茜草科類型環(huán)肽制備方法及其用作為Hippo-YAP信號通路抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供茜草科類型環(huán)肽RA-V(1)用作為Hippo-YAP信號通路抑制劑，其制備方法及在制備治療與預(yù)防YAP異常激活的有關(guān)癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的茜草科類型環(huán)肽，由1個α-D-丙氨酸，1個α-L-丙氨酸，3個取代的N-甲基α-L-酪氨酸和一個其它類型的α-L-氨基酸經(jīng)肽鍵縮合而成，且6個氨基酸縮合成為十八元環(huán)，其中2個鄰位的酪氨酸之間的苯環(huán)經(jīng)氧橋連接形成一個十四元環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法可快速分離純化目標(biāo)化合物RA-V(1)，效率高，目的性強，分離步驟少，操作方便，可控性和重現(xiàn)性好，溶劑可以反復(fù)回收利用，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】茜草科類型環(huán)肽制備方法及其用作為Hi ppo-YAP信號通路 抑制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一系列茜草科類型環(huán)肽用作為Hippo-YAP 信號通路抑制劑，以其作為有效成分的藥物組合物，其制備方法及其在癌癥治療及預(yù)防中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] Hippo通路是近年來在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一條新的細胞信號通路，在器官大小調(diào)控、 癌癥發(fā)生、組織再生、以及干細胞的功能上發(fā)揮重要作用。Hippo通路高度保守，其核心由 四個蛋白組成，在果蠅中為Hippo (Hpo)，Salvador (Sav)，Wts和Mats ;哺乳動物中相應(yīng)的 為Mstl/2，Savl，Latsl/2和Mob。其中Wts是第一個被發(fā)現(xiàn)的Hippo通路成員，在果蠅的 遺傳篩選實驗中，發(fā)現(xiàn)wts基因突變可導(dǎo)致組織的過度生長。在四個核心成員的上游，存在 諸多蛋白對其進行調(diào)節(jié)，果蠅中最初發(fā)現(xiàn)的有Ex，Mer，Kibra等，而更上游受到Fat等的調(diào) 節(jié)。核心成員的下游，Hippo通路可負調(diào)節(jié)一個轉(zhuǎn)錄輔激活因子，果蠅中為Yki，哺乳動物中 為YAP/TAZ。YAP (Yes-associated protein)蛋白是Hippo通路的開關(guān)蛋白，在該通路中發(fā) 揮著重要作用。Yki (YAP/TAZ)作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子，在Hippo通路處于抑制狀態(tài)時，可以入 核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游基因的表達；而當(dāng)Hippo通路處于激活狀態(tài)時，Yki (YAP/TAZ) 被Wts (Latsl/2)磷酸化，滯留于胞質(zhì)中處于非活性狀態(tài)并最終泛素化降解，從而抑制其活 性。最初發(fā)現(xiàn)與Yki結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是Scalloped(Sd)，其后又發(fā)現(xiàn)Hth/Tsh，Mad等；哺乳 動物中與YAP/TAZ結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子為TEADs (與Sd同源），Smadl/2/3等。
[0003] yap是一個原癌基因，YAP蛋白作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子入核，激活下游基因表達后， 能夠促進細胞的增殖生長，抑制細胞的凋亡。其mRNA在許多腫瘤細胞內(nèi)均高表達。此外有 實驗表明YAP過表達可引起上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，而后者常與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；另外，YAP過表達 會使小鼠肝臟腫大并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
[0004] 綜上所述，Hippo-YAP信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。
[0005] TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控基因表達上被確認為是YAP和TAZ的重要伙伴。結(jié)締 組織生長因子（CTGF)是典型的YAP-TEAD直接調(diào)控的靶基因，它在YAP誘導(dǎo)的細胞增殖 和非錨定依賴生長中發(fā)揮重要作用。干擾YAP-TEAD的相互作用可以消除YAP依賴的基 因轉(zhuǎn)錄，并在很大程度上減少YAP誘導(dǎo)的細胞增殖、致癌基因轉(zhuǎn)化和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。解 析YAP-TEAD復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)YAP的N端結(jié)構(gòu)域包裹著TEAD的C端結(jié)構(gòu)域形成的 球狀結(jié)構(gòu)。特別是YAP從86到100位的殘基肽段通過將側(cè)鏈插入到TEAD形成的口袋里 而在YAP-TEAD的相互作用中發(fā)揮重要作用。這些殘基位點可能成為對YAP-TEAD相互作 用進行藥理學(xué)干擾的很好的靶位點。在此基礎(chǔ)上，Duojia Pan實驗室發(fā)現(xiàn)小分子化合物 vert印orfin可以通過干擾YAP和TEAD的相互作用，進而抑制肝腫大和腫瘤發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn) 具有重要的學(xué)術(shù)意義和很好的應(yīng)用前景，也為進一步開發(fā)以Hippo-YAP通路作為靶位點的 特異性小分子抗癌藥物帶來了希望。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中未見茜草科類型環(huán)肽作為Hippo-YAP信號通路抑制劑及用于治療相 關(guān)癌癥的報道。
[0007] 茜草科類型環(huán)肽在茜草科植物中的分離純化較為困難，最重要的原因是茜草屬植 物中富含蒽醌類色素，且環(huán)肽含量較低?，F(xiàn)有報道的分離方法多是對茜草屬植物中環(huán)肽類 成分進行系統(tǒng)分離，尚無對特定分子，尤其是針對具有顯著活性的RA-V(l)的快速分離純 化方法。近年從茜草屬植物中分離環(huán)肽類成分已公開發(fā)表如下方法：（1)茜草科茜草屬植 物小紅參的根用甲醇提取后，甲醇浸膏加水混懸后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取， 合并乙酸乙酯和正丁醇部分依次用正反相娃膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠柱層析，HPLC 等技術(shù)分離純化，得到系列環(huán)肽。參見：Fan，J.T.et al.Rubiyunnanins C_H，cytotoxic cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensis inhibiting nitric oxide production and NF-κ B activation. Bioorganic&medicinal Chemistry, 2010, 18, 8226-8234〇 其 缺點在于萃取對富集環(huán)肽類化合物作用不明顯，工作量大且效率低。（2)茜草科茜草屬 植物茜草的根用甲醇提取后，甲醇浸膏經(jīng)HP-20大孔樹脂、硅膠、活性炭、氨丙基鍵合硅 膠色譜柱層析得到環(huán)肽富集部分。此環(huán)肽富集部分用甲醇重結(jié)晶，再結(jié)合各種層析材 料包括HPLC對結(jié)晶或母液進行分離純化，得到一系列環(huán)肽。參見：Hitotsuyanagi, Y. et al. Isolation,structure determination, and synthesis of allo-RA-V and neo-RA-V, RA-series bicyclic peptides from Rubia cordifolia L.Chemistry-A European Journal2012, 18,2839 - 2846。其缺點在于活性炭對樣品的吸附性強，氨丙基鍵 合硅膠材料價格較貴，實驗室和工業(yè)上不常用，甲醇重結(jié)晶技術(shù)可控性和重現(xiàn)性不好。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一類茜草科類型環(huán)肽 化合物作為新型Hippo-YAP信號通路抑制劑；提供制備該類化合物的方法，該方法可快速 分離純化目標(biāo)化合物RA-V (1)，效率高，目的性強，分離步驟少，操作方便，可控性和重現(xiàn)性 好，溶劑可以反復(fù)回收利用，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)；本發(fā)明的目的還在于提供以茜草科 類型環(huán)肽化合物為有效成分的藥物組合物；以及其在制備治療YAP異常激活的相關(guān)癌癥的 藥物中的應(yīng)用。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0010] 以下述結(jié)構(gòu)式所示的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成 分的Hippo-YAP信號通路抑制劑，
[0011]

【權(quán)利要求】
1. 以下述結(jié)構(gòu)式所示的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分 的Hippo-YAP信號通路抑制劑，
2. 藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1中所述的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l) 或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
3. 用權(quán)利要求1中所述的茜草科植物中的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許 的鹽作為Hippo-YAP信號通路抑制劑。
4. 權(quán)利要求1中所述的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備 Hippo-YAP信號通路抑制劑中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1中所述的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備治療與 預(yù)防YAP異常激活的相關(guān)癌癥的藥物中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1中所述的茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)或其藥理學(xué)上容許的鹽，其特征在 于所述的藥理學(xué)上容許的鹽，是指茜草科類型環(huán)肽RA-V(l)與無機酸鹽酸、硝酸、硫酸、磷 酸或氫溴酸，或者有機酸馬來酸、富馬酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、甲磺酸、對-苯甲磺 酸、己二酸、棕櫚酸或單寧酸，堿金屬鋰、鈉或鉀，堿土金屬鈣或鎂，堿性氨基酸賴氨酸成的 鹽。
7. 如權(quán)利要求2中所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥 學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，稀釋劑、賦形劑水，填充劑淀粉或蔗糖；黏合劑纖維素衍生物、藻酸 鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑甘油；崩解劑瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉；吸收促進劑季 銨化合物；表面活性劑十六烷醇；吸附載體高嶺土或皂黏土；潤滑劑滑石粉、硬脂酸鈣、硬 脂酸鎂或聚乙二醇；進一步加入其它輔劑香味劑或甜味劑。
8. 制備權(quán)利要求1中所述的茜草科類型環(huán)肽化合物RA-V(l)的方法，取多花茜草 (Rubia wallichiana Decne.)的根及根莖，經(jīng)干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3-4次，時間 為2-4小時，提取液經(jīng)減壓濃縮得總浸膏；將總浸膏經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，用0%，50%， 100%的甲醇/水梯度洗脫，結(jié)合環(huán)肽TLC檢測方法取100%甲醇洗脫含有環(huán)肽RA-V(l)的 部分；以下的每一步驟都結(jié)合環(huán)肽TLC檢測方法來進行分離純化；含環(huán)肽RA-V(l)部位經(jīng) 硅膠柱層析，用3:1-1:1的石油醚/丙酮梯度洗脫，合并含RA-V (1)部位；該部位繼續(xù)經(jīng)硅 膠柱層析，用30:1-1:1的氯仿/甲醇梯度洗脫，即得到RA-V(l)。
【文檔編號】A61K38/12GK104193808SQ201410445323
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】譚寧華, 趙斌, 趙思蒙, 吉新彥, 曾廣智, 李佳 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所, 浙江大學(xué), 中國科學(xué)院上海藥物研究所