人rpl34基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人RPL34基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開了人RPL34基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進一步構(gòu)建了人RPL34基因小分子干擾RNA、人RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體、人RPL34基因干擾慢病毒并公開了它們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人RPL34基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中RPL34基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人RPL34基因的用途及其相關(guān)藥物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及人RPL34的用途及其相關(guān)藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 核糖核酸干擾現(xiàn)象（RNA interference, RNAi)是一種對于病毒感染的免疫反應(yīng)， 最早在植物中發(fā)現(xiàn)，主要指一些短片段的雙鏈RNA能夠使特定的mRNA分解，以此阻斷此基 因的表達。RNAi目前已經(jīng)是一種運用在功能性基因體學研究上相當廣泛的有效工具，也 可以用RNAi來做基因篩檢（genomic screening)來研究癌癥的分子作用機轉(zhuǎn)。同時也用 于廣泛性的研究多重基因的多型性對腫瘤表現(xiàn)型的影響。自1998年首次以某段基因特 異性雙股RNA引入線蟲的細胞中，發(fā)現(xiàn)它可以調(diào)控基因表現(xiàn)后[Fire A，Xu S, Montgomery MKj Kostas SAj Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998,391:806-811. Timmons L，F(xiàn)ire A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature 1998,395:854·]，在隨 后至今的時間內(nèi)，RNAi的相關(guān)技術(shù)已經(jīng)可以運用在培養(yǎng)的哺乳類細胞，甚至整個動物 中，所以RNAi已經(jīng)成為研發(fā)癌癥標靶治療法的主流工具[Gaither AiIourgenko V.RNA interference technologies and their use in cancer research. Curr Opin Oncol 2007,19:50-54. al-Khodairy F，Enoch T，Hagan IM，Carr AM. The Schizosaccharomyces pombe hus5gene encodes a ubiquitin conjugating enzyme required for normal mitosis. J Cell Sci 1995, 108(Pt 2):475-486.]。例如，在人類食道癌細胞株中使用 siRNA來針對Bcl-XL，對Bcl-XL來進行抑制可以使細胞生長受到抑制和引起凋亡；在乳腺 癌細胞中轉(zhuǎn)入針對 c-myc 的 siRNA[Wang YH，Liu S，Zhang G，Zhou CQ，Zhu HX，Zhou XB，et al.Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF_7breast tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res 2005, 7: R220-228·]，會使乳腺癌細 胞生長速度大幅降低；在惡性黑色素瘤中如果利用RNAi技術(shù)干擾BRAF(-種致癌基因） 的表達會大大降低腫瘤生長和浸潤能力[Sumimoto H，Miyagishi M，Miyoshi H，Yamagata SjShimizu AjTaira Kjet al. Inhibition of growth and invasive ability of melanoma by inactivation of mutated BRAF with lentivirus-mediated RNA interference. Oncogene 2004,23:6031-6039.];在肺小細胞癌中利用RNAi方式干擾S phase的激酶 相關(guān)蛋白2(kinase_associated protein 2)的表達同樣可以抑制腫瘤的生長和MPK信 號通路的激活[Sumimoto H，Yamagata Sj Shimizu A, Miyoshi Hj Mizuguchi Hj Hayakawa T，et al. Gene therapy for human small-cell lung carcinoma by inactivation of Skp-2with virally mediated RNA interference. Gene Ther 2005, 12:95-100. ]〇
[0003] 核糖體是合成蛋白質(zhì)的細胞器，唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且 精確地合成多肽鏈。主要由核糖體蛋白和rRNA兩種成分組成，前者大概占40%左右。核 糖體蛋白不僅參與蛋白質(zhì)的合成，在mRNA翻譯、細胞生長增殖、基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細胞分化凋 亡等方面也發(fā)揮重要功能。由此核糖體也廣泛參與人類疾病的發(fā)生發(fā)展，例如RPS19的缺 失會引起先天性貧血、RPL12、RPL30與生長發(fā)育不全等疾病相關(guān)，而核糖體蛋白在腫瘤的發(fā) 生發(fā)展過程中也起到至關(guān)重要的作用。例如，RPL5、RPL7a、RPL18、RPs3在直腸結(jié)腸癌中， RPS18，RPL3和RPL8在卵巢癌中，RPL5、RPL9、RPL35在肝癌中均存在表達異常的現(xiàn)象等。而 RPs8、RPS12、RPS18、RPS24、RPL13a、RpL18、RPL28、RPL32 和 RPL35a 等核糖體蛋白結(jié)腸癌中 表現(xiàn)為明顯下調(diào)表達的趨勢。
[0004] 鑒于核糖體蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)聯(lián)，因此有希望將核糖體蛋白作為今 后腫瘤預防、臨床診斷、腫瘤治療等方向的靶向蛋白。
[0005] RPL34 (60s亞基核糖體蛋白L34)是由RPL34基因編碼的核糖體蛋白，定位 于人類4號染色體長臂2區(qū)5帶（4q25)，共含有2個外顯子區(qū)，編碼117個氨基酸 [Kenmochi N, Kawaguchi T, Rozen S, Davis E, Goodman N, Hudson TJ, et al. A map of 75human ribosomal protein genes. Genome Res 1998, 8:509-523. Couch FJ, Rommens JM, Neuhausen SL, Belanger C, Dumont M, Abel K,et al. Generation of an integrated transcription map of the BRCA2region on chromosomel3ql2-ql3.Genomics 1996, 36:86-99.]，其中第12位絲氨酸和和第36位賴氨酸可能會分別存在磷酸化和乙酰 化的修飾（UniProtKB/Swiss-Prot(P49207. 3)。RPL34屬于核糖體蛋白L34E家族，定位 于細胞質(zhì)且在不同物種間進化高度保守（NCBI Reference Sequence:NP_000986. 2)。對 于RPL34的研究主要集中在植物和昆蟲中，如通過對蚊子與埃及伊蚊的脂肪體研究發(fā)現(xiàn)， 在卵黃蛋白前體、卵黃蛋白的合成過程，原核糖體的循環(huán)積累和降解是必需的，而RPL34在 此過程中主要與RPS6、RPL8相互協(xié)同發(fā)揮功能，并受營養(yǎng)環(huán)境調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著 表達變化[Niu LL, Fallon AM. Differential regulation of ribosomal protein gene expression in Aedes aegypti mosquitoes before and after the blood meal. Insect Mol Biol 2000,9:613-623·]。細胞周期蛋白依賴性激酶-5(CDK5)是調(diào)控細胞周期重要 激酶，在神經(jīng)退行性疾病中有重要作用。通過生化分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)RPL34也作為⑶K5的抑 制劑調(diào)控CDK5的激酶活性、磷酸化水平從而影響細胞周期與轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件[Moorthamer M,Chaudhuri B.Identification of ribosomal protein L34as a novel Cdk5inhibitor. Biochem Biophys Res Commun 1999,255:631-638·]。在植物的損傷應(yīng)答過程中，RPL34 可以受到芐腺嘌呤（benzyladenine)和蔗糖的調(diào)控而增強自身表達水平（Yu. G-H，An. G, Regulatory roles of benzyl adenine and sucrose during wound response of the ribosomal protein gene, rpL34. PLANT CELL AND ENVIRONMENT 2000 ;23; 1363-1372)。因 此目前對此蛋白的研究多見于植物與昆蟲[Lan Q, Niu LL, FalIon AM. Mosquito ribosomal protein rpL31resembles rat rpL34:cDNA and deduced amino acid sequence. Biochim Biophys Acta 1994,1218:460-462. Dai Z,Gao J, An K, Lee JM1Edwards GE, An G.Promoter elements controlling developmental and environmental regulation of a tobacco ribosomal protein gene L34. Plant Mol Biol 1996, 32:1055-1065. Devitt ML, Stafstrom JP. Cell cycle regulation during growth-dormancy cycles in pea axillary buds. Plant Mol Bioll995, 29:255-265.]，較少涉及哺乳動物，特別是人類同源 蛋白的作用能力了解較少。
[0006] 目前關(guān)于RPL34基因在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的實驗性報道還是一片空白，特別是人肺癌 研究領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于公開與人RPL34基因相關(guān)的治療方法及藥物，以RNA干擾 (RNAi)為手段研究RPL34基因在腫瘤細胞的存活和凋亡過程中的作用。
[0008] 本發(fā)明第一方面，以RNA干擾為手段，研究了 RPL34基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作 用，公開了一種抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括：向腫 瘤細胞施用一種能夠特異性抑制RPL34基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPL34蛋白 的表達或活性的分子，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化和/或存活。
[0009] 所述腫瘤細胞選自其生長與RPL34蛋白的表達或活性相關(guān)的腫瘤細胞。較優(yōu)的， 所述腫瘤細胞選自肺癌。
[0010] 所述抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用 量為足夠降低RPL34基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低RPL34蛋白的表達或活性的劑量。進 一步的，所述RPL34基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0011] 所述分子可選自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、 多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0012] 所述核酸包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶 ΠΙ制備的小干擾RNA(esiRNA)或者短發(fā)夾RNA(ShRNA)。
[0013] 所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有RPL34基因的啟動子序列或RPL34基 因的信息序列。
[0014] 進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第 二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPL34 基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結(jié)合靶序列所 編碼的mRNA片段，并特異性沉默人RPL34基因的表達。
[0015] 進一步的，所述小干擾RNA的第一鏈序列與RPL34基因中的靶序列基本相同。較 優(yōu)的，所述RPL34基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1。
[0016] 所述RPL34基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默RPL34基因表達 時，與所述的小分子干擾RNA互補結(jié)合的mRNA片段所對應(yīng)的RPL34基因中的片段。
[0017] 較佳的，所述RPL34基因來源于人。
[0018] 本發(fā)明第一方面還公開了一種分離的人RPL34基因在制備或篩選腫瘤治療藥物， 或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0019] 進一步的，所述腫瘤選自肺癌。
[0020] 所述將分離的RPL34基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容：其 一，將RPL34基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制 齊U ;其二，將RPL34基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥 物或制劑。
[0021] 所述將RPL34基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應(yīng)用于制備腫瘤治 療藥物或制劑具體是指：將RPL34基因作為RNA干擾作用的靶標，來研制針對腫瘤細胞的藥 物或制劑，從而能降低腫瘤細胞內(nèi)RPL34基因的表達水平。
[0022] 所述將RPL34基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應(yīng)用于篩選腫瘤治 療藥物或制劑具體是指：將RPL34基因作為作用對象，對藥物或制劑進行篩選，以找到可以 抑制或促進人RPL34基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的RPL34基因 小分子干擾RNA (SiRNA)即是以人RPL34基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤 細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將RPL34基因及其蛋白 作為作用對象。
[0023] 所述將RPL34基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將RPL34基因表達產(chǎn)物作為一項 腫瘤診斷指標應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0024] 通過Real-time Quantitative PCR的方法檢測RPL34基因在5株肺癌細胞中的表 達水平。研究發(fā)現(xiàn)：RPL34在5株肺癌細胞中表達豐度為高。提示RPL34可能作為一種癌基 因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；RPL34基因的表達水平可能成為腫瘤診斷的標志。
[0025] 所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制RPL34基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑 制RPL34蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中RPL34基因的表達水平，達到抑制 腫瘤細胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0026] 所述通過分離的RPL34基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物 包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病 毒。
[0027] 所述核酸包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶 ΠΙ制備的小干擾RNA(esiRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。
[0028] 所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人RPL34基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降 低人RPL34蛋白的表達或活性的劑量。以使人RPL34基因的表達至少被降低50%、80%、 90%、95%或 99%。
[0029] 采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人RPL34基因的表達水 平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人RPL34基因表 達水平的物質(zhì)給藥于患者。
[0030] 本發(fā)明第二方面公開了一種降低腫瘤細胞中RPL34基因表達的分離的核酸分子， 所述核酸分子包含：
[0031] a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與RPL34基因雜交的核苷酸 序列；或者
[0032] b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與RPL34基因雜交的核苷酸序列。
[0033] 進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共 同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPL34基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基 本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與RPL34基因中19-23個連續(xù)的核苷酸序列基本相同； 更佳的，所述第一鏈的序列與RPL34基因中19、20或者21個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。
[0034] 更進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補 共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPL34基因中的靶序列基本相同。
[0035] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0036] 進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。更進一步的，所述小干擾RNA第一 鏈的序列如 SEQ ID NO :9 所示，具體為 5' -CGUGCUGUAAGACCUAAAGUU-3'。
[0037] SEQ ID NO :9所示的siRNA為以SEQ ID NO: 1所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計 的、針對人RPL34基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互 補，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源RPL34基因表達的作用。
[0038] 進一步的，所述ShRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段 和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義 鏈片段的序列與RPL34基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后 可成為小干擾RNA(SiRNA)進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源RPL34基因表達的作用。
[0039] 更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段 和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義 鏈片段的序列與RPL34基因中的靶序列基本相同。
[0040] 較佳的，所述正義鏈片段與RPL34基因中19-23個連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更 佳的，所述正義鏈片段與RPL34基因中19、20或者21個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。
[0041] 進一步的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042] 更進一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 14所示，具體為：5' -CCGGCGUGCUGU AAGACCUAAA⑶UCUCGAGAACUUUAG⑶CUUACAGCAC⑶UUUUG-3，。
[0043] shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源性人 RPL34基因表達的作用。
[0044] 編碼本發(fā)明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQ ID NO: 1的序列及 其互補序列。
[0045] 所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與RPL34基因中的靶序列基 本相同，所述RPL34基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默RPL34基因表達時，被所述 siRNA識別并沉默的mRNA片段所對應(yīng)的RPL34基因中的片段。
[0046] 較佳的，所述RPL34基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1的序列。
[0047] 進一步的，所述RPL34基因來源于人。
[0048] 本發(fā)明第三方面，公開了一種RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼本發(fā)明所述 分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。
[0049] 所述的人RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人RPL34基因 shRNA的基 因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體為RPL34基因干 擾慢病毒載體。
[0050] 本發(fā)明的RPL34基因干擾慢病毒載體是將編碼前述RPL34基因 shRNA的DNA片段 克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述RPL34基因干擾慢病毒載體經(jīng) 過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞，進而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通 過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默RPL34基因的表達。
[0051] 進一步的，所述RPL34基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤 細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白 (GFP)。
[0052] 進一步的，所述慢病毒載體可以選自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0053] 本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人RPL34基因干擾慢病毒 載體,命名為 pGCSIL-GFP-RPL34-siRNA。
[0054] 本發(fā)明分離的核酸分子可用于制備預防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為肺癌。
[0055] 本發(fā)明的RPL34基因 siRNA可用于抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療 腫瘤的藥物或制劑。RPL34基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述RPL34基因 SiRNA。當 用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動物。具體劑 量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0056] 本發(fā)明第四方面，公開了一種RPL34基因干擾慢病毒，由前述RPL34基因干擾慢病 毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞 并產(chǎn)生針對RPL34基因的小分子干擾RNA，從而抑制胃癌、肺癌、結(jié)腸癌或膠質(zhì)瘤腫瘤細胞 的增殖。該RPL34基因干擾慢病毒可用于制備預防或治療腫瘤的藥物。
[0057] 本發(fā)明第五方面，公開了一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含 有前述的分尚的核酸分子，RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體或RPL34基因干擾慢病毒中的一種 或多種的組合。
[0058] 進一步的，所述藥物組合物含有1?99wt%所述雙鏈RNA、shRNA、RPL34基因干擾 核酸構(gòu)建體或RPL34基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0059] 在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可 以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體 材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖 漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀 粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括：濕潤劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯）、甜味劑等。
[0060] 本發(fā)明還公開了所述藥物組合物在制備治療肺癌之任一的腫瘤治療藥物中的應(yīng) 用。
[0061] 該藥物組合物的應(yīng)用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預防或治療對象 體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。進一步的，所述腫瘤 選自肺癌。
[0062] 所述藥物組合物用于預防或治療對象體內(nèi)腫瘤時，需要將有效劑量的所述的藥物 組合物施用于對象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進一 步的，所述腫瘤的生長、增殖、復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0063] 所述方法的對象可以為人。
[0064] 本發(fā)明第六方面，公開了一種用于降低腫瘤細胞中的RPL34基因表達的試劑盒， 所述試劑盒包括：存在于容器中的所述分離的核酸分子，RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，和/ 或所述的RPL34基因干擾慢病毒。
[0065] 綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了針對人RPL34基因的1個RNAi靶點序列，構(gòu)建相應(yīng)的 RPL34RNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO :1 的 RNAi 載體pGCSIL-GFP-RPL34-siRNA 能夠顯 著下調(diào)RPL34基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒（lentivirus，簡寫為Lv) 作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-RPL34-siRNA能夠靶向地將針對RPL34基因 的RNAi序列高效導入人肺癌H1299細胞，降低RPL34基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤 細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的RPL34基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方 式。
[0066] 本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性 抑制人RPL34基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中 RPL34基因的表達，促進細胞凋亡、降低腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，進而抑制腫瘤細胞 的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖 I :pGCSIL_GFP 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0068] 圖2 :RPL34-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞4天后，RPL34mRNA的表達水平顯 著降低
[0069] 圖3 :RPL34-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞4天后，引起細胞增殖抑制
[0070] 圖4 :RPL34基因在293T細胞中過表達和敲減實驗均有明顯效果
[0071] 圖5 :RPL34-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞4天后，導致肺癌細胞周期改變， 與對照組相比，處于Gl期細胞顯著減少，而處于S期的細胞顯著增多
[0072] 圖6 :RPL34-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞4天后，導致肺癌細胞凋亡增加， 與對照組相比，凋亡的細胞數(shù)量顯著增多，凋亡細胞比例提高2倍
[0073] 圖7 :RPL34-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞10天后，人肺癌H1299細胞與對 照組相比集落數(shù)目明顯減少，克隆形成能力降低

【具體實施方式】
[0074] 本發(fā)明涉及了一組針對人RPL34基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載 體和RNA干擾慢病毒。選取人RPL34mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中 連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27,更優(yōu)選19-23)個堿基序列設(shè)計siRNA靶點序列。通過基因克 隆，構(gòu)建表達上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上 述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內(nèi)源RPL34基因的表達。
[0075] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人腫瘤細胞的RPL34基因的表達后可有效地抑制 肺癌細胞的增殖、促進細胞凋亡、降低腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，可以有效地控制腫瘤 的生長進程，這一研究成果表明RPL34基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的有效靶點。發(fā)明 人進一步合成和測試了多種針對RPL34基因的siRNA，篩選出了可有效抑制RPL34的表達進 而抑制人肺癌H1299細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0076] 本發(fā)明提供了一系列干擾人RPL34基因的小干擾RNA(SiRNA)序列，構(gòu)建了可特異 性沉默RPL34基因表達的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人RPL34基因設(shè)計的小干擾RNA及 RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)RPL34基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發(fā) 明表明RPL34基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過 RNAi方式沉默RPL34基因的表達，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。
[0077] 本發(fā)明的設(shè)計思路為：
[0078] 本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人RPL34基因 RNAi慢病毒：從Genbank中 調(diào)取人RPL34基因序列；預測siRNA位點；合成針對RPL34基因的有效的siRNA序列、兩端 含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達 RPL34基因 siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉 默RPL34基因的慢病毒。
[0079] 基于上述方法，本發(fā)明提供了 1個干擾RPL34基因的有效靶點（具體如SEQ ID NO : 1所示），構(gòu)建了特異干擾人RPL34基因的慢病毒。
[0080] 同時本發(fā)明還公開一種人RPL34基因 RNAi慢病毒（RPL34-RNAi)及其制備與應(yīng) 用。
[0081] 本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低RPL34基因在腫瘤細胞中的表 達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，RPL34基因是一個原癌基因，可促進腫 瘤細胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學功能，RPL34基因可以為腫瘤治療的靶 標，慢病毒介導的RPL34基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0082] 下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條 件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。
[0083] 實施例1針對人RPL34基因 RNAi慢病毒的制備
[0084] 1.篩選針對人RPL34基因的有效的siRNA靶點
[0085] 從Genbank調(diào)取RPL34 (NM_000995)基因信息；設(shè)計針對RPL34基因的有效的 siRNA靶點。表1列出了其中1條針對RPL34基因的有效siRNA靶點序列。
[0086] 表1靶向于人RPL34基因的siRNA靶點序列
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的人RPL34基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中 的用途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自肺癌。
3. -種降低腫瘤細胞中RPL34基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與RPL34基因雜交的核苷酸序列； 或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與RPL34基因雜交的核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第 二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPL34 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所 述正義鏈片段的序列與RPL34基因中的靶序列基本相同。
5. 如權(quán)利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述RPL34基因的靶序列含有 SEQ ID N0:1 的序列。
6. 如權(quán)利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA， 該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示。
7. 如權(quán)利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO :14所示。
8. -種RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼權(quán)利要求3-7任一權(quán)利要求所述分離的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。
9. 如權(quán)利要求8所述RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述RPL34基因干擾核 酸構(gòu)建體為干擾慢病毒載體。
10. 如權(quán)利要求9所述RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體 由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自： pLKO. l-puro、pLK0.l-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、 pLKO. l-Neo、pLK0.l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagYFP、pLKO. l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、 pLKO.l-pur〇-UbC-TurboGFP> pLKO.l-pur〇-UbC-TagFP635> pLK〇-pur〇-IPTG-lxLacO> pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任 o
11. 一種RPL34基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求9-10任一權(quán)利要求所述干擾慢病毒載體 在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
12. -種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有權(quán)利要求3-7任一權(quán)利 要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求8-10任一權(quán)利要求所述RPL34基因干擾核酸構(gòu)建 體，和/或權(quán)利要求11所述的RPL34基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或 賦形劑。
13. 權(quán)利要求12所述藥物組合物在制備治療肺癌的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
14. 一種用于降低腫瘤細胞中RPL34基因表達的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括：存在于容器中的，權(quán)利要求3-7任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求8-10任 一權(quán)利要求所述RPL34基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求11所述的RPL34基因干擾慢 病毒。
【文檔編號】A61K48/00GK104368012SQ201410410682
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】高紅軍, 楊紹興, 湯傳昊, 秦海峰, 劉曉晴, 王紅, 李曉燕, 李儉杰, 王偉霞, 曹躍瓊 申請人:中國人民解放軍第三〇七醫(yī)院, 上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司