞胺基苯基）異氰酸酯 (PMPI)。含有鹵代乙?；糠值慕宦?lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙酰）-氨基苯甲酸 酯（SIAB)、N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯（SIA)、N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯（SBA)和N-琥珀酰 亞胺基3-(溴乙酰胺基）丙酸酯（SBAP)。
[0171] 其它不含硫原子的交聯(lián)劑也可以被用在本發(fā)明的方法中。這種連接體可以衍生自 基于二元羧酸的部分。合適的基于二元羧酸的部分包括但不限于：以下所示的通式的α， ω_二羧酸：
[0172] HOOC-A ' p_E ' (CH2CH2O) nG ' r-C00H
[0173] 其中A'是任選的具有2到20個(gè)碳原子的直鏈或支化的烷基、烯基或炔基，E'是 任選的具有3到10個(gè)碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基，G'是任選的具有6到10個(gè)碳原子的取代 或未取代的芳香基，或取代或未取代的雜環(huán)基，其中雜原子選自N、0或S，并且其中p、q和 r每個(gè)均為0或1，條件是p、q和r不同時(shí)全為0, η是1到2000的整數(shù)。
[0174] 本文公開的連接體的許多在美國(guó)專利公布號(hào)20050169933中詳細(xì)描述。
[0175] 在本發(fā)明的另一方面，通過(guò)將雙官能交聯(lián)劑與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)來(lái)修飾細(xì)胞結(jié)合 齊[J，因此產(chǎn)生連接體分子與細(xì)胞結(jié)合劑的共價(jià)連接。如本文所用，"雙官能交聯(lián)劑"是將細(xì)胞 結(jié)合劑與藥物如本文所述的藥物共價(jià)連接的任何化學(xué)部分。在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，一部 分連接部分由藥物提供。在這方面，藥物包含這樣的連接部分：其為用于將細(xì)胞結(jié)合劑與藥 物連接的較大連接體分子的一部分。例如，為了形成美登木素生物堿DM1，美登素的C-3羥 基處的側(cè)鏈被修飾以具有自由的巰基（SH)。該硫羥酸化形式的美登素可與修飾的細(xì)胞結(jié)合 劑反應(yīng)以形成偶聯(lián)物。因此，最終的連接體由兩組分組成，其中一個(gè)組分由交聯(lián)劑提供，而 另一個(gè)組分由DMl的側(cè)鏈提供。
[0176] 在本發(fā)明的另一方面，藥物經(jīng)二硫鍵與細(xì)胞結(jié)合劑連接。連接體分子包括能夠與 細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的優(yōu)選的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)為 N-琥珀酰亞胺基酯和N-磺基琥珀酰亞胺基酯。另外，連接體分子包括反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，優(yōu) 選為能夠與藥物反應(yīng)形成二硫鍵的二硫代吡啶基。特別優(yōu)選的連接體分子包括例如，N-琥 珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（STOP)(參見例如，Carlsson等，Biochem. J.， 173 :723-737(1978))、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基）丁酸酯（STOB)(參見例如， 美國(guó)專利號(hào)4, 563, 304)、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基）戊酸酯（SPP)(參見例如， CAS登記號(hào)341498-08-6)以及其它反應(yīng)性交聯(lián)劑如美國(guó)專利號(hào)6, 913, 748中描述的那些， 其以其整體通過(guò)引用并入本文。
[0177] 可選地，如在美國(guó)專利號(hào)6, 441，163B1中所述，藥物可以首先被修飾以引入適合 于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性酯。包含活化的連接體部分的這些藥物與細(xì)胞結(jié)合劑的反應(yīng) 提供生產(chǎn)細(xì)胞結(jié)合劑藥物偶聯(lián)物的另一種方法。為了連接siRNA' s，SiRNA可以通過(guò)常用 于寡核苷酸修飾的方法與本發(fā)明的交聯(lián)劑連接（參加例如，美國(guó)專利公布號(hào)20050107325 和20070213292)。因此，其3'或5' -亞磷酰胺（phosphoramidite)形式的siRNA與帶有 羥基官能團(tuán)的交聯(lián)劑的一端反應(yīng)以在siRNA和交聯(lián)劑之間生成酯鍵。類似地，siRNA亞磷 酰胺與帶有末端氨基的交聯(lián)劑的反應(yīng)使得交聯(lián)劑與siRNA通過(guò)胺連接。
[0178] B.細(xì)胞結(jié)合劑
[0179] 在本發(fā)明中使用的細(xì)胞結(jié)合劑是與癌細(xì)胞上的靶抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（例 如免疫球蛋白和非免疫球蛋白蛋白）。這些細(xì)胞結(jié)合劑包括以下：
[0180] -抗體，其包括：
[0181] -表面重塑抗體（美國(guó)專利號(hào)5, 639, 641);
[0182] -人源化或完全人抗體（人源化或完全人抗體選自但不限于：huMy9_6、huB4、 huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNT095、B-B4、曲妥單抗（trastuzumab)、比伐單抗 (bivatuzumab)、西羅珠單抗（sibrotuzumab)、帕妥珠單抗（pertuzumab)和利妥昔單抗 (1^1^丨11^13)(參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,639,641、5,665,357和7,342，110 ;美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)?zhí)?0/424, 332 ;國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/16,401 ;美國(guó)專利公布號(hào)20060045877 ;美國(guó)專利 公布號(hào) 20060127407 ;美國(guó)專利公布號(hào) 20050118183 ;Pedersen 等，（1994) J. Mol. Biol. 235， 959-973 ；Roguska 等，(1994)Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol91,969-973 ;Colomer等，Cancer Invest. ,19 :49-56(2001) ;Heider等，Eur.J. Cancer, 31A :2385-2391 (1995) ;Welt 等，J. Clin. Oncol.，12 :1193-1203(1994);以及 Maloney 等， Blood，90 :2188-2195(1997));和
[0183] -抗體的表位結(jié)合片段如 sFv、Fab、Fab' 和 F(ab'）2 (Parham，J. Tmmunol. 131 ： 2895-2902(1983) ;Spring 等，J. Immunol. 113 :470-478(1974) ;Nisonoff 等，六1"。11· Biochem. Biophys. 89 :230-244(1960))。
[0184] 其它細(xì)胞結(jié)合劑包括其它細(xì)胞結(jié)合蛋白和多肽，其示例為但不限于：
[0185] -錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPins ;Zahnd 等，J. Biol. Chem.，281，46, 35167-35175， (2006) ；Binz, Η. K. , Amstutz, P. &Pluckthun, A. (2005)Nature Biotechnology,23, 1257-1268)或錨蛋白樣重復(fù)蛋白或合成肽，其例如在美國(guó)專利公布號(hào)20070238667 ;美國(guó) 專利號(hào) 7, 101，675 ;W0/2007/147213 和 W0/2007/062466 中描述；
[0186] -干擾素（例如α、β、Y);
[0187] _ 淋巴因子如 IL-2、IL-3、IL-4、IL-6 ;
[0188] -激素如胰島素、TRH(促甲狀腺激素釋放激素）、MSH(黑素細(xì)胞刺激素）、類固醇 激素如雄激素和雌激素；和
[0189] -生長(zhǎng)因子和集落刺激因子如EGF、TGF-a、IGF-I、G-CSF、M-CSF和 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5 :155-158 (1984))〇
[0190] 當(dāng)細(xì)胞結(jié)合劑為抗體時(shí)，其結(jié)合至為多肽并且可以是跨膜分子（例如受體）或配 體如生長(zhǎng)因子的抗原。示例性的抗原包括諸如腎素的分子；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和 胎牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰 蛋白酶；胰島素 A-鏈；胰島素 B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血 糖素；凝血因子如因子vmc、因子IX、組織因子（TF)和von Willebrands因子；抗凝血因 子如蛋白C ;心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶 酶原激活物（t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子- α和-β ;腦啡肽酶； RANTES(對(duì)通常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌的活化的調(diào)節(jié)）；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP-1-α);血 清白蛋白，諸如人血清白蛋白；苗勒（Muellerian)抑制物質(zhì)；松弛素 A-鏈；松弛索B-鏈； 前松弛素；鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，諸如β-內(nèi)酰胺酶；DNase ;IgE ;細(xì)胞毒性 T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA)，諸如CTLA-4 ;抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF); 激素或生長(zhǎng)因子的受體：蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，諸如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子（BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子諸如 NGF-β ;血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子諸如aFGF和bFGF;表皮生長(zhǎng)因 子（EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)，諸如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、 TGF-β 4 或 TGF-β 5 ;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II) ;des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、 CEA、TENB2、EphA 受體、EphB 受體、葉酸受體、FOLRl、間皮素（mesothelin)、cripto、α ν β 6、 整聯(lián)蛋白、VEGF、VEGFR、運(yùn)鐵蛋白受體、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ;CD 蛋白，諸如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、 CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、 CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152 ;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài) 發(fā)生蛋白（BMP);干擾素，諸如干擾素-α、_β和-Y ;集落刺激因子（CSFs)，例如M-CSF、 GM-CSF和G-CSF ;白細(xì)胞介素（ILs)，例如，IL-I到IL-IO ;超氧化物岐化酶；T-細(xì)胞受體； 表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如，例如HIV包膜蛋白的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢 受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ; 腫瘤相關(guān)抗原諸如HER2、HER3或HER4受體；以及以上列出任一多肽的片段，抗體模擬 Adnectins (美國(guó)申請(qǐng)20070082365)，或在美國(guó)專利
【發(fā)明者】R·辛格, Y·科夫通, S·D·威廉, R·V·J·查里 申請(qǐng)人:伊繆諾金公司