生物活性移植物和復(fù)合材料的制作方法
【專利摘要】公開了多種生物活性移植物及其制造方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，骨材料從供體收獲。所收獲的骨材料被暴露于溶解劑，溶解劑被構(gòu)建成從所收獲的骨材料的細(xì)胞物質(zhì)中釋放生長因子和生物活性材料。接著，用漂洗劑漂洗所收獲的骨材料。所收獲的骨材料的pH可以被基本上中和。
【專利說明】生物活性移植物和復(fù)合材料
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年12月13日，申請(qǐng)?zhí)枮?00980155596. X，發(fā)明名稱為"生 物活性移植物和復(fù)合材料"的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求享有2008年12月13日提交的題目為"STIMULATIVE GROWTH AGENTS DERIVED FROM PHYSIOLOGICAL FLUIDS AND METHOD OF MAKING (從生理流體獲得的刺激 生長劑及其制造方法）"的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列第61/201，612號(hào)的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)?jiān)诖?通過引用以其整體并入。本申請(qǐng)要求享有2009年9月7日提交的題目為"BI0ACTIVE ALLOGRAFTS AND COMPOSITES(生物活性的同種異體移植物和復(fù)合材料）"的美國臨時(shí)申請(qǐng) 系列第61/240, 283號(hào)的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^引用以其整體并入。
[0004] 背景
[0005] 骨移植物，無論是同種異體移植物、自體移植物還是異種移植物，它們可以被使用 在遭受疼痛或與骨架結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定或畸形有關(guān)的其他異常情形的患者體內(nèi)。作為非限制 性的實(shí)例，遭受脊柱不穩(wěn)定或一根或多根椎骨過度移動(dòng)的患者可以用脊柱融合過程治療， 該過程包括去除位于兩根椎骨之間的椎間盤的一部分。骨移植物或脊柱植入物或兩者的 組合隨后可以被插入到去除的椎間盤的區(qū)域內(nèi)或其周圍以促進(jìn)兩根相鄰的椎骨的融合。 這樣的骨移植物或脊柱植入物可以包括所收獲的由皮質(zhì)骨材料、松質(zhì)骨材料、皮質(zhì)松質(zhì)骨 (corticocancellous bone)材料或所有三種前述類型的骨材料的組合制成的骨碎片。患者 還可能遭受各種退變性癥狀，骨移植物的植入可以作為一種治療而被選擇用于這樣的退變 性癥狀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟：從供體收獲松質(zhì) 骨材料；從收獲的骨材料提取至少一個(gè)碎片；將所述至少一個(gè)碎片暴露于溶解劑，所述溶 解劑被構(gòu)建成使生長因子和生物活性材料從所述收獲的骨材料的細(xì)胞物質(zhì)釋放，所述溶解 劑還包括具有至少1 %的濃度和約〇. 2M至17M的摩爾濃度范圍的乙酸；漂洗所述收獲的骨 材料以進(jìn)一步清潔所述至少一個(gè)碎片或基本上中和所述至少一個(gè)碎片的pH ;其中所述漂 洗劑是下述物質(zhì)中的至少一種：水、鹽水、過氧化物、醇類、類晶體、抗生素溶液、保存液和儲(chǔ) 存劑；通過進(jìn)行下述方法中的至少一種來脫水所述收獲的骨材料：蒸發(fā)、真空干燥和凍干； 和通過真空密封來封裝所述收獲的骨材料；其中在所釋放的生長因子和生物活性材料的至 少一部分結(jié)合到所述收獲的骨材料之后，進(jìn)行漂洗所述收獲的骨材料和基本上中和所述收 獲的骨材料的pH的步驟。
[0007] 本發(fā)明提供了一種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟：
[0008] 從供體收獲骨材料；將收獲的骨材料暴露于溶解劑，所述溶解劑被構(gòu)建成使生長 因子和生物活性材料從所述收獲的骨材料的細(xì)胞物質(zhì)釋放；和用漂洗劑漂洗所述收獲的骨 材料。
[0009] 本發(fā)明的方法還可包括下述步驟：基本上中和所收獲的骨的所述pH。
[0010] 本發(fā)明的方法還可包括下述步驟：將所述收獲的骨材料成形為植入到身體中的形 狀。
[0011] 在本發(fā)明的方法中，所述收獲的骨材料可以是松質(zhì)骨，所述溶解劑抑制所釋放的 生長因子和生物活性材料結(jié)合到所述收獲的骨材料，且將所述收獲的骨材料暴露于所述溶 解劑的步驟產(chǎn)生包含增溶的生長因子和生物活性材料的溶解產(chǎn)物流體混合物。本發(fā)明的方 法還可包括下述步驟：從所述供體收獲皮質(zhì)骨材料；將所述溶解產(chǎn)物混合物與收獲的皮質(zhì) 骨材料組合，其中組合步驟使所述增溶的生長因子和生物活性材料結(jié)合到所述收獲的皮質(zhì) 骨材料；和將所述收獲的皮質(zhì)骨材料成形為植入到身體內(nèi)的形狀。本發(fā)明的方法還可包括 下述步驟：在結(jié)合所述生長因子之前或之后，使所述收獲的皮質(zhì)骨材料脫礦質(zhì)。
[0012] 在本發(fā)明的方法中，在所釋放的生長因子和生物活性材料的至少一部分結(jié)合到所 述收獲的骨材料之后，可進(jìn)行漂洗所述收獲的骨材料和基本上中和所述收獲的骨材料的pH 的步驟。
[0013] 在本發(fā)明的方法中，所述漂洗劑可以是下述物質(zhì)中的至少一種：水、鹽水、過氧化 物、醇類、類晶體、抗生素溶液、保存液和儲(chǔ)存劑。在本發(fā)明的方法中，所述漂洗劑可進(jìn)行基 本上中和所述收獲的骨材料的pH的步驟。
[0014] 在本發(fā)明的方法中，所述溶解劑可以是下述物質(zhì)中的至少一種：乙酸、鹽酸、檸檬 酸、磷酸、硫酸、硝酸、羧酸或無機(jī)酸。
[0015] 在本發(fā)明的方法中，所述溶解劑可以是具有至少3 %的濃度和約0. 2M至17M的摩 爾濃度范圍的乙酸。
[0016] 在本發(fā)明的方法中，所述溶解劑可允許所釋放的生長因子和生物活性材料結(jié)合到 所述骨材料。
[0017] 在本發(fā)明的方法還可包括下述步驟：將所述收獲的骨材料暴露于機(jī)械溶解條件以 使生長因子和生物活性材料從所述收獲的骨材料的細(xì)胞物質(zhì)釋放。在本發(fā)明的方法中，所 述機(jī)械溶解條件可進(jìn)一步包括下述中的至少一種：熱分解、微流體、超聲、電擊、研磨、珠磨、 均化、離心、弗氏壓碎、碰撞、剪切、壓力和真空力。
[0018] 本發(fā)明的方法還可包括下述步驟：使所述收獲的骨材料脫水。
[0019] 在本發(fā)明的方法中，脫水步驟還可包括下述中的至少一種：蒸發(fā)、真空干燥和凍 干。
[0020] 本發(fā)明提供了一種骨植入物，其由包括下述步驟的方法制造：從供體收獲骨材料； 將收獲的骨材料暴露于溶解劑，所述溶解劑被構(gòu)建成使生長因子和生物活性材料從所述收 獲的骨材料的細(xì)胞物質(zhì)釋放，所述溶解劑還被構(gòu)建成允許所釋放的生長因子和生物活性材 料的至少一部分結(jié)合到所述收獲的骨材料；用漂洗劑漂洗所述收獲的骨材料；和基本上中 和所述收獲的骨材料的pH。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 參考下面的附圖可以更好地理解本公開內(nèi)容的許多方面。附圖中的部件并不一定 按比例繪制，而是將重點(diǎn)放在清楚地闡釋了本公開內(nèi)容的原理。此外，在附圖中，相同的參 考數(shù)字指代整個(gè)若干幅圖中的相應(yīng)部件。
[0023] 圖1是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0024] 圖2是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0025] 圖3是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0026] 圖4是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0027] 圖5是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0028] 圖6是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0029] 圖7是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0030] 圖8是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0031] 圖9是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0032] 圖10是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0033] 圖11是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
[0034] 詳述
[0035] 本公開內(nèi)容的多個(gè)實(shí)施方案涉及刺激組織生長的生物活性因子。正如可以理解 的，這些生物活性因子可以從包含細(xì)胞的生理溶液得到。生理溶液可以以體內(nèi)天然的溶液 存在或可以源自于提取細(xì)胞時(shí)的組織。包含細(xì)胞的任何組織可以是生理流體的來源，諸如， 如中胚層組織、內(nèi)胚層組織和外胚層組織。這些組織的實(shí)例包括骨髓、血液、脂肪、皮膚、肌 肉、脈管系統(tǒng)、軟骨、韌帶、腱、筋膜、心包、神經(jīng)和頭發(fā)。這些組織還可以包括器官，諸如胰 臟、心臟、腎臟、肝臟、腸、胃和骨。在由本發(fā)明處理之前，可以濃縮細(xì)胞。
[0036] 本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案涉及由細(xì)胞骨組織制成的骨誘導(dǎo)性植入物以及制造 骨誘導(dǎo)性植入物的方法。由細(xì)胞骨組織制成的植入物可以包括骨誘導(dǎo)性和/或骨傳導(dǎo)性材 料以促進(jìn)植入物插入?yún)^(qū)域內(nèi)或其周圍的融合和/或新骨的生長。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案， 松質(zhì)骨、皮質(zhì)松質(zhì)骨和/或皮質(zhì)骨的一部分或其任意組合可以從供體收獲。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所收獲的材料可以以使所收獲的樣品中保留盡可能多的骨髓的方式來收獲。
[0037] 所收獲的樣品可以暴露于溶解條件和/或溶解劑以促進(jìn)其內(nèi)細(xì)胞的溶解以釋放 樣品內(nèi)包含的生長因子和營養(yǎng)物。換句話說，所收獲的樣品可以被暴露于溶解所收獲的樣 品內(nèi)的細(xì)胞的溶解劑。一旦溶解了細(xì)胞組分后，它們釋放生長因子和/或生物活性材料，諸 如細(xì)胞因子和營養(yǎng)物，以刺激生長、分化和修復(fù)。這些生長劑可以是細(xì)胞因子，諸如蛋白、激 素或糖蛋白，包括TGF-β家族（包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白）的成員、白細(xì)胞介素、干擾素、淋巴 因子、趨化因子、血小板衍生生長因子、VEGF和促進(jìn)生長、修復(fù)組織或再生組織的其他刺激 劑。
[0038] 在其他實(shí)施方案中，來自其他組織的細(xì)胞可以被溶解以釋放可以結(jié)合到所收獲的 樣品的生長劑并被進(jìn)一步處理成植入物。溶解條件本質(zhì)上可以是機(jī)械的，諸如熱分解、微流 體、超聲、電擊、研磨、珠磨、均化、弗氏壓碎（french press)、碰撞、過度剪切、壓力、真空力 及其組合。過度剪切可以通過下述方式產(chǎn)生：迅速地移液穿過小孔，以過多的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)離 心，產(chǎn)生高的重力。溫度、壓力或流量的快速變化也可以用于溶解細(xì)胞組分。溶解條件可以 包括熱分解技術(shù)，熱分解技術(shù)可以包括冷凍、凍-融循環(huán)和加熱以破壞細(xì)胞壁。溶解條件還 可以包括微流體技術(shù)，該微流體技術(shù)可以涉及細(xì)胞溶解或皺縮的滲透沖擊技術(shù)。
[0039] 溶解條件還可以包括施加超聲技術(shù)，超聲技術(shù)包括但不限于，聲處理、聲孔效應(yīng)、 聲化學(xué)、聲致發(fā)光和聲空化。溶解條件還可以包括電擊技術(shù)，例如電穿孔和暴露于高壓和/ 或高電流源。溶解條件可以進(jìn)一步包括研磨或珠磨技術(shù)，此技術(shù)物理碰撞或研磨細(xì)胞，以便 使細(xì)胞膜破裂，釋放包含在其內(nèi)的刺激劑。
[0040] 通過將所收獲的樣品的細(xì)胞暴露于溶解劑也可以實(shí)現(xiàn)溶解，溶解劑可以促進(jìn)刺激 生長劑的釋放，包括因 pH不平衡、暴露于洗滌劑、酶、病毒、溶劑、表面活性劑、溶血素及其 組合引起的溶解。因 pH不平衡引起的化學(xué)導(dǎo)致的細(xì)胞溶解可以涉及所收獲的樣品的細(xì)胞 暴露于溶解劑，以便破壞細(xì)胞壁并釋放可溶的生長因子。在一些實(shí)施方案中，溶解劑可以包 括一種或多種酸和/或堿。
[0041] 在暴露于溶解劑之后，所收獲的樣品可以被暴露于緩沖劑或其他溶液以基本上中 和生長因子和溶解劑的混合物的pH。在一些實(shí)施方案中，可以期望pH是酸性（如，pH低于 7)或堿性（如，pH高于7)以保留特定生長因子或生物活性劑的溶解度。例如，骨形態(tài)發(fā)生 蛋白（尤其是81^-2、81^-4、81^-6、81^-7、81^-9、81^-14和其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白1-30)在 低于7的酸性pH值下比在中性pH或堿性pH下易溶解。
[0042] 在其他實(shí)施方案中，溶解劑可以包括揮發(fā)性酸或堿，諸如乙酸或氨，而細(xì)胞物質(zhì)在 暴露于溶解劑之后可以通過干燥技術(shù)被中和或部分中和，干燥技術(shù)諸如蒸發(fā)、真空干燥、凍 干、冷凍干燥、升華、沉淀和類似的過程，正如能夠了解的。在另外其他的實(shí)施方案中，溶解 劑可以包括洗滌劑，洗滌劑可以破壞細(xì)胞壁并去除可能圍繞細(xì)胞的任何脂質(zhì)屏障。酶、病 毒、溶劑、表面活性劑和溶血素也可以幫助裂開或去除外部的細(xì)胞膜，釋放其內(nèi)包含的生物 活性生長劑。
[0043] 使用這些溶解劑和/或?qū)⑺斋@的樣品暴露于溶解條件可以跟著是如上所述的 中和，和/或去除任何不期望的殘余物的另外的第二過程。可以將溶解過程釋放的生長劑、 營養(yǎng)物等添加到載體，諸如合成的支架、生物支架和自體移植物、同種異體移植物、異種移 植物組織。在另外其他的實(shí)施方案中，作為載體的所收獲的樣品可以被暴露于溶解條件和 /或溶解劑，且由溶解過程釋放的生長因子可以被結(jié)合到樣品的至少一部分。換句話說，由 細(xì)胞物質(zhì)的溶解釋放的生長劑可以立即用于自體移植應(yīng)用。在其他實(shí)施方案中，所釋放的 生長劑可以被儲(chǔ)存用于同種異體移植應(yīng)用。儲(chǔ)存技術(shù)可以包括冷凍或凍干以保持生物活 性。生長因子和營養(yǎng)物還可以在所選擇的載體上被冷凍或凍干以允許刺激劑完全結(jié)合到載 體并允許通過外科醫(yī)生立即使用。凍干還允許更長的室溫貯藏壽命和濃縮成較小體積的機(jī) 會(huì)。
[0044] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及從含有細(xì)胞的生理溶液獲得特定組的生長因子和 營養(yǎng)物。在此實(shí)施方案中，細(xì)胞如上所述地被溶解且溶解產(chǎn)物溶液經(jīng)受具有帶電表面的材 料，該材料包括但不限于，色譜樹脂、陶瓷、礦化組織、脫礦質(zhì)的組織、軟組織以及具有電荷 的其他材料。帶電的表面吸引某些刺激生長劑和分子，從溶解產(chǎn)物溶液去除它們。剩余的 生長劑隨后可以被用于再生或修復(fù)期望的組織類型。類似于前述實(shí)施方案，生長劑溶液可 以被進(jìn)一步濃縮和冷凍或凍干以便延長貯藏壽命。
[0045] 本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方案包括選擇性地漂洗、溶解或去除某些細(xì)胞組分，同 時(shí)保留其他細(xì)胞組分。選擇性的溶解或去除可以通過上述方法以物理方式來實(shí)現(xiàn)。正如能 夠了解的，某些細(xì)胞可能對(duì)不同的溶解機(jī)制具有抵抗性。舉個(gè)非限制性的實(shí)例，間充質(zhì)干細(xì) 胞（MSC)是耐細(xì)胞溶解和滲透溶解的，這是因?yàn)樗鼈兊挚剐缘募?xì)胞壁和不足的細(xì)胞體積。 因此，為了實(shí)現(xiàn)選擇性溶解，滲透溶解可以用于溶解血液或骨髓中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞。一旦 非抵抗性的細(xì)胞被溶解，所得到的溶液是富集MSC種群的。接著，可以通過離心、熒光激活 細(xì)胞分選（FACS)、過濾、磁珠選擇和損耗（magnetic bead selection and depletion)和 / 或重力沉降來進(jìn)一步濃縮溶液。對(duì)同種異體移植來說，F(xiàn)ACS以及磁珠選擇和損耗可用于去 除將造成來自植入物患者的免疫反應(yīng)的任何剩余的細(xì)胞。一旦被植入后，細(xì)胞可以以均勻 的方式起作用且按照期望的表型分化。
[0046] 本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方案包括前面兩個(gè)實(shí)施方案的組合。生理溶液可以通過 選擇性的溶解被富集且進(jìn)一步通過離心、FACS、磁珠選擇和損耗和/或重力沉降被進(jìn)一步 濃縮。將富集的生理溶液添加到已經(jīng)按照前述方法溶解的生理溶液中以便幫助誘導(dǎo)細(xì)胞分 化成期望的表型。這些細(xì)胞隨后可以按期望的方式起作用以再生并修復(fù)組織。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，松質(zhì)骨可以被暴露于僅部分溶解存在的細(xì)胞種群的弱溶解 劑（諸如，但不限于，小于1M的乙酸）。在此實(shí)施方案中，部分溶解釋放生長因子并將它們 結(jié)合到骨，而其他細(xì)胞，諸如間充質(zhì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞可能仍保持活力并附著到骨。
[0048] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，松質(zhì)骨可以被暴露于弱溶解劑（諸如水），且然后經(jīng)受前述 的機(jī)械溶解條件（諸如熱分解、高/低壓力、聲處理、離心等）。一旦已經(jīng)溶解細(xì)胞，從含有 生長因子的溶液中去除骨、細(xì)胞碎片和碎屑。接著，通過添加酸或另外的質(zhì)子供體流體可以 使溶液變成帶正電的。溶液中的生長因子隨后可以使用所描述的技術(shù)而被進(jìn)一步濃縮，冷 凍或凍干成可溶的粉末。在將可溶的粉末在手術(shù)期間添加到植入物中之前，可以用流體重 新構(gòu)建可溶的粉末，或在植入之前，可溶的粉末以干粉末形式被添加到植入物。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，骨誘導(dǎo)性生長因子可以由含有細(xì)胞的生理流體形成。這些 細(xì)胞被按照前述方式溶解且可以被裝載到來自與細(xì)胞是相同的組織供體的自體移植物骨 上。刺激生長劑可以在凍干或冷凍之前被裝載到骨?？梢栽谘b載刺激生長劑之前，對(duì)骨進(jìn) 行礦化或脫礦質(zhì)以允許刺激生長劑更完全地結(jié)合。還可以在裝載刺激生長劑之前或之后使 骨顆粒化，允許其用在可流動(dòng)的組合物中。
[0050] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從活體供體、尸體供體或以自體方式收獲諸如滑液的 含有細(xì)胞的生理流體。流體可以經(jīng)受所述的機(jī)械或化學(xué)溶解條件以便增溶生長因子。一旦 從細(xì)胞釋放生長因子，那么可以通過所述的過程，諸如過濾、離心或重力沉降來去除固體物 質(zhì)（諸如細(xì)胞碎片、碎屑或血小板）。一旦去除了固體物質(zhì)，那么隨后通過添加酸或另外的 質(zhì)子供體流體可以使溶液變成帶正電的。溶液中的生長因子隨后可以使用所描述的技術(shù)而 被進(jìn)一步濃縮，冷凍或凍干成可溶的粉末。在將可溶的粉末在手術(shù)期間添加到植入物中之 前，可以用流體重新構(gòu)建可溶的粉末，或在植入之前，可溶的粉末以干粉末形式被添加到植 入物。可選擇地，具有或不具有滑液的軟骨可以按類似的方式被制備以便修復(fù)和再生軟骨 或椎間盤。此外，其他組織，諸如肌肉、脂肪、神經(jīng)、皮膚、心臟組織、血管組織、髓核組織、纖 維環(huán)組織或其他固體組織可以按照此方式被制備以用于幫助修復(fù)或再生組織。
[0051] 刺激生長劑可以從各種細(xì)胞溶液獲得。這些溶液可以包括培養(yǎng)的細(xì)胞和/或未受 培養(yǎng)的細(xì)胞，且來源可以是自體移植的、同種異體移植的或異種移植的。如果細(xì)胞來源是同 種異體移植的或異種移植的，那么可以按照前述方法施行至少部分溶解或免疫細(xì)胞損耗， 使得刺激生長劑不會(huì)引起患者的免疫反應(yīng)。可選擇地，在使用之前，可以去除免疫反應(yīng)劑， 諸如CD45+細(xì)胞和其他白細(xì)胞，以減輕或消除免疫反應(yīng)。這些免疫反應(yīng)劑可以通過本公開 內(nèi)容中前述的選擇性溶解被去除。
[0052] 本文所述的系統(tǒng)和方法可以用于手術(shù)環(huán)境，其中期望刺激生長劑植入患者內(nèi)。雖 然本公開內(nèi)容描述了用于產(chǎn)生刺激生長劑，尤其是從含有細(xì)胞的生理流體或細(xì)胞組織得到 的刺激生長劑的方法和系統(tǒng)，但是應(yīng)理解，方法和系統(tǒng)可以適用于多種醫(yī)療應(yīng)用，包括涉及 以下的醫(yī)療應(yīng)用：再生或修復(fù)骨、軟骨、肌肉、腱、韌帶、脈管系統(tǒng)、脂肪、纖維環(huán)、髓核、皮膚、 頭發(fā)、血液、淋巴結(jié)、筋膜、神經(jīng)、心臟、胰臟、肝臟、眼睛、牙齒、消化組織、呼吸組織、生殖組 織和其他軟組織應(yīng)用，諸如再生性醫(yī)療和組織工程。
[0053] 現(xiàn)在參考圖1，圖1描繪了根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案的方法。在圖1所闡釋 的實(shí)施方案中，顯示了可適于骨應(yīng)用的植入物。在圖1的實(shí)施方案中，在框102中，從尸體、 活體供體回收松質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲松質(zhì)骨。所收獲的松質(zhì)骨可以被研磨或切 割成期望的形狀和構(gòu)型，正如能夠了解的。在收獲和切割操作過程中，小心地保留骨內(nèi)的一 些細(xì)胞物質(zhì)、骨髓和/或血液。在現(xiàn)有技術(shù)的植入物中，可以從所收獲的骨樣品系統(tǒng)性地去 除和/或清潔骨內(nèi)的骨髓和/或血液。在本公開內(nèi)容的實(shí)施方案中，松質(zhì)骨可以具有皮質(zhì) 骨部分，諸如在髂嵴、椎體、髁等中。因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)特定應(yīng)用的需要，松質(zhì)骨 可以在進(jìn)一步處理之前使皮質(zhì)部分被去除。
[0054] 接著，在框104中，將松質(zhì)骨暴露于乙酸，乙酸起到如上所述的溶解劑的作用。在 一個(gè)實(shí)施方案中，乙酸濃度可以大于1 %，在〇. 2M-17M的摩爾濃度范圍內(nèi)。乙酸溶解劑用于 溶解保留在松質(zhì)骨的多孔骨結(jié)構(gòu)內(nèi)的和骨表面上的細(xì)胞。細(xì)胞的溶解釋放并增溶細(xì)胞物質(zhì) 內(nèi)包含的生長因子和生物活性材料。乙酸溶解劑還允許增溶的生物活性物結(jié)合到骨。在框 106中，在暴露于乙酸溶解劑之后且在生長因子和/或生物活性材料結(jié)合到骨之后，可以借 助漂洗劑進(jìn)一步漂洗并清潔骨。進(jìn)行漂洗是為了去除多余的乙酸、細(xì)胞碎片、脂質(zhì)和/或碎 屑。另外，在框108中，可以基本上中和所收獲的骨的pH。在一些實(shí)施方案中，在框106中， 可以通過漂洗劑和漂洗步驟來中和所收獲的骨的pH。在其他實(shí)施方案中，可以不需要pH中 和。在框110中，可以通過蒸發(fā)、真空干燥或凍干進(jìn)行脫水來將乙酸溶解劑降至微量并使植 入物達(dá)到更中性的pH來實(shí)現(xiàn)所收獲的骨的進(jìn)一步的pH中和。
[0055] 漂洗溶液可以是水、鹽水（NaCl、PBS等）、過氧化物、醇類（異丙醇、乙醇等）、類 晶體、消毒液（抗生素，諸如慶大霉素、萬古霉素、桿菌肽、多粘菌素、兩性霉素、氨芐西林、 阿米卡星、替考拉寧等）、保存液（DMEM、DMS0、甘露醇、蔗糖、葡萄糖等）、儲(chǔ)存劑和/或處理 同種異體移植物時(shí)使用的其他流體。所得到的產(chǎn)物得到具有增強(qiáng)的生物活性的松質(zhì)骨植入 物。在一些實(shí)施方案中，可以形成具有增強(qiáng)的生物活性的研磨的粒狀填料植入物以及結(jié)構(gòu) 性松質(zhì)骨植入物?，F(xiàn)在參考圖2,圖2描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。所描繪的流 程圖闡釋了形成植入物的方法，植入物由具有來自結(jié)合到皮質(zhì)骨材料的所收獲的松質(zhì)骨的 生物活性物和生長因子的所收獲的皮質(zhì)骨制備。在所描繪的實(shí)施方案中，在框202中，從尸 體、活體供體收獲皮質(zhì)骨，和/或以自體方式從患者收獲皮質(zhì)骨。在框204中，也從同一供 體收獲松質(zhì)骨。所收獲的皮質(zhì)骨可以被研磨或切割成期望的形狀和構(gòu)型，這取決于期望的 特定應(yīng)用?？梢郧鍧嵅⒚摰V質(zhì)皮質(zhì)骨（如，用鹽酸洗滌和/或用檸檬酸處理）以除去其礦 物質(zhì)成分。所收獲的松質(zhì)骨也可以被研磨或切割成特定的形狀或構(gòu)型，這取決于期望的應(yīng) 用。在收獲和切割操作期間，同樣小心地保留松質(zhì)骨內(nèi)的骨髓和血液。松質(zhì)骨可以具有皮 質(zhì)骨部分，諸如在髂嵴、椎體、髁等中。
[0056] 因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)植入物的應(yīng)用，松質(zhì)骨可以在進(jìn)一步處理之前使皮 質(zhì)部分被去除。接著，在框206中，將松質(zhì)骨暴露于作為溶解劑的鹽酸（如，0. 1M-16M)以溶 解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)內(nèi)的和骨表面上的細(xì)胞。細(xì)胞的溶解釋放和/或增溶細(xì)胞物質(zhì)內(nèi)包含 的生長因子和生物活性材料。與上面公開的圖1中的實(shí)施方案相比，鹽酸可以被用作溶解 齊IJ，所述溶解劑限制增溶的生長因子和生物活性物結(jié)合到松質(zhì)骨，但它們存在于鹽酸和溶 解產(chǎn)物混合物中。接著，在框208中，將溶解產(chǎn)物混合物中的增溶的生長因子和生物活性物 添加到從同一供體收獲的皮質(zhì)骨中。
[0057] 鹽酸混合物中的生長因子和生物活性物易于結(jié)合到礦化的和/或脫礦質(zhì)的皮質(zhì) 骨（如，1分鐘一 50小時(shí)的結(jié)合時(shí)間）。在框210中，在結(jié)合之后，可以進(jìn)一步漂洗并清潔皮 質(zhì)骨以除去多余的鹽酸、細(xì)胞碎片、脂質(zhì)和/或碎屑。漂洗溶液可以是水、鹽水、過氧化物、 醇類、類晶體、消毒液、保存液、儲(chǔ)存劑或處理同種異體移植物中使用的其他流體。在框212 中，皮質(zhì)骨隨后可以經(jīng)歷pH中和，在214中，通過脫水可以實(shí)現(xiàn)pH中和，正如上面在一些實(shí) 施方案中指明的。還可以通過其他化學(xué)劑或物理處理來實(shí)現(xiàn)pH中和，正如能夠了解的。因 此，可以按此方式制備具有增強(qiáng)的生物活性的研磨的粒狀填料植入物以及結(jié)構(gòu)性皮質(zhì)骨植 入物。
[0058] 現(xiàn)在參考圖3,圖3描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在框302中，從尸體、 活體供體收獲和/或回收皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。如 果特定的植入物應(yīng)用需要的話，那么松質(zhì)骨和/或皮質(zhì)骨可以被研磨或切割成期望的形狀 和構(gòu)型。在收獲和切割操作過程中，同樣小心地保留骨內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)、骨髓和/或血液。在 圖3的實(shí)施方案中，在框304中，所收獲的松質(zhì)骨和所收獲的皮質(zhì)骨被研磨，且然后被混合 以產(chǎn)生大體均勻的混合物。如果期望的話，在與松質(zhì)骨混合之前，可以使用如上所述的鹽酸 洗滌技術(shù)對(duì)皮質(zhì)骨進(jìn)行脫礦質(zhì)。
[0059] 通過與另一種流體（諸如水）混合可以進(jìn)一步均勻化松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨混合物，使 得生長因子可以更均勻地分布遍及混合物。接著，在框306中，將包含骨的溶液暴露于作為 溶解劑的乙酸（如，0.1M-17M濃度）以溶解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)內(nèi)的和骨表面上的細(xì)胞。細(xì) 胞的溶解釋放并增溶細(xì)胞物質(zhì)內(nèi)包含的生長因子和生物活性材料。乙酸還允許增溶的生物 活性物結(jié)合到皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨混合物?？梢云谕M(jìn)一步的酸洗滌以對(duì)骨進(jìn)行進(jìn)一步的脫礦 質(zhì)，以降低其模量和/或使其更像海綿。任何類型的酸，包括乙酸、鹽酸、檸檬酸、磷酸等，可 以用于對(duì)骨進(jìn)行進(jìn)一步的脫礦質(zhì)。
[0060] 在框308中，在結(jié)合之后可以進(jìn)一步漂洗并清潔骨以除去多余的酸、細(xì)胞碎片、月旨 質(zhì)和/或碎屑。在一些實(shí)施方案中，在框310和312中，骨可以通過蒸發(fā)、真空干燥或凍干 進(jìn)行脫水以除去任何殘余的乙酸并中和皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨混合物的pH。漂洗溶液可以包括 水、鹽水、過氧化物、醇類、類晶體、消毒液、保存液、儲(chǔ)存劑或處理同種異體移植物中使用的 其他流體。因此，可以按此方式制備具有增強(qiáng)的生物活性的研磨的粒狀填料植入物以及結(jié) 構(gòu)性皮質(zhì)松質(zhì)骨植入物。
[0061] 現(xiàn)在參考圖4,圖4描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在框402中，從尸體、 活體供體回收松質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲松質(zhì)骨。如果特定的植入物應(yīng)用需要，那么 所收獲的松質(zhì)骨可以被研磨或切割成期望的形狀和構(gòu)型。在收獲和切割操作過程中，同樣 小心地保留骨內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)、骨髓和/或血液。松質(zhì)骨可以具有皮質(zhì)骨部分，諸如在髂嵴、 椎體、髁等中。因此，可以從松質(zhì)骨去除松質(zhì)骨的皮質(zhì)部分。在框404中，松質(zhì)骨隨后可以被 暴露于作為溶解劑的乙酸（如，0.1M-17M)以溶解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)內(nèi)的和骨表面上的細(xì) 胞。細(xì)胞的溶解釋放并增溶細(xì)胞物質(zhì)內(nèi)包含的生長因子和生物活性材料。乙酸還允許增溶 的生物活性物結(jié)合到骨。在框408中，可以使用任何酸來進(jìn)行至少一次脫礦質(zhì)洗滌而進(jìn)一 步使松質(zhì)骨脫礦質(zhì)，以改變骨的機(jī)械特性并去除礦物質(zhì)成分，酸包括但不限于，乙酸、鹽酸、 檸檬酸、磷酸等。
[0062] 在框410中，在脫礦質(zhì)洗滌之間可以進(jìn)行壓縮測(cè)試以確定給定應(yīng)用中，骨的柔性 和壓縮性水平是否是可接受的。如果骨對(duì)期望的應(yīng)用來說太硬的話，那么可以進(jìn)行進(jìn)一步 的脫礦質(zhì)洗滌。在框411中，一旦達(dá)到期望的柔性，那么在結(jié)合之后，可以進(jìn)一步漂洗和清 潔骨以去除多余的乙酸、細(xì)胞碎片、脂質(zhì)或碎屑。在一些實(shí)施方案中，在框412和414中，可 以通過蒸發(fā)、真空干燥或凍干對(duì)骨進(jìn)行脫水以去除任何殘留的乙酸并使植入物達(dá)到更中性 的pH。應(yīng)理解，通過化學(xué)試劑或不同于脫水的物理過程可以實(shí)現(xiàn)pH中和。漂洗溶液可以是 水、鹽水、過氧化物、醇類、類晶體、消毒液、保存液、儲(chǔ)存劑或處理同種異體移植物中使用的 其他流體。因此，可以按此方式制備具有增強(qiáng)的生物活性的研磨的粒狀填料植入物以及結(jié) 構(gòu)性但柔性/可壓縮的松質(zhì)骨植入物。
[0063] 現(xiàn)在參考圖5,圖5描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在框502中，從尸體、 活體供體收獲皮質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲皮質(zhì)骨。根據(jù)植入物的應(yīng)用，皮質(zhì)骨可以被 研磨或切割成期望的形狀和構(gòu)型。因此，在框504中，還從與皮質(zhì)骨的供體相同的供體收獲 松質(zhì)骨。松質(zhì)骨可以根據(jù)植入物的應(yīng)用被研磨或切割成特定的形狀或構(gòu)型。在收獲和切割 操作過程中，同樣小心地保留骨內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)、骨髓和/或血液。松質(zhì)骨可以具有皮質(zhì)骨部 分，諸如在髂嵴、椎體、髁等中。因此，在進(jìn)一步處理之前，松質(zhì)骨可以具有去除的皮質(zhì)骨。在 框506中，松質(zhì)骨被暴露于溶解劑，以溶解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)內(nèi)的和骨表面上的細(xì)胞，溶解 劑諸如但不限于，鹽酸。
[0064] 在框510和框512中，可以清潔并脫礦質(zhì)所收獲的皮質(zhì)骨以去除其礦物質(zhì)成分，礦 物質(zhì)成分包括但不限于，鈣鹽。此脫礦質(zhì)過程可以涉及浸泡在酸中和/或?qū)⑺嵫h(huán)真空灌 注到骨的孔內(nèi)。
[0065] 作為非限制性的實(shí)例，采用真空輔助的循環(huán)脫礦質(zhì)方法可以縮短所要求的脫礦質(zhì) 時(shí)間1分鐘到59分鐘。真空輔助的循環(huán)脫礦質(zhì)循環(huán)可以促進(jìn)基本上均勻地去除整個(gè)植入 物的，而不僅僅是表面上的鈣礦物質(zhì)。如果通過將皮質(zhì)骨浸泡在酸中來施行脫礦質(zhì)步驟，那 么可能發(fā)生非均勻地去除鈣礦物質(zhì)。非均勻地去除鈣礦物質(zhì)可以導(dǎo)致遍布植入物的不同部 分的變化的鈣濃度梯度。
[0066] 相比于將樣品浸泡在酸中，采用真空輔助的循環(huán)脫礦質(zhì)可以導(dǎo)致更均勻的鈣濃 度，得到具有更好的韌性和彈性的更結(jié)實(shí)的植入物。另外，此過程可以用于降低骨的模量以 更好地匹配患者的手術(shù)植入部位處存在的天然機(jī)械性能。這對(duì)骨質(zhì)疏松的、骨質(zhì)減少的患 者、或具有低的骨密度或骨礦物質(zhì)密度的患者來說可能是有優(yōu)勢(shì)的。而且，此均勻降低的模 量在植入部位被去皮質(zhì)的手術(shù)部位方面是有優(yōu)勢(shì)的。均勻地去除鈣礦物質(zhì)還可以降低脊柱 融合術(shù)中的下沉速率。此外，使用真空輔助的循環(huán)脫礦質(zhì)可以在皮質(zhì)骨內(nèi)得到更好的生長 因子保留。
[0067] 在框514中，如果確定皮質(zhì)骨的模量水平是可接受的，那么此降低模量的皮質(zhì)骨 或皮質(zhì)松質(zhì)骨也可以被制成具有結(jié)合的生長因子和/或生物活性材料。溶解所收獲的松質(zhì) 骨的細(xì)胞釋放并增溶細(xì)胞物質(zhì)內(nèi)包含的生長因子和生物活性材料。鹽酸還限制增溶的生物 活性物和生長因子結(jié)合到松質(zhì)骨。在框515中，將鹽酸中增溶的生長因子和生物活性物添 加至從同一供體收獲的皮質(zhì)骨。生長因子和生物活性物易于結(jié)合到礦化或脫礦質(zhì)的皮質(zhì) 骨。
[0068] 在框516中，在結(jié)合之后，可以進(jìn)一步漂洗和清潔骨以去除過量的鹽酸、細(xì)胞碎 片、脂質(zhì)和/或碎屑等。漂洗溶液可以是水、鹽水、過氧化物、醇類、類晶體、消毒液、保存液、 儲(chǔ)存劑或處理同種異體移植物中使用的其他流體。另外，如果進(jìn)一步使植入物脫礦質(zhì)，那么 在結(jié)合生物活性物和/或生長因子之前或之后，可以將植入物制成柔性的。因此，可以按此 方式制備具有增強(qiáng)的生物活性的降低模量的結(jié)構(gòu)性骨植入物。
[0069] 現(xiàn)在參考圖6,圖6描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在框602中，從尸體、 活體供體收獲骨髓或以自體方式從患者收獲骨髓。如果使用尸體供體，那么可以通過在進(jìn) 行任何骨截取之前收獲髓來獲得更高量的髓。在一些實(shí)施方案中，使用附接至真空線的管 狀鉆來收獲髓也將增大來自尸體供體的骨髓的收率。管狀鉆的末端在松質(zhì)骨內(nèi)分開，允許 真空將髓牽拉通過管進(jìn)入收集室。
[0070] 在從生命支撐物去除供體之前，從活體供體收獲髓也可以被用作髓收獲技術(shù)，這 是因?yàn)殡S著髓被去除，由生理循環(huán)產(chǎn)生的血流將額外的骨髓物質(zhì)沖到用于進(jìn)一步抽吸的區(qū) 域內(nèi)。在框406中，在收獲髓之后，特定的細(xì)胞類型（諸如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞 或其他祖細(xì)胞）可以通過過濾、離心、磁珠結(jié)合、熒光激活細(xì)胞分選（FACS)和/或正如能夠 了解的其他細(xì)胞分選或濃縮技術(shù)來進(jìn)行濃縮以增大細(xì)胞濃度、分級(jí)細(xì)胞類型或消除溶液中 特定的細(xì)胞類型。在框606中，一旦獲得期望的細(xì)胞種群，可以將細(xì)胞種群暴露于前述溶解 技術(shù)，諸如暴露于乙酸。
[0071] 一旦將乙酸添加到細(xì)胞之后，給予它們時(shí)間溶解且生長因子和其他生物活性物被 增溶。可以離心或過濾溶液以消除任何細(xì)胞碎片或細(xì)胞碎屑。溶液可以經(jīng)歷第二次過濾步 驟以去除其他固體沉淀物，諸如沉淀的血紅蛋白。溶液可以經(jīng)歷第三次過濾步驟以濃縮溶 液中的生長因子和其他生物活性物。溶液隨后通過諸如凍干的前述方法進(jìn)行脫水。在框610 中，使溶液成為水溶性的粉末且在框612中，可以在真空下進(jìn)行密封以增加貯藏壽命。還可 以冷凍該溶液來增加貯藏壽命。此粉末可以富集大量的生物活性分子和/或生長因子，包 括但不限于，BMP-2、VEGF、aFGF、FGF-6、TGF-B1和正如能夠了解的其他物質(zhì)。
[0072] 現(xiàn)在參考圖7,圖7描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在所描繪的實(shí)施方案 中，在框702中，從尸體、活體供體回收松質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲松質(zhì)骨。如果特定 的植入物應(yīng)用需要，那么所收獲的松質(zhì)骨可以被研磨或切割成期望的形狀和構(gòu)型。在收獲 和切割操作過程中，同樣小心地保留骨內(nèi)的骨髓和血液。松質(zhì)骨可以具有皮質(zhì)骨部分，諸如 在髂嵴、椎體、髁等中。因此，在進(jìn)一步處理之前，松質(zhì)骨可以具有去除的皮質(zhì)骨。在框704 中，松質(zhì)骨被暴露于諸如水的溶解劑，以溶解松質(zhì)骨內(nèi)包含的細(xì)胞。如果諸如肝素的特定 抗凝血?jiǎng)┍挥米魅芙鈩敲赐ㄟ^溶解細(xì)胞釋放的生長因子將在溶液中被增溶。如果不使 用抗凝血?jiǎng)蛉绻褂貌煌目鼓獎(jiǎng)?，諸如檸檬酸鈉，那么細(xì)胞將被溶解并釋放生長因 子，但它們?cè)诹黧w中將不會(huì)被充分增溶。
[0073] 在此情形中，在框706中，從流體隨后去除骨并在框708中，將諸如酸的增溶劑添 加到流體中以增溶生長因子和其他生物活性物。在框710中，一旦增溶生長因子和其他生 物活性物之后，可以中和和/或凍干流體。如果乙酸被用作增溶劑，那么可能不需要中和， 因?yàn)橄喈?dāng)大量的乙酸在凍干期間將蒸發(fā)。可選擇地，其他溶解劑和增溶劑可以用于溶解細(xì) 胞并增溶生長因子，防止生長因子和生物活性材料結(jié)合到從其收獲細(xì)胞的松質(zhì)骨。
[0074] 現(xiàn)在參考圖8,圖8描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在所描繪的實(shí)施方案 中，在框802中，從尸體、活體供體回收松質(zhì)骨，或以自體方式從患者收獲松質(zhì)骨。如果特定 的植入物應(yīng)用需要，那么松質(zhì)骨可以被研磨或切割成期望的形狀和構(gòu)型。在收獲和切割操 作過程中，同樣小心地保留骨內(nèi)的骨髓和血液。松質(zhì)骨可以具有皮質(zhì)骨部分，諸如在髂嵴、 椎體、髁等中。因此，所收獲的松質(zhì)骨的皮質(zhì)部分可以被去除。在框804中，所收獲的松質(zhì) 骨被暴露于水以選擇性地溶解不期望的細(xì)胞類型，諸如紅細(xì)胞、白細(xì)胞等。在一些實(shí)施方案 中，可以采用1份骨對(duì)1份水以及1份骨對(duì)200份水的范圍的骨對(duì)水的比率。未被附著到 骨的任何剩余的有活力的細(xì)胞可以按此方式被漂洗掉。另外，使用弱溶解劑（諸如小于1M 的乙酸）可以導(dǎo)致增溶的生長因子結(jié)合到骨，但仍保持附著到骨的有活力的祖細(xì)胞。
[0075] 諸如間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、祖細(xì)胞等的期望的細(xì)胞在多孔的骨結(jié)構(gòu)內(nèi)和 骨表面上仍保持活力。其他前述機(jī)械溶解技術(shù)，諸如聲處理、攪拌引起的剪切、熱分解等可 以與水浴結(jié)合使用以促進(jìn)細(xì)胞物質(zhì)的溶解。在溶解時(shí)間（如，1分鐘-50小時(shí)）過去之后， 在框806中添加鹽水以使溶液的同滲濃度恢復(fù)至生理水平（如約0. 9%的鹽）。在溶液恢 復(fù)至等滲條件之后，在框808中傾析流體，剩下骨。有效的漂洗也促進(jìn)未附著到松質(zhì)骨的不 期望的細(xì)胞的去除且在傾析步驟中丟棄它們。
[0076] 在框810中可以將抗生素應(yīng)用至骨以幫助降低生物負(fù)荷水平?？蛇x擇地，在一些 實(shí)施方案中，在溶解步驟之前，可以將抗生素施用至所收獲的松質(zhì)骨?？梢允褂玫囊恍┛股?素包括慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素、前面提到的或正如能夠了解的其他抗生素，或可以 被用于降低同種異體移植物組織的生物負(fù)荷的各種抗生素。在降低生物負(fù)荷之后，在框812 中，骨可以被暴露于儲(chǔ)存流體或保存液，諸如DMEM、DMS0、蔗糖、甘露醇、葡萄糖等。隨后冷 凍骨，直到被融化使用在手術(shù)過程中以修復(fù)骨骼缺陷。在一些實(shí)施方案中，可以在_40°C或 低于-40°C的溫度下冷凍骨。
[0077] 現(xiàn)在參考圖9,圖9描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在所描繪的實(shí)施方 案中，在脫水之前，可以將上面參考圖6和/或圖7所描述的實(shí)施方案（作為非限制性的實(shí) 例）中獲得的生長因子和生物活性物添加到可生物降解的或可吸收的聚合物中。因此，在 框902中收獲的骨髓可以在框904中經(jīng)受至少一次過濾過程，正如上面參考圖6描述的。在 框906中，所收獲的骨髓可以經(jīng)受溶解劑，也正如上面描述的。
[0078] 在此實(shí)施方案中，按照前面的描述收獲生長因子和生物活性物并與諸如酸的常用 溶劑一起添加到聚合物中。可生物降解的聚合物可以是蛋白或多糖，諸如膠原、透明質(zhì)烷、 殼聚糖、明膠等以及兩種或更多種聚合物的組合。在框910中，在生長因子和生物活性物被 添加到聚合物之后，混合以獲得基本上均勻的溶液。然后可以從基本上均勻的溶液中去除 任何氣泡或雜質(zhì)。如果期望其他物質(zhì)（例如但不限于，磷酸鈣、脫礦質(zhì)的骨、羥基磷灰石、肝 素、硫酸軟骨素等）被嵌入到植入物中，用于生長因子附著、產(chǎn)物降解、和/或機(jī)械增強(qiáng)，那 么它們還可以被添加到混合物中。
[0079] 在框912中，在一些實(shí)施方案中，可以在_200°C到0°C的范圍內(nèi)的溫度下冷凍混合 物，以使混合物內(nèi)包含的水成核成冰以及將聚合物/生物活性物混合物冷凝成多孔結(jié)構(gòu)。 可以將混合物冷凍成任何幾何形狀，包括球形、圓柱形、矩形、片形式、管形式等。植入物將 往往保持其形狀，且聚合物的形狀記憶特性將給予在體內(nèi)膨脹的余地?？梢陨邷囟纫援a(chǎn) 生更大的孔或降低溫度以產(chǎn)生小的孔。可以通過將冷溫度源定位成基本上垂直于孔的期望 方向來定向制造孔。一旦以期望的溫度和孔方向冷凍混合物，那么在框914中凍干和/或 脫水植入物以基本上消除其內(nèi)包含的水。如果乙酸或另外的揮發(fā)性物質(zhì)被用作溶劑，那么 通過凍干也將基本上消除溶劑。
[0080] 在框915中，在凍干循環(huán)結(jié)束后，支架可以在乙醇、鹽水、堿或緩沖劑中被基本上 中和，這取決于用作溶解劑的溶劑。在乙酸溶劑的情形中，在框916中，凍干的植入物可以 在乙醇中，然后在鹽水或其他漂洗劑中被漂洗。在鹽水漂洗后，植入物可以用水漂洗成不含 鹽并真空干燥或凍干以延長貯藏壽命。在框918中，脫水的植入物可以在真空下被封裝或 被密封在真空密封瓶中。在冷凍或凍干之前或中和和凍干之后，還可以壓縮植入物以產(chǎn)生 緊湊的支架，當(dāng)暴露于流體時(shí)，該支架膨脹。當(dāng)暴露于流體時(shí)，這樣的植入物膨脹到基本上 近似于最初的支架尺寸。延遲的膨脹可以通過壓縮中和的支架并干燥而不冷凍來實(shí)現(xiàn)。
[0081] 現(xiàn)在參考圖10,圖10描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。在所描繪的實(shí)施方 案中，可以將參考圖6和圖7所討論的實(shí)施方案（作為非限制性的實(shí)例）中獲得的生長因 子和/或生物活性物添加到可生物降解的或可吸收的聚合物中以產(chǎn)生可流動(dòng)的流體和/或 凝膠。在此實(shí)施方案中，按照前面的描述收獲生長因子和生物活性物并與諸如酸的常用溶 劑一起添加到聚合物中。因此，在框1002中收獲的骨髓可以在框1004中經(jīng)受至少一次過 濾過程，正如上面參考圖6描述的。在框1006中，所收獲的骨髓可以經(jīng)受溶解劑，也正如上 面描述的。
[0082] 可生物降解的聚合物可以是蛋白或多糖，諸如膠原、透明質(zhì)烷、殼聚糖、明膠等以 及兩種或更多種聚合物的組合。在框1010中，在生長因子和生物活性物被添加到聚合物之 后，混合以獲得基本上均勻的溶液?？梢匀コ魏螝馀莼螂s質(zhì)。如果期望其他物質(zhì)（包括 但不限于，磷酸鈣、脫礦質(zhì)的骨、羥基磷灰石、肝素、硫酸軟骨素等）被嵌入到植入物中，用 于生長因子附著、產(chǎn)物降解、和/或機(jī)械增強(qiáng)，那么它們還可以被添加到混合物中。
[0083] 可以選擇身體完全耐受的溶解劑。例如，可以將生長因子和生物活性物添加到殼 聚糖中和乙酸溶液（0.01M-17M)中。也可以將脫礦質(zhì)的骨添加到溶液中?；旌先芤?，且可 以通過施加真空或離心去除氣泡。在框1012中，凝膠可以被封裝在注射器中且被冷凍和/ 或保持在環(huán)境溫度下。一旦注射入和/或植入身體內(nèi)，凝膠結(jié)合到組織。生理流體可以緩 沖凝膠以中和pH并使凝膠原位凝固。一旦凝膠凝固，期望的治療植入物保持在預(yù)期的手術(shù) 部位中且使移動(dòng)最少。
[0084] 現(xiàn)在參考圖11，圖11描繪了本公開內(nèi)容的可選擇的實(shí)施方案。可以使用諸如真空 干燥、溶劑蒸發(fā)等技術(shù)對(duì)參考圖10討論的上述實(shí)施方案中的描述獲得的凝膠進(jìn)行脫水，以 使凝膠變成半剛性的膜和/或丸。因此，在框1102中收獲的骨髓可以在框1104中經(jīng)受至 少一次過濾過程，正如上面參考圖6描述的。在框1106中，所收獲的骨髓可以經(jīng)受溶解劑， 也正如上面描述的。
[0085] 在框1112中按照上面的描述使凝膠脫水。在框1114中，丸可以被進(jìn)一步研磨或 切割成期望的粒徑，這取決于期望的植入物應(yīng)用。一旦暴露于流體并植入手術(shù)部位中，丸和 /或由研磨的丸產(chǎn)生的粉末形成也可以被結(jié)合到組織的粘性油灰。此結(jié)合特性使油灰基本 上保持在被植入時(shí)的手術(shù)部位處的位置。此油灰可以被用作生物活性物手術(shù)粘合劑。當(dāng)與 使用在手術(shù)過程中的自體移植物材料，諸如使用在脊柱融合程序中的自體移植物骨一起使 用時(shí)，應(yīng)用這樣的油灰也可以是有優(yōu)勢(shì)的，這是因?yàn)橛突铱梢杂幸嬗趲椭棺泽w移植物保 持成粘合塊且使移動(dòng)最少。
[0086] 雖然在所包括的附圖中描繪的流程圖顯示了各種步驟的具體施行順序，但是應(yīng)理 解，施行順序可以不同于所描述的施行順序。例如，兩個(gè)或更多個(gè)框中的施行順序可以相對(duì) 于所顯示的順序被擾亂。而且，按順序顯示的兩個(gè)或更多個(gè)框可以同時(shí)施行或部分同時(shí)發(fā) 生。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本公開內(nèi)容的上述實(shí)施方案僅僅是為清楚地理解本公開內(nèi)容的原理而提出 的施行的可能的實(shí)例。可以對(duì)上述實(shí)施方案做出許多變化和修改而基本上并不偏離本公開 內(nèi)容的精神和原理。所有這樣的修改和變化預(yù)期被包括在此處的本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)且由 下面的權(quán)利要求保護(hù)。
【權(quán)利要求】
1. 一種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟： 對(duì)收獲的骨髓施行過濾以去除不期望的細(xì)胞種群； 將所收獲的骨髓暴露于乙酸溶解劑； 基本上中和所收獲的骨髓的pH ; 使所溶解的骨髓脫水成粉末形式； 真空密封所溶解的骨髓。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述粉末富集生物活性分子和/或生長因子。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生物活性分子和/或生長因子包括BMP-2、 VEGF、aFGF、FGF-6 或 TGF-B1。
4. 一種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟： 對(duì)收獲的骨髓施行過濾； 將所收獲的骨髓暴露于乙酸溶解劑； 混合可生物降解的聚合物與所收獲的骨髓以形成基本上均勻的混合物； 冷凍髓一聚合物混合物； 使髓一聚合物混合物脫水成粉末形式； 基本上中和髓一聚合物混合物的pH ; 用漂洗劑漂洗髓一聚合物混合物； 真空密封髓一聚合物混合物。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是蛋白或多糖。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是膠原、透明質(zhì)烷、殼聚 糖、明膠以及兩種或更多種聚合物的組合。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中從所述基本上均勻的混合物中去除氣泡或雜質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中磷酸鈣、脫礦質(zhì)的骨、羥基磷灰石、肝素或硫酸軟骨 素被添加到所述混合物中。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中在-200°C到0°C的范圍內(nèi)的溫度下冷凍所述混合物。
10. -種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟： 對(duì)收獲的骨髓施行過濾； 將所收獲的骨髓暴露于乙酸溶解劑； 混合可生物降解的聚合物與所收獲的骨髓以形成基本上均勻的凝膠混合物； 封裝髓一聚合物凝膠。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是蛋白或多糖。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是膠原、透明質(zhì)烷、殼聚 糖、明膠以及兩種或更多種聚合物的組合。
13. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中磷酸鈣、脫礦質(zhì)的骨、羥基磷灰石、肝素或硫酸軟 骨素被添加到所述混合物中。
14. 一種制造骨誘導(dǎo)性植入物的方法，包括下述步驟： 對(duì)收獲的骨髓施行過濾； 將所收獲的骨髓暴露于乙酸溶解劑； 基本上中和所收獲的骨的pH ; 混合可生物降解的聚合物與所收獲的骨髓以形成基本上均勻的凝膠混合物； 使髓一聚合物凝膠脫水以形成髓一聚合物丸； 將髓一聚合物丸成形為期望的植入形狀。
15. -種通過權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法制備的骨植入物。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK104208752SQ201410413348
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2009年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月13日
【發(fā)明者】艾米特·普拉卡什·高維爾 申請(qǐng)人:先進(jìn)生物制品有限責(zé)任公司