轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)精子形成基因40（Tisp40）在治療血管損傷后再狹窄中的功能和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)精子形成基因40（Tisp40）在治療血管損傷后再狹窄中的功能和應(yīng)用。本發(fā)明以Tisp40基因敲除小鼠和野生型小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過血管損傷模型，進(jìn)行了小鼠內(nèi)膜新生、血管壁細(xì)胞增殖水平和平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的檢測。結(jié)果表明，Tisp40基因敲除可以明顯抑制內(nèi)膜新生和細(xì)胞增殖，抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換。這表明Tisp40在血管損傷后再狹窄中的功能主要體現(xiàn)為促進(jìn)內(nèi)膜新生和細(xì)胞增殖和平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。針對Tisp40的上述功能，其可作為藥物靶標(biāo)用于篩選預(yù)防、緩解和/治療血管損傷后再狹窄疾病的藥物，其抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/治療血管損傷后再狹窄的藥物和動脈支架。
【專利說明】[0001] 轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)精子形成基因40 (Tisp40)在治療血管損傷后再 狹窄中的功能和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)精子形成基因40 (Tisp40)在治療血管損傷后再狹窄中的功能和應(yīng)用，具體是Tisp40在制備預(yù)防、緩解和/ 或治療血管損傷后再狹窄的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 隨著人類社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、人民生活水平的提高以及人口老齡化進(jìn)程的加 快，心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，已成為嚴(yán)重危害全球性公眾健康的重大疾病之一。在我 國心血管疾病的患病率處于持續(xù)上升階段，每年約350萬人死于心血管病，居各種死因之 首，給社會和經(jīng)濟(jì)造成了極大的損失。在心血管疾病中，動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS)等血管阻塞性疾病的發(fā)病率逐年增高，雖然經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)以及其他導(dǎo)致血管重塑的技術(shù)手段可以實(shí)現(xiàn) 血管重建，有效的疏通阻塞的動脈，改善血供。然而，手術(shù)過程中出現(xiàn)的不同程度的機(jī)械損 傷引起新生內(nèi)膜的形成，導(dǎo)致支架術(shù)后再狹窄而使得療效往往不盡如人意。AS、肺動脈高 壓、PCI術(shù)后再狹窄及旁路移植術(shù)后狹窄病變等嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病越來越受 到人們的廣泛關(guān)注。血管內(nèi)膜增生是上述疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而血管平滑肌 細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型轉(zhuǎn)化是血管內(nèi)膜增生和管腔狹窄的重 要病理學(xué)基礎(chǔ)。因此，尋找新的血管再狹窄的干預(yù)靶點(diǎn)具有重要的理論意義。
[0004] 轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)精子形成基因 40 (Transcript induced in spermiogenesis 40， Tisp40),又稱 Creb3L4 (Camp responsive element binding protein 3-like 4),是哺乳 動物亮氨酸拉鏈（bZIP)轉(zhuǎn)錄因子Creb3亞家族中的一員，主要表達(dá)于前列腺中，最早發(fā)現(xiàn) 于前列腺癌細(xì)胞中，并被定義為雄激素誘導(dǎo)蛋白（androgen-induced bZIP，AIbZIP)。CREB 在血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，研究表明激活CREB對VSMC的增殖和遷移中發(fā)揮重 要作用【1，2】。Tisp40定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等，并通過炎癥介導(dǎo)等作用對心血管疾病產(chǎn)生影響；在睪丸的未折疊蛋白 反應(yīng)及精子頭部核細(xì)胞的形成過程中發(fā)揮重要作用【3】。目前關(guān)于Tisp40基因介紹及功 能的研究的文章非常少，在PUBMED信息檢索系統(tǒng)網(wǎng)站僅有4篇。范桄溥等發(fā)現(xiàn)Tisp40對 心肌梗死的作用是通過NF-κ B信號通路的激活，誘導(dǎo)多種炎癥因子的產(chǎn)生【4】。由此推測 Tisp40可能影響血管VSMC的功能，從而在血管再狹窄中發(fā)揮功能作用。
[0005] 【參考文獻(xiàn)】 1 > Molnar P, Perrault R, Louis S, et al. The cyclic AMP response element-binding protein (CREB) mediates smooth muscle cell proliferation in response to angiotensin II. J Cell Commun Signal. 2014 Mar;8(1):29-37. 2、 Chava KR， Karpurapu M， Wang D, et al. CREB-mediated IL-6 expression is required for 15 (S)-hydroxyeicosatetraenoic acid-induced vascular smooth muscle cell migration. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2009 Jun;29 (6):809-15. 3、 Blackwell Publishing Inc The testes-specific bZip type transcription factor Tisp40 plays a role in ER stress responses and chromatin packaging during spermiogenesis. Ippei Nagamori， et al. Genes Cells. 2006 Oct;11(10):1161-71. 4、 范桄溥。Tisp40在心肌梗死炎癥反應(yīng)中的作用與機(jī)制研究?！度A中科技大學(xué)》，2012 年。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定Tisp40的表達(dá)和血 管損傷后再狹窄的相互關(guān)系，提供一種Tisp40作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/治療血 管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用，提供一個用于預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄 的靶基因 Tisp40的新用途。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明以野生型C57BL/6小鼠與Tisp40基因敲除小鼠（Tisp40-K0小鼠)為實(shí)驗(yàn)對象， 通過頸動脈導(dǎo)絲損傷模型誘導(dǎo)獲得小鼠血管損傷模型（vascular injury, VI),進(jìn)行了血管 損傷模型（VI)小鼠內(nèi)膜新生測定、血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測和平滑肌細(xì)胞表型的檢測的 研究，結(jié)果表明：與野生型C57BL/6小鼠對比，Tisp40基因敲除小鼠表現(xiàn)出內(nèi)膜新生及細(xì)胞 增殖明顯低于WT小鼠；Tisp40基因敲除可以抑制細(xì)胞增殖核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1)的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和 內(nèi)膜增生；Tisp40基因敲除可以促進(jìn)平滑肌肌動蛋白（Smooth Muscle Actin，SMA)和平滑 肌22α (smooth muscle 22 alpha，SM22a)的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型 的表型轉(zhuǎn)換，從而抑制內(nèi)膜增生。上述結(jié)果表明Tisp40基因敲除會減少血管損傷后再狹窄 的發(fā)生，Tisp40能夠促進(jìn)血管損傷后再狹窄的形成，為研究預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷 后再狹窄的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0008] 因此，Tisp40基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建Tisp40基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動 物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物；Tisp40基因也可作為基 因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物和/或生物 學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的目的。例如以 Tisp40為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾Tisp40表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人 體通過RNA干擾的方法使Tisp40基因沉默來治療血管損傷后再狹窄；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建 Tisp40的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競爭Tisp40原形的作用底物，從而抑制Tisp40的功能， 起到治療目的；此外，還可以以Tisp40為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用Tisp40基因 過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制Tisp40的分子， 從而為血管損傷后再狹窄的治療提供新的治療性分子。
[0009] 針對Tisp40的上述功能，提供Tisp40作為藥物祀標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療 血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 針對Tisp40的上述功能，提供Tisp40的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療血管 損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 一種預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物，包含Tisp40的抑制劑。
[0012] 一種預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的動脈支架，其包被有Tisp40的抑 制劑。
[0013] 所述的Tisp40的抑制劑優(yōu)選為Tisp40基因的siRNA、Tisp40基因的RNA干擾載 體，Tisp40的抗體及其他能夠抑制Tisp40表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0014] 在本發(fā)明中，所述血管損傷主要是指動脈血管損傷。
[0015] 在本發(fā)明中，所述血管損傷是指動脈粥樣硬化引起的血管損傷，或者在治療動脈 粥樣硬化時引起的血管損傷，例如通過球囊擴(kuò)張或放入支架引起的血管損傷，或者移植后 動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
[0016] 在本發(fā)明中，所述動脈粥樣硬化既包括動脈粥樣硬化較早期階段的血管狹窄期， 也包括動脈粥樣硬化嚴(yán)重時的血管梗塞期。
[0017] 在本發(fā)明中，所述動脈支架是指用于支撐人體內(nèi)因病變而狹窄、閉塞的血管，恢復(fù) 血液流通的管狀器件，采用金屬或高分子材料加工制成，可長期或暫時留于人體血管內(nèi)。在 管腔球囊擴(kuò)張成形的基礎(chǔ)上，在病變段置入支架以達(dá)到支撐狹窄閉塞段血管、減少血管彈 性回縮及再塑形、保持管腔血流通暢的目的，既包括外周動脈支架，也包括冠狀動脈支架。
[0018] 在本發(fā)明中，所述再狹窄是指在局部血管發(fā)生損傷時，所作出的導(dǎo)致血管管腔再 狹窄的普遍性生物學(xué)反應(yīng)。這里主要指醫(yī)源性損傷引起的血管再狹窄，損傷過程主要由動 脈重塑和內(nèi)皮增生組成。
[0019] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 Tisp40基因的新功能，即Tisp40能夠促進(jìn)血管損傷后再狹窄的作 用。
[0020] (2)基于Tisp40在促進(jìn)血管損傷后再狹窄的功能，為研制血管損傷后再狹窄的藥 物提供了靶標(biāo)。
[0021] (3)Tisp40的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物。
[0022] (4) Tisp40的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的動脈 支架。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是WT和Tisp40-K0小鼠術(shù)后28天的HE染色及內(nèi)膜面積結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其 中，A :HE染色圖，B :內(nèi)膜面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖（* :p < 0. 05 vs WT VI組)。
[0024] 圖2是WT和Tisp40-K0小鼠術(shù)后28天血管壁細(xì)胞增殖水平標(biāo)志物PCNA、CyclinDl 表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其中，A :免疫熒光染色，B :結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖（* :p < 0· 05 vs WT VI 組）。
[0025] 圖3是WT和Tisp40_K0小鼠術(shù)后28天平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志物SMA、SM22 α 表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其中，Α:免疫熒光染色，Β:柱狀圖（*:ρ< 0.05 vs WT VI 組）。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。應(yīng)理解，下面的實(shí)施 例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 實(shí)驗(yàn)用動物及飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動物：選用8-10周齡、體重在24-27g，雄性，C57BL/6小鼠（WT小鼠，購自北京華 阜康生物科技有限公司）和Tisp40基因敲除小鼠（Tisp40-K0,購自日本RIKEN公司，貨號： RBRC01942)。
[0028] 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動物中 心。SPF級大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)條件：室溫在22_24°C之間， 濕度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0029] 實(shí)施例1小鼠血管損傷模型（VI)獲得 1.實(shí)驗(yàn)動物分組：使用8-10周齡，體重24-27g的WT和Tisp40-K0小鼠，共分為2組： WT血管損傷組，Tisp40-K0血管損傷組，每組各20只小鼠。分別在手術(shù)后28天處死小鼠， 取損傷節(jié)段血管進(jìn)行分析。
[0030] 2.小鼠血管損傷模型操作流程： 1)用電子天平于動態(tài)模式下準(zhǔn)確稱取小鼠體重（g)，用雙蒸水準(zhǔn)確配置3%戊巴比妥鈉 溶液，輕輕搖動使其充分溶解，采用80mg/kg體重劑量，計(jì)算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用 lmL注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)后， 8%硫化鈉頸部脫毛。
[0031] 2)分離頸內(nèi)和頸外動脈。
[0032] 3)在頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處用8-0線結(jié)扎頸外動脈，同時用血管夾（WPI, 501784-G)暫時性阻斷頸內(nèi)動脈及頸總動脈供血。
[0033] 4)用顯微剪（WPI, 501839)在頸外動脈結(jié)扎線的上方橫向剪一個小口。經(jīng)此血管 切口插入直徑 0.015 英寸的導(dǎo)絲（No. C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana),旋轉(zhuǎn) 導(dǎo)絲進(jìn)退5-6次。
[0034] 5)在切口近心端結(jié)扎頸外動脈，松開頸內(nèi)及頸總動脈置留的血管夾，剪斷線頭，清 理術(shù)野，縫合頸部切口。
[0035] 實(shí)施例2血管損傷模型（VI)小鼠內(nèi)膜新生測定 1. 小鼠取材 1)麻醉小鼠，剪破心臟放血。
[0036] 2)從頸動脈近分叉處剪下頸動脈，取0. 5-0. 6cm長，保留頸外動脈線結(jié)。
[0037] 3)將頸動脈放入PBS中，用顯微鑷輕柔排干管腔內(nèi)的殘血。
[0038] 4)將血管放入裝有l(wèi)mL 4%多聚甲醛的1. 5mL EP管中固定。
[0039] 2.病理學(xué)檢測 2. 1制備石錯標(biāo)本切片 由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)病理工作人員制備石蠟標(biāo)本切片，主要操作程序包括：4%多聚甲醛中隔 夜固定后，將血管用濾紙小心包好，放入包埋框一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一 切片（3 μ m)-攤片一晾干或烘烤后備用。
[0040] 2.2蘇木精-伊紅（HE)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氫鈉0. 35g，硫酸鎂2g，蒸饋水100mL)lmin -水洗lmin -伊紅溶液 (珠海貝索，BA-4024) 3-5min -蒸餾水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s - 95%酒精I(xiàn)s - 100%酒精 30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0041] 以血管內(nèi)彈力纖維和外彈力纖維為界，內(nèi)彈力板以內(nèi)為血管內(nèi)膜，外彈力板以外 為血管外膜，內(nèi)外彈力板之間為血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0軟件分別圈各血管管腔 面積。
[0042] 內(nèi)膜面積大小的計(jì)算參照公式如下： 新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力板面積-管腔面積； 中膜面積=外彈力板面積_內(nèi)彈力板面積。
[0043] 小鼠 HE染色后的血管內(nèi)膜新生的結(jié)果如圖1。正常的血管壁結(jié)構(gòu)完整，排列整齊， 血管內(nèi)膜為單層內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。通過HE染色觀察到，血管 損傷組（VI組)血管壁結(jié)構(gòu)不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失，新生內(nèi)膜增生明顯，并伴有大量炎細(xì) 胞浸潤；Tisp40-K0組在術(shù)后28天新生內(nèi)膜面積明顯比WT小鼠要低。同樣，內(nèi)膜面積/中 膜面積的比值在VI術(shù)后Tisp40-K0組要低于WT組。這說明Tisp40基因的缺失可以抑制 血管損傷后引起的內(nèi)膜新生。
[0044] 實(shí)施例3血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測 免疫突光染色檢測細(xì)胞增殖核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、 細(xì)胞周期蛋白（CyclinDl)的表達(dá)。所需一抗信息：PCNA (#2586; 1:100; mouse; Cell Signaling Technology), cyclin D1 (#2978; 1:25; rabbit; Cell Signaling Technology);所需二抗信息：Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (A11011; Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse IgG (A11004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)〇
[0045] 主要步驟為： 1)烤片：將石蠟切片置于55°c烤箱中30min以上。
[0046] 2)脫蠟：二甲苯 5minX3。
[0047] 3)水合：100% 乙醇 5minX2 ;95% 乙醇 5min ;70% 乙醇 5min ;ddH20 浸洗 5minX2。
[0048] 4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù)）：取一定量的pH6. 0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作 液(購自福州邁新生物科技有限公司，貨號MVS-0100)于修復(fù)盒中，修復(fù)工作液的量必須能 足夠浸沒整張切片，將修復(fù)盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟 水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓 力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計(jì)時5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復(fù)盒；室溫放 置20min自然冷卻后取出切片。
[0049] 5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0050] 6)組化筆劃圈，滴加 10%羊血清（GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉 60min〇
[0051] 7)棄封閉液，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜，37°C復(fù)溫30min，棄去一抗， PBS 洗 10minX3 次。
[0052] 8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0053] 9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0054] 10)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0055] 熒光統(tǒng)計(jì)方法：PCNA免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)采用IPP軟件計(jì)數(shù)，PCNA陽性細(xì)胞百分比 =PCNA陽性細(xì)胞個數(shù)/ (內(nèi)膜+中膜)的總DAPI個數(shù)*100% ;CyclinDl免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)采 用IPP軟件直接測陽性吸光度。
[0056] 免疫熒光法觀察平滑肌細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA、CyclinDl在WT和Tisp40-K0小鼠 血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖2。PCNA、CyclinDl在血管組織中有表達(dá)，Tisp40-K0小 鼠在術(shù)后28天PCNA的陽性細(xì)胞個數(shù)及CyclinDl的熒光強(qiáng)度均要小于同組的WT小鼠，表 明Tisp40基因敲除可以抑制PCNA、CyclinDl的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)膜 新生。
[0057] 實(shí)施例4平滑肌細(xì)胞表型的檢測 免疫熒光染色檢測平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志物：平滑肌肌動蛋白（Smooth Muscle Actin， SMA)、平滑肌22α (smooth muscle 22 alpha，SM22a)的表達(dá)。所需一抗信息：SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam) and SM22a (abl4106; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息： Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (A11008; Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0058] 主要步驟參照實(shí)施例3。
[0059] 熒光統(tǒng)計(jì)方法：采用IPP軟件直接測陽性吸光度。
[0060] 在正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要表現(xiàn)為收縮型；血管損 傷后，血管平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移，平滑肌細(xì)胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型 向合成型轉(zhuǎn)變，血管壁不適重塑，從而引起內(nèi)膜增生。免疫熒光觀察SMA、SM22a在WT和 Tisp40-K0小鼠血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖3。SMA、SM22a在血管組織中有表達(dá)， Tisp40-K0小鼠在術(shù)后28天SMA、SM22a的熒光強(qiáng)度均要高于同組的WT小鼠，表明Tisp40 基因敲除可以促進(jìn)SMA、SM22 a的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)換， 從而抑制內(nèi)膜增生。
[0061] 以上述實(shí)施例結(jié)果顯示，野生型小鼠和Tisp40-K0小鼠在血管損傷模型（VI)的誘 導(dǎo)下均發(fā)生血管損傷后再狹窄。與野生型小鼠相比，Tisp40-K0小鼠內(nèi)膜新生、細(xì)胞增殖以 及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換均受到抑制。這些結(jié)果表明，Tisp40基因敲除可以改善血管損傷誘 導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖、表型轉(zhuǎn)化和血管新生內(nèi)膜形成。
[0062] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. Tisp40作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng) 用。 2. Tisp40的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
3. -種預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物，其特征在于：包含Tisp40的 抑制劑。
4. 一種預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的動脈支架，其特征在于：包被有 Tisp40的抑制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物或權(quán)利要求4所述的動脈 支架，其特征在于：所述的血管損傷為動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化介入治療、移植后動脈 病以及肺動脈高壓引起的血管損傷。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物或權(quán)利要求4所述的動脈支 架，其特征在于：所述的Tisp40的抑制劑為Tisp40基因的siRNA、Tisp40基因的RNA干擾 載體或Tisp40的抗體及其他能夠抑制Tisp40表達(dá)的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61P9/00GK104147617SQ201410411043
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】李紅良, 趙輝, 張鵬, 張書敏, 王丕曉 申請人:武漢大學(xué)