一種用于修復(fù)脊髓損傷的類脊髓樣組織的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的類脊髓樣組織的構(gòu)建方法,尤其是一種周圍含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和中央含有類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的類脊髓樣組織構(gòu)建方法。應(yīng)用時將含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)干細(xì)胞源性少突膠質(zhì)細(xì)胞和類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)干細(xì)胞源性神經(jīng)元構(gòu)建的類脊髓樣組織移植到橫斷性脊髓損傷處,按照類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)對應(yīng)宿主白質(zhì)、類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)對應(yīng)宿主灰質(zhì)的配對方式整合到宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中,更好地促進(jìn)受損傷脊髓再生和功能修復(fù)。
【專利說明】一種用于修復(fù)脊髓損傷的類脊髓樣組織的構(gòu)建
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的類脊髓樣組織的構(gòu)建,尤其是一種周圍含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和中央含有類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的類脊髓樣組織構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在脊髓損傷修復(fù)的研究領(lǐng)域,聯(lián)合利用干細(xì)胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子和生物材料已經(jīng)展示了令人鼓舞的成果。然而,目前的聯(lián)合治療策略或單一地強(qiáng)調(diào)替代神經(jīng)元的作用,或單一的強(qiáng)調(diào)移植的成髓鞘細(xì)胞的修復(fù)作用。這些對于脊髓損傷的功能修復(fù)而言都是不夠的。我們的前期研究基于脊髓損傷后大量丟失的神經(jīng)元和成髓鞘細(xì)胞。應(yīng)用過表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (neurotrophin-3, NT-3)的施萬細(xì)胞(Schwann cells, SCs)和過表達(dá) NT-3 受體TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)在三維明膠海綿支架中構(gòu)建了有大量的可替代神經(jīng)元,具有良好的突觸形成潛能的,和有大量的成髓鞘細(xì)胞,具有良好的成髓鞘潛能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。該干細(xì)胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)移植到大鼠脊髓全橫斷損傷處,不但能夠提供豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)宿主神經(jīng)再生,移植的干細(xì)胞源性神經(jīng)元還能與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)良好地整合。成髓鞘細(xì)胞不僅能在體外包繞神經(jīng)突起形成髓鞘,在體內(nèi)也能形成大量髓鞘包繞移植神經(jīng)元和宿主神經(jīng)元的軸突,通過良好的成髓鞘潛能更進(jìn)一步修復(fù)脊髓損傷[Lai BQ, et al.The integrat1n of NSC-derived and host neural networks afterrat spinal cord transect1n.B1materials, 2013, 34:2888 ;Lai BQ, et al.Graft ofatissue engineered neural scaffold serves as a promising strategy to restoremyelinat1n after rat spinal cord transect1n.Stem Cells Dev,2014,23:910]。
[0003]脊髓損傷后,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)能夠作為少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)因子,促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活和形成髓鞘。有研究表明,CNTF可以促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)的存活、分化、成熟,并在再生的軸突上形成髓鞘結(jié)構(gòu)[Mayer M, et al.Ciliary neurotrophic factor andleukemia inhibitory factor promote the generat1n, maturat1n and survival ofoligodendrocytes in vitr0.Development, 1994,120:143]。
[0004]然而,目前我們?nèi)悦媾R著脊髓損傷修復(fù)還沒有解決好的關(guān)鍵科學(xué)問題:即前期構(gòu)建的干細(xì)胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中,神經(jīng)元和髓鞘形成細(xì)胞的分布是隨意和無序的,這有可能導(dǎo)致再生的神經(jīng)纖維不能快速、準(zhǔn)確地與移植的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合,或髓鞘形成細(xì)胞不能更有效地包繞需要髓鞘化的神經(jīng)元軸突。為此,我們設(shè)想:模擬正常脊髓組織結(jié)構(gòu)一灰質(zhì)在內(nèi)、白質(zhì)在外,在體外構(gòu)建一種類脊髓樣組織。擬將這種類脊髓樣組織移植入脊髓全橫斷損傷處,按照白質(zhì)對應(yīng)白質(zhì)、灰質(zhì)對應(yīng)灰質(zhì)的配對方式整合到宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中,更好地修復(fù)脊髓結(jié)構(gòu)和功能。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]目前,在國內(nèi)、外尚未見有文獻(xiàn)資料報道用于修復(fù)脊髓損傷的類脊髓樣組織的構(gòu)建,尤其是一種周圍含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和中央含有類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的類脊髓樣組織構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上治療脊髓損傷所用的方法上的不足,應(yīng)用我們自行構(gòu)建的類脊髓樣組織治療脊髓創(chuàng)傷性疾病,更好地促進(jìn)受損傷脊髓再生和功能修復(fù)。
[0006]本發(fā)明的基本方案包括:這種類脊髓樣組織是以圓柱體的多孔隙明膠為主體支架,分別由周圍和中央兩部分的明膠結(jié)構(gòu)裝配而成。周圍部分的明膠結(jié)構(gòu)是一種圓環(huán)狀的支架(圓環(huán)外直徑為3_、圓環(huán)壁厚度為0.5mm>圓環(huán)高度為2mm),用來種植睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)基因修飾的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs);中央部分的明膠結(jié)構(gòu)是一種圓柱體的支架(圓柱體直徑為2mm、高度為2mm),用于種植神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (NT-3)基因及其受體TrkC基因修飾的的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)。應(yīng)用時,將其移植到成年大鼠脊髓全橫斷損傷處。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點顯著:本研究選擇構(gòu)建一種含有睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(CNTF-OPCs)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因修飾的的神經(jīng)干細(xì)胞(NT-3-NSCs)和NT-3受體TrkC基因修飾的的神經(jīng)干細(xì)胞(TrkC-NSCs)的類脊髓樣組織,用來促進(jìn)受損傷的中樞神經(jīng)元軸突再生,對危害人民健康較大的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病如脊髓損傷等進(jìn)行防治基礎(chǔ)性研究,將會有力地推動整個創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治研究領(lǐng)域的發(fā)展。這對延長人類壽命,提高傷病者生存質(zhì)量,減輕社會和家庭負(fù)擔(dān),促進(jìn)我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重要意義。本發(fā)明將使我國的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治水平居于國際領(lǐng)先水平。
【具體實施方式】
[0008]下面通過具體實施例對本發(fā)明所用的主要儀器、可降解生物材料、可降解高分子材料、實驗細(xì)胞和試劑作詳盡的描述:
[0009]1.主要儀器
[0010]超凈工作臺(蘇州凈化電子設(shè)備廠);普通離心機(jī)(久保田日本);恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠);5% CO2培養(yǎng)箱(Queue美國);倒置相差顯微鏡(Olympus日本);熒光顯微鏡(Leica德國);掃描電鏡(Philips荷蘭);透射電鏡(Philips荷蘭);激光共聚焦成像系統(tǒng)(Carl Zeiss德國);低溫烤箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);高溫烤箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);高壓消毒鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠);恒冷箱切片機(jī)(Shandon英國);超純水儀(Molsheim法國);酶聯(lián)免疫檢測儀(B1-Rad美國);電泳儀電源(B1-Rad美國);垂直板電泳槽(B1-Rad美國);電轉(zhuǎn)儀(B1-Rad美國);超高速低溫離心機(jī)(Beckman美國);-80°C超低溫冰箱(Revco Tech美國);JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);EPC-10膜片鉗信號放大器(Heka德國);玻璃微電極(Sutter美國);微電極拉制儀(Sutter美國)。
[0011]2.可降解生物材料
[0012]制備類脊髓樣組織的多孔隙明膠圓柱體支架材料是購自于南京金陵藥業(yè)股份有限公司的產(chǎn)品一醫(yī)用明膠海綿。
[0013]3.可降解高分子材料
[0014]包繞在多孔隙明膠圓柱體支架周圍形成外殼薄壁的PLGA(50: 50)薄膜是購自于濟(jì)南is?生物科技公司的產(chǎn)品。
[0015]4.實驗細(xì)胞
[0016]由中山大學(xué)實驗動物中心提供SD大鼠,自行從其大腦海馬中分離、培養(yǎng)獲取神經(jīng)干細(xì)胞。
[0017]5.主要試劑
[0018]DMEM-LG(Gibico),優(yōu)級胎牛血清(TBD),多聚賴氨酸(Sigma),D-Hank’ s 平衡液(自配),膜蛋白酶(Sigma), EDTA(Sangon),0.01mol/l PBS(中杉金橋),MTT(Ameresco 公司),二甲基亞諷(DMSO) (Sangon), Hoechst33342 (Sigma), DAPI (Sigma),山羊血清(中杉金橋),小鼠抗BrdU單克隆抗體(Sigma),Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG (Jackson Immuno Research),calcein-AM/EthD-1II Live/Dead kit (B1tium),兔抗 NT-3 多克隆抗體(Santa Cruz),鼠抗人TrkC單克隆抗體(RD),小鼠抗大鼠Nestin抗體(Sigma),兔抗大鼠PSD95多克隆抗體(Abcam),兔抗大鼠GFP多克隆抗體(Millipore),兔抗大鼠NF單克隆抗體(Sigma),小鼠抗大鼠NF單克隆抗體(Sigma),兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(Sigma),小鼠抗大鼠synaptophysin(Sigma),小鼠抗大鼠MBP單克隆抗體(Millipore),兔抗大鼠ChAT多克隆抗體(Millipore),兔抗大鼠GABA多克隆抗體(Boster),兔抗大鼠glutamine多克隆抗體(Boster),山羊抗小鼠 FITC (Jackson Immunological Research), Cy3 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch) Cy3 標(biāo)記羊抗兔 IgG (Jackson ImmunoResearch),Dylight405 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch), AMCA 標(biāo)記羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch),山羊抗兔 HRP (Jackson ImmunoResearch),蛋白定量檢測試劑盒(鼎國),細(xì)胞裂解液(Boster),蛋白酶抑制劑cocktail (Sigma) ,ECL發(fā)光底物檢測試劑盒(康為世紀(jì)),Epon-812(Ted Pella),考馬斯亮藍(lán)(B1-rad),30%聚丙烯酰胺溶液(康為世紀(jì)),X感光膠片(Kodak)。
[0019]本發(fā)明詳細(xì)的具體操作技術(shù)說明如下:
[0020]1.大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的體外分離培養(yǎng)及鑒定
[0021]選用出生3?5天的SD乳鼠,在無菌條件下斷頭取腦,將腦置于冷的D-Hank’s液中,解剖顯微鏡下用器械分離出海馬。采用機(jī)械吹打法培養(yǎng)NSCs:先用眼科剪將海馬組織剪碎,再連同D-Hank’ s液移入離心管中用細(xì)頭玻璃吸管輕輕吹打數(shù)次,直至肉眼見不到明顯的組織塊,吹打時應(yīng)慢速并用力適度,避免產(chǎn)生氣泡,以100rpm離心5min,去上清,重復(fù)操作一次,用NSCs培養(yǎng)液重新吹打懸浮細(xì)胞沉淀,計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度約為lX105/mldf此細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶,于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。當(dāng)觀察到大量的細(xì)胞克隆球開始形成時,隔天用細(xì)頭玻璃吸管機(jī)械吹打分離NSCs克隆球進(jìn)行傳代。傳代2周后,取第2代的NSCs漂浮法進(jìn)行nestin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定。
[0022]2.NSCs定向誘導(dǎo)為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)
[0023]取第2代培養(yǎng)的NSCs,輕輕吹打分散神經(jīng)球后以5X 15個細(xì)胞/ml密度接種于多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶,在原有神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入30ng/ml的三碘甲狀腺氨酸(tri1dothyronine, T3) > 10ng/ml 的血小板衍生生長因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)及10%胎牛血清作為誘導(dǎo)培養(yǎng)液。待貼壁的細(xì)胞球大量遷出、并布滿培養(yǎng)瓶的底部時用胰酶消化法進(jìn)行傳代。傳2代后的OPCs用于后續(xù)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定或者基因修飾。
[0024]3.三種基因修飾細(xì)胞的制備
[0025]3.1NSCs和OPCs的腺病毒載體感染率的測定
[0026]用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infect1n,MOI)的AdLacZ(報告基因重組腺病毒載體)在無血清培養(yǎng)液中分別感染NSCs和0PCs3小時,棄病毒殘液,加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12?24小時,然后用光鏡觀察陽性染色細(xì)胞的百分比(感染率),確定一個感染率在90%以上的病毒劑量。
[0027]3.2TrkC基因或NT-3基因修飾NSCs的制備
[0028]用一定劑量(按測定感染率的)AdTrkC或AdNT_3在無血清培養(yǎng)液中感染NSCs3小時,棄病毒殘液,加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。取少量細(xì)胞用于免疫組織化學(xué)鑒定TrkC基因或NT-3基因修飾NSCs的比例,用Western blot方法測定TrkC基因修飾NSCs中TrkC的表達(dá)量,用ELISA方法測定NT-3基因修飾NSCs培養(yǎng)液上清中NT-3的含量,并檢測其生物活性。
[0029]3.3睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)基因修飾OPCs的制備
[0030]方法基本同上(用ELISA方法測定CNTF基因修飾OPCs培養(yǎng)液上清中CNTF的含量,并檢測其生物活性)。
[0031]4.多孔隙明膠圓柱體支架的構(gòu)建
[0032]所述的多孔隙明膠圓柱體支架主體可分為兩部分:周圍部分的明膠結(jié)構(gòu)是一種圓環(huán)狀的支架(圓環(huán)外直徑為3mm、圓環(huán)壁厚度為0.5mm、圓環(huán)高度為2mm),中央部分的明膠結(jié)構(gòu)是一種圓柱體的支架(圓柱體直徑為2_、高度為2mm)。這些支架材料是購自于南京金陵藥業(yè)股份有限公司無菌醫(yī)用明膠海綿,在超凈工作臺中將其剪裁制備成上述的形貌的周圍和中央兩部分的明膠結(jié)構(gòu)。
[0033]PLGA外殼薄壁是包繞多孔隙明膠圓柱體支架的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(polyD, L-1actic-co-glycolic acid,PLGA),其由可降解的高分子材料PLGA (聚乳酸與聚輕基乙酸比值為50: 50,分子量為100000)構(gòu)成,厚度為0.02毫米。材料的構(gòu)建方法如下:取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中,配成5 %溶液,待PLGA完全溶解后,澆注與已調(diào)水平的聚四氟模具中,室溫(控制溫度在20°C ),揮發(fā)24小時,第二天小心揭下薄膜,反置于模具中24小時,剪裁到適宜大小后干燥保存。將薄膜包繞在直徑為3.5毫米的不銹鋼圓柱磨具上一圈,邊緣用丙酮粘貼,形成直徑為3.5毫米的圓筒狀PLGA外殼。使用時將PLGA外殼剪成2毫米長度,酒精浸泡15分鐘,隨后用無菌D-Hank’s清洗三次,每次10分鐘。將消毒好的PLGA外殼薄壁置干無菌干燥處保存待用。使用PLGA外殼薄壁的目的是,增加多孔隙明膠圓柱體支架的柔韌性。
[0034]上述構(gòu)建的周圍部分的明膠結(jié)構(gòu)用于種植CNTF基因修飾的OPCs,將形成類似脊髓白質(zhì)結(jié)構(gòu);中央部分的明膠結(jié)構(gòu)用于種植NT-3基因和TrkC基因修飾的NSCs,將形成類似脊髓灰質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0035]5.類脊髓樣組織的體外培養(yǎng)
[0036]5.1類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)(附圖)
[0037]將包繞PLGA外殼的周圍部分明膠結(jié)構(gòu)固定在培養(yǎng)皿內(nèi),將CNTF基因修飾的OPCs按照2.5X 15的細(xì)胞總量,緩慢懸滴到該結(jié)構(gòu)的兩端,加入常規(guī)培養(yǎng)液,于37°C、5% CO2在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0038]5.2類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)(附圖)
[0039]將中央部分的明膠結(jié)構(gòu)固定在培養(yǎng)皿內(nèi),將NT-3基因和TrkC基因分別修飾的NSCs,細(xì)胞總量為7.5X105,按照1:1的比例,緩慢懸滴到該結(jié)構(gòu)的兩端,加入常規(guī)培養(yǎng)液,于37°C、5% C02。在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0040]5.3類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的共培養(yǎng)(附圖)
[0041]將培養(yǎng)構(gòu)建的類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)安置入培養(yǎng)構(gòu)建的類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的圓環(huán)內(nèi),加入常規(guī)培養(yǎng)液,于37°C、5% CO2在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0042]6.類脊髓樣組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的檢測
[0043]用免疫細(xì)胞化學(xué)、共聚焦熒光顯微鏡和免疫電鏡等技術(shù)觀察類脊髓樣組織內(nèi)NSCs分化的神經(jīng)元之間建立突觸聯(lián)系以及合成神經(jīng)遞質(zhì)情況,驗證其是否形成以神經(jīng)元為主的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),以及驗證該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是否有突觸形成潛能。同時觀察類脊髓樣組織的類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)OPCs干細(xì)胞源性少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘包繞。附圖是用具有良好的生物相容性的多孔隙明膠構(gòu)建類脊髓樣組織。A:類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)(多孔隙明膠),圓環(huán)直徑為3mm、厚度為0.5mm、高度為2mm,用來種植CNTF基因修飾的OPCs (CNTF-OPCs) ;B:類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)(多孔隙明膠),圓柱體直徑為2mm、高度為2mm,用于種植NT-3基因和TrkC基因修飾的NSCs (NT-3-NSCs和TrkC-NSCs) ;C:將類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)安置入培養(yǎng)構(gòu)建的類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的圓環(huán)內(nèi),構(gòu)建成類脊髓樣組織;D:將類脊髓樣組織置于37°C、5% CO2在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)共同構(gòu)建的類脊髓樣組織;其形貌特征是:類脊髓樣組織表面包裹著由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(POlyD, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜構(gòu)成的薄壁,類脊髓樣組織中央是類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu),PLGA薄壁與類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)之間是類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建的類脊髓樣組織;其形貌特征是:所述的類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)是生長著由睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有類白質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建的類脊髓樣組織;其形貌特征是:所述的類灰質(zhì)樣結(jié)構(gòu)是生長著由神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因修飾的的神經(jīng)干細(xì)胞(NT-3-NSCs)和NT-3受體TrkC基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元。
【文檔編號】A61L27/38GK104353113SQ201410436596
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】曾園山, 賴碧琴 申請人:中山大學(xué)