一種魚肉抗氧化活性肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于水產(chǎn)食品加工領(lǐng)域的一種魚肉抗氧化活性肽，其氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met。該肽可以人工合成，也可以魚肉為原料制備。其制備包括將魚肉制成魚肉漿液，然后用堿性蛋白酶進行酶解，離心，取上清液；利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對上清液超濾，Sephadex?G-25凝膠分離，收集第2個洗脫峰；再用高效液相色譜純化；最后濃縮、冷凍干燥。本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽的抗氧化功能好，其清除DPPH自由基能力可達90％以上；其次，本發(fā)明是以天然產(chǎn)物為原料、經(jīng)過食品級堿性蛋白酶酶解獲得的產(chǎn)物，安全，無毒，本發(fā)明制備方法簡單，有效地解決了目前抗氧化多肽難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的問題。
【專利說明】一種魚肉抗氧化活性肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)食品加工領(lǐng)域，具體涉及一種以魚肉為原料生產(chǎn)的魚肉抗氧化活性肽，以及該魚肉抗氧化活性肽的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)經(jīng)過水解得到多肽，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被改變，疏水區(qū)的活性官能基團暴露，隨著肽鍵的裂解，游離氨基酸增加，從而可以提供質(zhì)子或電子源，保持較高的氧化還原電位，使其具有清除活性自由基的能力，清除過氧化亞硝酸鹽能力和抑制脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，從而抗氧化肽的抗氧化活性得以提高。氧化對需氧生物特別是脊椎動物和人類是一個重要的代謝過程，但是它卻導(dǎo)致了自由基的形成?；钚匝踝杂苫?ROS)被認為能引起氧化應(yīng)激。在食品體系中，脂類或蛋白質(zhì)可能會受到ROS的攻擊經(jīng)歷氧化過程，從而導(dǎo)致食品產(chǎn)生不愉快味道，顏色發(fā)暗或不良質(zhì)地，同時也可能產(chǎn)生潛在的毒性終產(chǎn)物?？寡趸嚯牡膽?yīng)用能防止食品成分由于捐獻電子給活性氧自由基以及中和活性氧自由基的負面作用而變質(zhì)?？寡趸脑卺t(yī)學、化妝品、生物、食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值。
[0003]有關(guān)抗氧化肽的國內(nèi)外專利情況，國外專利方面:如(I)歐洲專利EP1188767 Al公開了一種來源于酪蛋白的抗氧化肽；(2)美國專利US8232243B2公開了含有色氨酸和酪氨酸的肽作為抗氧化的方法，這種抗氧化劑可以用于治療和預(yù)防氧化過程帶來的疾病和綜合癥。國內(nèi)方面:已有從酪蛋白、蛙類、馬面飩魚頭蛋白等中提取制備抗氧化肽的相關(guān)專利。如(I)專利CN103275180 A公開了一種馬面飩魚頭蛋白抗氧化肽，該抗氧化肽的氨基酸序列為 Leu-Ser-His-G ly-Pro-Tyr(LSHGPY) ； (2)專利 CN 103103242 A 公開了一種以藍圓鰺魚肉蛋白為原料制備的抗氧化活性肽，其氨基酸序列分別為His-Asp-Hi s-P1-Val-Cys (組氨酸_天冬氨酸_組氨酸_脯氨酸_纟顏氨酸_半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys (組氨酸-谷氨酸-賴氨酸-纈氨酸-半胱氨酸)；(3)專利CN103431158A公開了一種鴨肉蛋白源抗氧化肽。
[0004]經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)以魚肉為原料，利用堿性蛋白酶制備氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met的抗氧化肽的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種以魚肉為原料制備的魚肉抗氧化活性肽，該抗氧化活性肽具有較好的清除自由基作用。
[0006]本發(fā)明另一目的在于提供上述魚肉抗氧化活性肽的制備方法。
[0007]本發(fā)明第三目的在于提供上述魚肉抗氧化活性肽的用途。
[0008]實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]本發(fā)明一種魚肉抗氧化活性肽，其所述的魚肉抗氧化活性肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met(SEQ ID No: I) ?
[0010]上述魚肉抗氧化活性肽，所述的魚肉抗氧化活性肽的分子量為679Da。
[0011]上述魚肉抗氧化活性肽可以人工合成，也可以魚肉為原料利用堿性蛋白酶制備。
[0012]上述魚肉抗氧化活性肽，按照如下方法制備:
[0013](I)、洗凈魚肉，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入1.0~
3.0倍魚肉重量的水，在80~90°C下保持15~20min，再用分散均質(zhì)機在10000~13000rpm下勻衆(zhòng)I~3min,得魚肉衆(zhòng)液；
[0014](2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟⑴所得的魚肉漿液的pH為7.0~8.0，并調(diào)節(jié)魚肉漿液的溫度為50~60°C;然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:50~200的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保溫3~5min,冷卻至室溫；接著在4000~6000g下離心10~15min,收集上清液；
[0015](3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離,洗脫液為去離子水,流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是以5~90%乙腈溶液(體積比)作為洗脫液，流速為I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；
[0016](4)、將步驟(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
[0017]上述魚肉抗氧化活性肽中所述的魚是指鰱魚、草魚或鱈魚等。
[0018]上述魚肉抗氧化活性肽步驟(2)中所述的堿性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
[0019]上述制備方法步驟(3)中所述的裝Sephadex G-25柱的規(guī)格為長100cm,直徑
2.6cm。
[0020]上述魚肉抗氧化活性肽步驟(3)中所述的5~90%乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液為5 % (體積比)，5~40min乙腈溶液從5 %到40 % (體積比)，40~50min乙腈溶液從40%到90% (體積比)。
[0021]上述魚肉抗氧化活性肽步驟(4)中所述的魚肉抗氧化活性肽中氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met (NWDDM)的肽的含量大于 80%。
[0022]上述魚肉抗氧化活性肽的制備方法，包括如下步驟:
[0023](I)、洗凈魚肉，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入1.0~
3.0倍魚肉重量的水，在80~90°C下水浴15~20min，再用分散均質(zhì)機在10000~13000rpm下勻衆(zhòng)I~3min,得魚肉衆(zhòng)液；
[0024](2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟⑴所得的魚肉漿液的pH為7.0~8.0，并調(diào)節(jié)魚肉漿液的溫度為50~60°C;然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:50~200的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保溫3~5min,冷卻至室溫；接著在4000~6000g下離心10~15min,收集上清液；
[0025](3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離,洗脫液為去離子水,流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是以5~90%乙腈溶液(體積比)作為洗脫液，流速為I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；
[0026](4)、將步驟(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
[0027]上述制備方法中所述的魚是指鰱魚、草魚或鱈魚等。
[0028]上述制備方法步驟⑵中所述的堿性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
[0029]上述制備方法步驟(3)中所述的裝S印hadex G-25柱的規(guī)格為長100cm，直徑
2.6cm。
[0030]上述制備方法步驟(3)中所述的5~90%乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液為5%(體積比)，5~40min乙腈溶液從5 %到40 % (體積比)，40~50min乙腈溶液從40 %到90% (體積比)。
[0031]上述魚肉抗氧化活性肽作為添加劑在食品或化妝品上的應(yīng)用。
[0032]本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果:(I)、本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽(Asn-Trp-Asp-Asp-Met)具有很好的抗氧化功能,其清除DPPH自由基能力可達90%以上；
(2)、本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽是以天然產(chǎn)物為原料、經(jīng)過食品級堿性蛋白酶酶解獲得的產(chǎn)物，將其作為食品、化妝品等添加劑安全，無毒；(3)、本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽制備方法簡單，易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，有效地解決了目前抗氧化多肽難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的問題。(4)、本發(fā)明開發(fā)的抗氧化肽，能廣泛應(yīng)用于功能食品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1本發(fā)明鰱魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物超濾后組分SPP-1V (分子量=3000)的Sephadex G_25凝膠過濾層析圖譜；其中組分I是指分子量相對較大的肽，組分2是指分子量相對較小的肽。

【具體實施方式】
[0034] 實施例1鰱魚魚肉抗氧化活性肽的制備
[0035]按照如下方法進行:
[0036](I)、將鰱魚魚肉100克洗凈，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入2.0倍魚肉重量的水200克，在90°C中水浴20min，再用分散均質(zhì)機在12000rpm下勻漿2min，得到魚肉漿液300克。
[0037](2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟⑴魚肉漿液的pH為8.0，溫度調(diào)節(jié)為50°C，然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:100的比例加入堿性蛋白酶Alcalase
2.4L(Novozymes) I克，在50°C下酶解2小時，然后在95°C下保溫3min，冷卻至室溫；再在5000g條件下離心15min,收集上清液。
[0038](3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液，再經(jīng)過S印hadex G-25 (長100cm，直徑2.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行測量，收集第2個洗脫峰(見圖1);再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是以5~90%乙腈溶液(體積比)作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的抗氧化活性肽溶液；
[0039](4)、將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
[0040]通過LC-MS/MS對所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進行測定，該魚肉抗氧化活性肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量為679Da，該肽的含量為81 %。
[0041]實施例2鰱魚魚肉抗氧化活性肽的制備
[0042]按照如下方法進行:
[0043](I)、將鰱魚魚肉300克洗凈，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入2.0倍魚肉重量的水600克，在85°C中水浴20min，再用分散均質(zhì)機在12000rpm下勻漿2min，得到魚肉漿液900克。
[0044](2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟(1)魚肉漿液的pH為7.0，溫度調(diào)節(jié)為55°C，然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:150加入堿性蛋白酶Alcalase 2.4L 2克，在55°C下酶解I小時，然后在95°C下保溫4min，冷卻至室溫；再在5000g條件下離心15min，
收集上清液。
[0045](3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過S印hadex G-25 (長100cm，直徑2.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高校液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是為5~90%乙腈溶液(體積比)作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的抗氧化活性肽溶液；
[0046](4)將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得魚肉抗氧化活性肽。
[0047]通過LC-MS/MS 對所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進行測定，該魚肉抗氧化活性肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量為679Da，該肽的含量為80.6%。
[0048]實施例3鰱魚魚肉抗氧化活性肽的制備
[0049]按照如下方法進行:
[0050](I)、將魚肉1000克洗凈，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入2.0倍魚肉重量的水2000克，在90°C中水浴15min，用分散均質(zhì)機在12000rpm勻漿2min，得到魚肉漿液3000克。
[0051](2)、用lmol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟(1)魚肉漿液的pH為8.0，溫度調(diào)節(jié)為57°C，然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:200加入堿性蛋白酶Alcalase 2.4L 5克，在57°C下酶解2小時，然后在95°C下保溫5min，冷卻至室溫；再在5000g條件下離心15min，收集上清液。
[0052](3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過S印hadex G-25 (長100cm，直徑2.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行測量，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高校液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是為5~90%乙腈溶液(體積比)作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的抗氧化活性肽溶液。
[0053](4)將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
[0054]通過LC-MS/MS對所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進行測定，該魚肉抗氧化活性肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量為679Da，該肽的含量為80.9%,0
[0055]實施例4本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的測定試驗
[0056]試驗樣品:實施例1、實施例2、實施例3制備的魚肉抗氧化活性肽；
[0057]人工合成肽Asn-Trp-Asp-Asp-Met (委托GenScript生物公司合成)
[0058]試驗方法:
[0059](I).清除DPPH自由基能力測定:取20μ g/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5%乙醇1.5mL和0.02% DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強?？瞻讓φ占词菍悠啡芤?.5mL換成去離子水1.5mL。
[0060]DPPH自由基清除能力％=((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)X100
[0061](2).還原力測定:取20μ g/mL的抗氧化活性肽lmL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH6.6)2.5mL和I % (質(zhì)量分數(shù))的鐵氰化鉀溶液2.5mL,混勻，然后在50°C水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10% (質(zhì)量分數(shù))三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL,加入去離子水2.5mL和1% (質(zhì)量分數(shù))三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應(yīng)lOmin，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。
[0062](3).氧化自由基吸收能力(ORAC)測定:不同濃度的抗氧化活性肽溶液20 μ L與75mM磷酸鹽緩沖液80 yL(pH7.4)及200nM的熒光試劑50 μ L充分混合，然后在37°C溫育15min,再加入80mM的AAPH溶液50 μ L。用酶標儀每分鐘讀取熒光值共進行l(wèi)OOmin。熒光的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。以Trolox作為標準對照，使用的濃度為O，2，4，8，12，16 μ Μ,繪制熒光淬滅曲線，并計算熒光淬滅曲線下的積分面積(AUC)。AUC的計算公式如下:

【權(quán)利要求】
1.一種魚肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的魚肉抗氧化活性肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Asp-Met。
2.按照權(quán)利要求1所述的魚肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的魚肉抗氧化活性肽的分子量為679Da。
3.權(quán)利要求1所述的魚肉抗氧化活性肽，其特征在于按照如下方法制備: (1)、洗凈魚肉，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入1.0~3.0倍魚肉重量的水，在80~90°C下保持15~20min，再用分散均質(zhì)機在10000~13000rpm下勻漿I~3min，得魚肉漿液； (2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟⑴所得的魚肉漿液的pH為7.0~8.0,并調(diào)節(jié)魚肉漿液的溫度為50~60°C;然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:50~200的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h,再在95~100°C下保溫3~5min，冷卻至室溫；接著在4000~6000g下離心10~15min，收集上清液； (3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離,洗脫液為去離子水,流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是以5~90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液； (4)、將步驟(3)所得的含抗氧化活性肽的溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
4.按照權(quán)利要求3所述的魚肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的魚是指鰱魚、草魚或鱈魚。
5.按照權(quán)利要求3所述的魚肉抗氧化活性肽，其特征在于其步驟(2)中所述的堿性蛋白酶是指 Alcalase 2.4L。
6.按照權(quán)利要求3所述的魚肉抗氧化活性肽，其特征在于其步驟(3)中所述的5~90 %乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液為5 %，5~40min乙腈溶液從5 %到40 %，40~50min乙腈溶液從40%到90%。
7.權(quán)利要求1所述的魚肉抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、洗凈魚肉，用打漿機將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入1.0~3.0倍魚肉重量的水，在80~90°C下水浴15~20min，再用分散均質(zhì)機在10000~13000rpm下勻漿I~3min，得魚肉漿液； (2)、用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)步驟⑴所得的魚肉漿液的pH為7.0~8.0,并調(diào)節(jié)魚肉漿液的溫度為50~60°C;然后按照堿性蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1:50~200的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保溫3~5min，冷卻至室溫；接著在4000~6000g下離心10~15min，收集上清液； (3)、利用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜對步驟(2)所得的上清液進行超濾，收集濾液；再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離,洗脫液為去離子水,流速為0.8mL/min,洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行I次分離，反相HPLC的分離條件是以5~90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；(4)、將步驟(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
8.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的魚是指鰱魚、草魚或鱈魚。
9.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于其步驟(2)中所述的堿性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
10.權(quán)利要求1 所述的魚肉抗氧化活性肽作為添加劑在食品或化妝品上的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K8/64GK104177477SQ201410438939
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】羅永康, 徐萍, 王智, 劉鵬 申請人:濱州萬嘉生物科技有限公司