一種含融合蛋白a1d4的結核病亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含融合蛋白A1D4的結核病亞單位疫苗。所述結核病亞單位疫苗,含有融合蛋白A1D4,其濃度為0.1mg/ml至1mg/ml,所述融合蛋白A1D4其編碼基因為Rv1813、Rv2660c、Ag85B、Rv2623以及HspX基因按照Rv1813-Rv2660c-Ag85B-Rv2623-HspX的順序串聯(lián)。本發(fā)明提供的含融合蛋白A1D4的結核病亞單位疫苗,免疫應答效果好,接種風險低。
【專利說明】一種含融合蛋白AlD4的結核病亞單位疫苗
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域,更具體地,涉及一種含融合蛋白A1D4的結核病亞單位 疫苗。
【背景技術】
[0002] 卡介苗(Mycobacterium bovis BCG)是臨床上唯一應用于結核?。╰uberculosis, TB)預防的減毒活疫苗,目前每年全球嬰幼兒接種覆蓋率高達90%以上,迄今累計免疫接 種人群已超過30億人。廣泛的臨床和流行病學研究已證實,卡介苗可有效預防嬰幼兒結核 病。但BCG的免疫保護期短,一般認為僅10?15年,無法對成人結核病的預防提供穩(wěn)定、 理想的保護效果(介于0?80% )。因此,研制有效的預防成人結核病的疫苗,勢在必行。
[0003] 亞單位蛋白疫苗因其組成成分明確、具有較好的安全性,既是疫苗研制的重要類 型之一,也在結核病的預防領域受到廣泛重視。迄今,一共有十二種結核病新型候選疫苗進 入人體臨床試驗,亞單位蛋白疫苗占六種,也表明其在結核病新型疫苗研制中的重要地位。 目前,結核病亞單位疫苗雖然安全穩(wěn)定,便于生產,仍然存在免疫應答效果不理想的問題。
【發(fā)明內容】
[0004] 針對現(xiàn)有技術的以上缺陷或改進需求,本發(fā)明提供了一種含融合蛋白A1D4的結 核病亞單位疫苗,其目的在于通過選擇抗原基因和融合順序制造出融合蛋白,配合適當?shù)?的疫苗佐劑,由此解決現(xiàn)有的結核病疫苗有接種風險、免疫應答效果不理想的技術問題。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的,按照本發(fā)明的一個方面,提供了一種結核病亞單位疫苗,含有 融合蛋白A1D4,其濃度為0. lmg/ml至lmg/ml,所述融合蛋白A1D4其編碼基因為Rvl813、 Rv2660c、Ag85B、Rv2623 以及 HspX 基因按照 Rvl813-Rv2660c-Ag85B-Rv2623-HspX 的順序 串聯(lián)。
[0006] 優(yōu)選地,所述結核病亞單位疫苗,其所述融合蛋白A1D4的序列為:
[0007] (1)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;或
[0008] (2)與序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能 蛋白質的氨基酸序列;或
[0009] (3) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸具有同 等活性的由(1)衍生的蛋白。
[0010] 優(yōu)選地,所述結核病亞單位疫苗,還含有0. 2mg/ml至0. 3mg/ml的單磷酰脂質A、 0. 2mg/ml至0. 3mg/ml的海藻糖、體積分數(shù)1%至4%的角S烯油、體積分數(shù)1%至4%的司 盤85 (Span85)以及體積分數(shù)0. 1 %至0.4%的吐溫-80,為油包水樣溶液。
[0011] 優(yōu)選地,所述結核病亞單位疫苗,其所述海藻糖為6, 6' -二分枝菌酸。
[0012] 總體而言,通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現(xiàn)有技術相比,能夠取得下列有 益效果:
[0013] 1、以全血干擾素釋放分析(WBIA)技術,篩選到的抗原Ag85B、Rvl813、Rv2660c、 HspX和Rv2623以及A1D4,均可刺激中國M. tb感染人群的外周血產生高水平的IFN-γ,而 且A1D4刺激的水平顯著高于各亞組分抗原的刺激產生的IFN-Y水平。證實了 A1D4是可 被中國M. tb感染人群的T細胞識別的抗原,綜合了抗原Ag85B、Rvl813、Rv2660c、HspX和 Rv2623的優(yōu)勢,具有良好的免疫應答效果。
[0014] 2、A1D4/MT0亞單位蛋白疫苗的保護性主要依賴于抗原特異性的⑶4+Thl反應。 A1D4/MT0組小鼠脾細胞針對特異性抗原A1D4的刺激,可誘導分泌相對于PBS組高水平的 TNF-α和IFN-Y ;同時,A1D4/MT0亞單位蛋白疫苗免疫小鼠,誘導產生了顯著高水平的 A1D4特異性IgG抗體,其IgG2a/IgGl比值亦顯著升高,明顯傾向Thl型免疫應答。
[0015] 3、本發(fā)明提供的亞單位疫苗,其產生免疫應答效果的融合蛋白A1D4,不存在致病 的能力,因此相對于現(xiàn)有的結核病疫苗,本發(fā)明提供的亞單位疫苗接種風險大大降低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例2融合蛋白A1D4及各亞組分蛋白純化產物的Western-blotting鑒 定;
[0017] 圖2是實施例6比較融合蛋白A1D4及亞組分蛋白分別刺激M.tb感染人群 (rCM-WBIA-positive)和 M. tb 未感染人群(rCM-WBIA-negative)產生的 IFN-γ 水平;
[0018] 圖3是實施例7亞單位疫苗A1D4/MT0免疫小鼠血清中特異性抗體水平;
[0019] 圖4是實施例8亞單位疫苗A1D4/MT0免疫小鼠脾細胞分泌A1D4特異性細胞因子 水平;
[0020] 圖5是實施例9亞單位疫苗A1D4/MT0免疫小鼠脾臟抗原特異性總IFN- Y和總 TNF-α分泌型T淋巴細胞
[0021] 圖6是實施例10亞單位疫苗A1D4/MT0免疫小鼠抗Μ. tb H37Rv標準毒株經尾靜 脈感染后臟器荷菌量;
[0022] 圖7是實施例10M. tb H37Rv感染小鼠肺臟病理圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結合附圖及實施例,對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并 不用于限定本發(fā)明。此外,下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要 彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0024] 本發(fā)明提供的結核病亞單位疫苗,其特征在于,含有融合蛋白A1D4,其濃度為 0· lmg/ml 至 lmg/ml,還含有 0· 2mg/ml 至 0· 3mg/ml 的單磷酰脂質 A、0. 2mg/ml 至 0· 3mg/ ml的海藻糖、體積分數(shù)I %至4%的角g烯油、體積分數(shù)I %至4%的司盤85 (Span85)以及 體積分數(shù)〇. 1 %至0.4%的吐溫-80,為油包水樣溶液。所述融合蛋白A1D4其編碼基因為 Rvl813、Rv2660c、Ag85B、Rv2623 以及 HspX 基因按照 Rvl813-Rv2660c-Ag85B-Rv2623-HspX 的順序串聯(lián)。所述海藻糖為人工合成的6, 6' -二分枝菌酸。
[0025] 所述融合蛋白A1D4的序列為:
[0026] (1)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;或
[0027] (2)與序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能 蛋白質的氨基酸序列;或
[0028] (3) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸具有同 等活性的由(1)衍生的蛋白。
[0029] M. tb感染人體后,在機體的發(fā)生和發(fā)展過程可分為原發(fā)感染、潛伏感染和原發(fā)后 感染等不同階段。在不同階段M.tb代謝和轉錄表達的基因譜亦具有階段特異性。M.tb經 呼吸道原發(fā)感染機體后,早期采取免疫抑制和免疫逃避,既逃避機體抗感染的固有免疫應 答,也阻止DC細胞移行到局部淋巴結進行抗原提呈,從而延緩適應性免疫應答(主要是 CD4+Thl細胞免疫應答),使M. tb在體內大量復制并建立原發(fā)感染。原發(fā)感染階段,體內 M. tb在巨噬細胞中表達的代表基因以Ag85復合物為主。DC細胞一旦到達局部淋巴結,即 可致敏T細胞,尤其是CD4+Thl細胞并使其歸巢到感染病灶,通過分泌IFN-γ等細胞因子 活化巨噬細胞并吞噬殺傷細菌,同時募集更多的巨噬細胞浸潤在感染部位形成肉芽腫,導 致潛伏感染的形成。體外模擬潛伏感染的厭氧環(huán)境,揭示M. tb在潛伏階段由休眠調節(jié)基因 DosR調控,編碼并上調48個基因表達,包括HspX、Rv2623和Rv2626c等。另外,有一些基因 參與潛伏感染階段的M. tb的代謝調控,如PhoY2、Rv3407、Rv2660c等。在免疫力下降(特 別是合并感染HIV)、年老、糖尿病、器官移植、營養(yǎng)缺陷和使用免疫抑制劑等情況,潛伏感染 人群(LTBI)體內處于休眠狀態(tài)的M.tb可能再次激活,形成內源性感染,進而發(fā)展為活動性 TB患者。對機體而言,⑶8+T細胞在控制M.tb再激活過程中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視作用。 更重要的是,BCG免疫對某些階段的特異性抗原弱或無應答。這也是造成BCG對潛伏感染 和成人TB保護性差的重要原因之一。但是,究竟這些不同階段性特征性表達的蛋白,哪 些是重要的保護性抗原,適宜用于TB疫苗的發(fā)展,尚不清楚。
[0030] 因此,我們首先原核表達純化了 M. tb階段性表達的一系列抗原,從這些抗原中, 經全血干擾素釋放分析技術(WBIA),篩選能夠被中國M. tb感染人群的T細胞識別的抗原。 由于中國人群99%以上均被BCG免疫接種過,BCG免疫會影響全血干擾素釋放分析的結果。 我們前期研究中建立了一種基于M. tb特有的RD2區(qū)蛋白CFP21和MPT64的全血干擾素釋 放分析技術檢測方法(rCM-WBIA),由于RD2區(qū)在BCG中國株中缺失,其特異性不受BCG中 國株對中國人群免疫的影響?;趯】滴锤腥救巳?、結核感染人群(包括潛伏感染人群 和結核病患者)兩種人群的臨床診斷結果,聯(lián)合rCM-WBIA檢查技術,可以排除BCG免疫對 兩種人群的影響。采集M. tb感染人群和未感染人群的外周全血,通過WBIA試驗檢測和比 較M. tb不同階段性抗原刺激兩種人群外周血后產生的IFN-γ水平。本發(fā)明中篩選出M. tb 感染機體后在不同階段表達的特異性靶抗原,包括有快速增殖期分泌抗原Ag85B(fbpB)和 潛伏感染階段相關基因 Rvl813, Rv2660c,Rv2623和HspX,均能誘導感染人群產生高水平的 IFN- γ,均能被中國M. tb感染人群的T細胞所識別,是可靶向預防中國M. tb感染人群的有 效候選抗原。
[0031] 在本發(fā)明中,我們以篩選出的這些抗原為基礎,通過人工設計方法構建了表達上 述抗原的融合蛋白A1D4,并經全血干擾素釋放分析技術證實了中國M. tb感染人群的T細胞 能夠識別該融合蛋白,其外周血產生A1D4特異性的IFN-γ水平,顯著高于未感染人群,預 示了該融合蛋白具有靶向預防M. tb感染的能力。
[0032] 以下為實施例:
[0033] 實施例1融合基因 A1D4序列及其原核表達引物的設計與合成
[0034] 依據(jù) M. tb H37Rv 的全基因序列,選取出 Rvl813, Rv2660c, Ag85B, Rv2623 和 HspX 的編碼序列。以Signalp軟件預測及UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索搜索序列是否帶有信號肽,再 以DNAMN軟件對其進行酶切位點分析和氨基酸序列分析。在拼接5個單獨目的基因時需 遵循以下原則:1)若有信號肽的要去除信號肽,包括原來的起始密碼子,同時去除終止密 碼子(拼接完畢的最后一個基因序列后而加 TAA) ;2)無信號肽的基因序列則保留起始密碼 子序列。若起始密碼子為GTG的,因其原始表達產物為Met而非Val,應將GTG作為非起始 碼時必須也表達為Met,故需將GTG校正為ATG。該融合蛋白基因拼接順序為:Rvl813-Rv2 660c-Ag85B-Rv2623_HspX,由上海Invitrogen公司合成后亞克隆至pDC316載體質粒(命 名為PDC316-A1D4),經測序比對無誤。
[0035] 測序結果見序列表SEQ ID No. 2,其氨基酸序列件序列表SEQ ID No. 1。
[0036] 實施例2融合蛋白A1D4原核表達載體的構建及蛋白純化
[0037] 1、目的基因猶取:
[0038] (1)引物設計:根據(jù)融合基因的全序列及原核表達載體pET30b(+)上的多克隆 位點設計引物,引物序列由上海英駿生物公司合成,并按照說明將引物稀釋成IOOpmol/ μ 1,-20°C保存?zhèn)溆?。下述引物序列中的下劃線表示酶識別位點。
[0039] A1D4-Fwd :
[0040] (Nde I)-TTCCATATGCATCTCGCCAACGGTTCGATGTCGG
[0041] A1D4-Rev :
[0042] (Xho I)-ATCTCGAGGTTGGTGGACCGGATCTGAATGTGC
[0043] (2) PCR 反應體系:
【權利要求】
1. 一種結核病亞單位疫苗,其特征在于,含有融合蛋白A1D4,其濃度為0. lmg/ml至 lmg/ml,所述融合蛋白A1D4其編碼基因為Rvl813、Rv2660c、Ag85B、Rv2623以及HspX基因 按照 Rvl813-Rv2660c-Ag85B-Rv2623-HspX 的順序串聯(lián)。
2. 如權利要求1所述的結核病亞單位疫苗,其特征在于,所述融合蛋白A1D4的序列 為: (1) 由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;或 (2) 與序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能蛋白 質的氨基酸序列;或 (3) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸具有同等活 性的由(1)衍生的蛋白。
3. 如權利要求1或2所述的結核病亞單位疫苗,其特征在于,還含有0. 2mg/ml至 0· 3mg/ml的單磷酰脂質A、0. 2mg/ml至0· 3mg/ml的海藻糖、體積分數(shù)1%至4%的角S烯 油、體積分數(shù)1%至4%的司盤85以及體積分數(shù)0. 1%至0.4%的吐溫-80,為油包水樣溶 液。
4. 如權利要求3所述的結核病亞單位疫苗,其特征在于,所述海藻糖為6, 6' -二分枝 菌酸。
【文檔編號】A61K39/04GK104225586SQ201410420806
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權日:2014年8月25日
【發(fā)明者】范雄林, 王曉春 申請人:華中科技大學