鏈球菌溶血素o的突變形式的制作方法
【專利摘要】無毒但仍保留誘導抗釀膿鏈球菌感染的能力的GAS25(鏈球菌溶血素O)可用于疫苗組合物以誘導抗釀膿鏈球菌感染。本發(fā)明具體涉及純化的突變型鏈球菌溶血素O(SLO)蛋白，其在氨基酸位置A248包含氨基酸改變，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO:1編號，且其中所述突變型SLO蛋白的溶血活性相比野生型SLO降低至少50％。
【專利說明】鏈球菌溶血素 O的突變形式
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT//IB2008/003725,國際申請日為2008年12 月18日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?00880126781. 1，名稱為"鏈球菌溶血素0的突變 形式"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2007年12月21日提交的US61/016193和2008年8月13日提交的 US61/088381的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用納入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及免疫學和疫苗學領(lǐng)域。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 鏈球菌溶血素0(SL0 ;GAS25)是人病原體釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GAS)的一種最重要的致病因子。由于它能激發(fā)人的早期且強烈的免疫應(yīng)答，因此通常用作 GAS感染的診斷標記物。
[0006] SLO屬于高同源性巰基激活的溶細胞素（TACY)家族，該家族通過與細胞膜上的膽 固醇相互作用、自發(fā)寡聚化以及形成穿孔發(fā)揮其溶細胞活性。此外，它們能夠結(jié)合人IgG的 Fc區(qū)從而直接激活經(jīng)典補體途徑，這可導致對宿主細胞的補體介導的直接攻擊。TACY也通 過誘導細胞因子和炎性介質(zhì)從而干擾宿主的防御和免疫細胞功能。
[0007] 一些TACY可被動或主動保護試驗動物。參見FEMS Lett. 182,197-205, 2000。然 而，這些毒素復(fù)雜的有害副作用模式將影響它們作為疫苗候選物的用途。也就是說，本領(lǐng)域 需要無毒的SLO蛋白。
[0008] 附圖簡述
[0009] 圖I. SLO的三維計算機模型。脯氨酸表示為空間填充。Pr〇427為白色。
[0010] 圖2.該圖顯示了用含有野生型SLO和SLO突變型P427L的大腸桿菌提取物進行 的溶血試驗的結(jié)果。
[0011] 圖3. SDS-聚丙烯酰胺凝膠的顯微照片，顯示了純化的SLO突變型P427L。
[0012] 圖4.該圖顯示了用純化的野生型SLO和SLO突變型P427L進行的溶血試驗的結(jié) 果。
[0013] 圖5.大腸桿菌裂解上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的顯微照片。泳道A，大腸桿菌 陰性對照；泳道B，rSL0野生型，無標簽；泳道C，rSL0 P427L，無標簽；和泳道D，純化的rSLO 野生型，無標簽（5mg)。
[0014] 圖6?該圖證明，在相同條件下，SLO突變型P427L的溶血能力比野生型SLO低1000 倍。
[0015] 圖7.該圖證明了膽固醇對野生型SLO和SLO突變型P427L溶血作用的影響。 [0016] 圖8.細胞提取物中所有無標簽蛋白的SDS-PAGE分析的顯微照片。圖8A， SLO野生型和P427L無標簽蛋白的表達；圖8B，SLO P427L+W535、P427L+C530G、和 P427L+C530G+W535F無標簽蛋白的表達。
[0017] 圖9.細胞提取物中所有帶His標簽的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析的顯微照片。
[0018] 圖10.純化的帶His標簽的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析的顯微照片。
[0019] 圖11.純化的無標簽蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析的顯微照片。圖11A， 泳道A，SLO野生型無標簽蛋白；泳道B，SLO P427L無標簽蛋白；分子量標記 (116-66. 2-45-35-25-18. 4-14. 4);黑色箭頭表示從突變型和野生型克隆純化的SLO蛋 白。圖11B，泳道A，SLO野生型無標簽蛋白（3iig);泳道B，SLO P427L-W535F無標簽蛋白 (3 U g);分子量標記（116-66. 2-45-35-25-18.4-14.4);黑色箭頭表示從突變型和野生型 克隆純化的SLO蛋白。
[0020] 圖12.純化的無標簽SLO野生型蛋白的SDS-PAGE分析的顯微照片。在還原和非 還原條件下分析野生型SLO不同純化批次的樣品。
[0021] 圖13.該圖顯示了帶His標簽的SLO突變體的溶血測試結(jié)果。
[0022] 圖14.該圖顯示了抗-SLO抗血清對SLO-誘導的溶血活性的抑制作用。
[0023] 圖15.該圖顯示了抗-SLO抗血清抑制SLO溶血作用的滴度。
[0024] 圖16?該圖顯示了 SLO溶血活性滴度。
[0025] 圖17.該圖顯示了野生型SL0、化學去毒的野生型SLO和SLO突變體（P427L; P427L+W535F)的溶血活性滴度。
[0026] 圖18.該圖顯示了野生型SLO和SLO突變體（P427L ;P427L+W535F)的溶血活性滴 度。
[0027] 圖19.該圖顯示了野生型SLO和化學去毒的野生型SLO的溶血活性滴度。
[0028] 圖20.該圖顯示了使SLO溶血活性（50ng/ml SL0)降低50 %所需的SLO突變體 P427L+W535F抗血清的稀釋度。
[0029] 圖21.該圖顯示了使SLO溶血活性（lOOng/ml SL0)降低50%所需的SLO突變體 P427L+W535F抗血清的稀釋度。
[0030] 圖22.滴定曲線，顯示了用100%溶血毒素濃度進行的溶血抑制試驗。
[0031] 圖 23. SLO 蛋白的比對。M1_SF370, SEQ ID N0:1 ;M12_2096, SEQ ID N0:2 ; M12_9429,SEQ ID NO:3 ；M1_5005, SEQ ID N0:4；M2,SEQ ID N0:5；M28,SEQ ID N0:6；M6,SEQ ID N0:7 ；M18, SEQ ID N0:8 ；M5, SEQ ID N0:9 ；M3, SEQ ID NO: 10 ；M3_SSI, SEQ ID NO: 11 ； 和 M4, SEQ ID NO:12。
[0032] 圖24.野生型SLO和帶Hi s標簽的SLO突變體的比對。SL0_M1株SF370 (SL0_ MlstrainSF370)，SEQ ID N0:13;SL0 野生型 _帶1^8 標簽（SL0 WT_histagged)，SEQ ID NO: 14 ;SL0 突變型? P427L_ 帶 his 標簽（SLOmut. P427L_histagged)，SEQ ID NO: 15 ;SL0 突 變型 乂5306_帶1^8 標簽（SL0mut.C530G_histagged)，SEQ ID N0:16;SL0 突變型? SA248_ 帶 his 標簽（SL0mut.DeltaA248_histagged)，SEQ ID N0:17 ;SL0 突變型.￥535?_帶1118 標 簽（SLOmut. W535F_histagged)，SEQ ID NO: 18 ;和 SLO 突變型? W535F&D482N_ 帶 his 標簽 (SL0mutff535F&D482N_histagged), SEQ ID NO:19.
[0033] 圖25.該圖比較了野生型SLO抗血清和SLO突變體P427L+W535F抗血清造成的 ALO溶血活性的降低。
[0034] 圖26.該圖顯示了采用明礬或MF59作為佐劑的重組SLO突變體P427L+W535F的 體內(nèi)保護特性。
[0035] 發(fā)明詳述
[0036] 本發(fā)明提供無毒但仍保留了誘導抵御釀膿鏈球菌保護能力的鏈球菌溶血素0的 突變體（SL0;GAS25)。SLO的突變形式可用于疫苗組合物中誘導抗釀膿鏈球菌的保護力。
[0037] 突變型SLO蛋白
[0038] 通過溶血試驗測得，本發(fā)明的SLO突變形式的溶血活性比野生型SLO低至少50% (例如低 50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99 或 100% )，但具有免疫原性，例如 能賦予小鼠模型抵御GAS致死性攻擊的保護力（例如見實施例7)。本發(fā)明的SLO突變體 包括 SLO 突變體 P427L(SEQ ID N0:20)，W535F(SEQ ID N0:21)，C530G(SEQ ID N0:22)， AA248(SEQ ID NO: 23), W535F+D482N(SEQ ID NO: 24), P427L+W535F (SEQ ID NO:25), ?4271+05306(5￡〇10勵:26)，和？4271+05306+1535卩(5￡〇10冊:27)。本發(fā)明還包括這些 突變體的帶His標簽的形式。例子顯示于圖24。
[0039] 本發(fā)明的SLO突變體包括在按照SEQ ID NO: 1所示野生型SLO序列編號的氨基酸 P427、W535、C530、A248和D482中的一處或多處具有氨基酸改變（即取代、缺失或插入）的 那些。圖23提供了不同M類型野生型GAS25序列的比對。
[0040] 本發(fā)明的SLO突變體包括在P427、W535、C530、A248和/或D482位置的一個、二 個或三個氨基酸改變（"單突變體"、"雙突變體"、"三突變體"）。因此，SLO突變體可包括 以下：
[0041] i.P427L(SEQ ID N0:20), P427R, P427N, P427C, P427Q, P427E, P427G, P427H, P427I，P427L，P427K，P427M，P427F，P427A，P427S，P427T，P427W，P427Y，或 P427V ;
[0042] ii.W535F(SEQ ID NO:21), W535R, W535N, W535D, W535C, W535Q, W535E, W535G, W535I, W535L, W535K, W535M, W535A, W535P, W535S, W535T, W535Y,或 W535V ;
[0043] iii. C530G(SEQ ID N0:22), C530R, C530N, C530D, C530S, C530Q, C530E, C530A, C530H，C530I，C530L，C530K，C530M，C530F，C530P，C530T，C530W，C530Y，或 C530V ;
[0044] iv.D482L,D482R,D482N,D482C,D482Q,D482E,D482G,D482H,D482I,D482L,D482K, D482M，D482F，D482A，D482S，D482T，D482W，D482Y，或 D482V ;
[0045] v. A248L, A248R, A248N, A248C, A248Q, A248E, A248G, A248H, A248I, A248L, A248K, A248M，A248F，A248S，A248T，A248W，A248Y，或 A248V ;
[0046] vi. AP427 ;或 AW535 ;或 AC530 ;或 AD482 ;或 AA248(SEQ ID N0:23);和
[0047] vii?它們的組合，如 W535F+D482N(SEQ ID N0:24)，P427L+W535F(SEQ ID N0:25)， P427L+C530G(SEQIDN0:26)JPP427L+C530G+W535F(SEQIDN0:27)。
[0048] 本發(fā)明的雙重突變體包括 P427L+W535F (SEQ ID N025)，P427L+C530G (SEQ ID N0:26), P427L+A248L, P427L+D482L, W535F+C530G, W535F+A248L, W535F+D482L, C530G+A248L，和 A248L+D482L。三重突變體包括 P427L+C530G+A248L，P427L+C530G+D482L， P427L+A248L+D482L, P427L+C530G+W535F(SEQ ID N0:27), W535F+C530G+A248L, W535F+C530G+D482L，W535F+A248L+D482L，和 C530G+A248L+D482L。
[0049] 本發(fā)明的突變型SLO蛋白也包括含上述突變型SLO蛋白和另一種GAS抗原 的融合多肽。GAS抗原披露于，例如，WO 02/34771，且包括但不限于：GAS39(spy0266 ; gi-15674446), GAS40 (spy0269 ；gi-15674449), GAS42 (spy0287 ；gi-15674461), GAS45(M5005_spy0249 ；gi-71910063), GAS57(spy0416 ；gi-15674549), GAS58(spy0430 ； gi-15674556)，GAS84(spy 1274 ;gi-l5675229)，GAS95 (spt1733 ;gi-15675582)， GAS117 (spy0448 ;gi-15674571)，GAS130 (spy0591 ;gi-15674677)，GAS137(spy0652 ; gi-15674720), GAS159(spy1105 ；gi-15675088), GAS193(spy2025 ；gi-15675802), GAS202 (spyl309 ；gi-15675258), GAS217(spy0925 ；gi-15674945), GAS236 (spy1126 ； gi-15675106), GAS253(spyl524 ；gi-15675423), GAS277(spy1939 ；gi-15675742), GAS294(spyll73 ；gi-15675145), GAS309(spy0124 ；gi-15674341), GAS366 (spyl525 ； gi-15675424), GAS372 (spy1625 ；gi-15675501), GAS384(spy 1874 ；gi-15675693), GAS389(spyl981 ；gi-15675772) , GAS504(spyl751 ；gi-15675600) , GAS509(spyl618 ； gi-15675496)，GAS290 (spyl959 ;gi-15675757)，GAS511 (spyl743 ;gi-15675592)， GAS527(spyl204 ;gi-15675169)，GAS529(spyl280 ;gi-15675233)，和 GAS533(spyl877 ; gi-15675696)。進一步的 GAS 抗原包括但不限于：GAS68(Spy0163 ;gi 13621456)、 GAS84 (Spy 1274 ;gi13622398)、GAS88 (Spy 1361 ;gi13622470)、GAS89 (Spy 1390 ; gi13622493)、GAS98(Spy 1882 ;gi13622916)、GAS99(Spy 1979 ;gi13622993)、 GAS102(Spy2016 ;gil3623025)、 GAS146(Spy0763 ;gil3621942)、 GAS195(Spy2043 ; gi13623043)、GAS561 (Spy 1134 ;gi13622269)、GAS179 (Spy 1718 ;gi13622773)和 GAS681(Spyll52 ；gil362228)〇
[0050] 編碼突變型SLO蛋白的核酸分子
[0051] 本發(fā)明包括編碼突變型SLO蛋白的核酸分子。本發(fā)明也包括所含核苷酸序列與這 種分子至少有50%序列相同性的核酸分子。取決于具體的序列，所述序列相同性程度優(yōu)選 大于 50% (如 60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高）。核苷酸序列之間的相同性優(yōu)選用Smith-Waterman同源性檢索算法測 定，以MPSRCH程序（牛津分子公司（Oxford Molecular))進行，所用仿射空位檢索的參數(shù) 是：空位開放罰分=12,空位延伸罰分=1。
[0052] 本發(fā)明也提供能與上述這些分子雜交的核酸分子?？稍诓煌?嚴謹性"條件下進行 雜交反應(yīng)。提高雜交反應(yīng)嚴謹性的條件是本領(lǐng)域廣為所知和已發(fā)表的。參見例如Sambrook 等"分子克隆：實驗室手冊（Molecular Cloning:A Laboratory Manual) "1989,第 7. 52 頁。 相關(guān)條件的例子包括（嚴謹性逐漸提高的順序）：251：、371：、501：、551：和681：的培育溫 度；10X SSC、6X SSC、1X SSC 和 0.1X SSC(SSC 是 0.15M NaCI 和 15mM 檸檬酸緩沖液）的 緩沖液濃度和與其等同的采用其它緩沖液的系統(tǒng)；〇%、25和75%的甲酰胺濃度； 5分鐘至24小時的培育時間；1、2或更多次的洗滌步驟；1、2或15分鐘的洗滌培育時間； 6X SSCUX SSC、0. IX SSC或去離子水的洗滌液。雜交技術(shù)及其優(yōu)化是本領(lǐng)域熟知的，可參 見例如，Sambrook, 1989 ;Ausubel等編著的"分子生物學簡短方案（Short Protocols in Molecular Biology) "第4版，1999 ;美國專利5, 707, 829 ;Ausubel等編著"分子生物學當 前方案（Current Protocols in Molecular Biology)，'，增刊 30,1987。
[0053] 在某些實施方式中，本發(fā)明的核酸分子能在低嚴謹條件下與靶分子雜交；在其它 實施方式中，本發(fā)明的核酸分子能在中等嚴謹條件下雜交；在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的 核酸分子能在高嚴謹條件下雜交。低嚴謹性雜交條件的一個例子是50°C和IOX SSC。中等 嚴謹性雜交條件的一個例子是55°C和1XSSC。高嚴謹性雜交條件的一個例子是68°C和0. IX SSC。
[0054] 突變型SLO蛋白的制造
[0055] 重組制備
[0056] 遺傳密碼的冗余度是眾所周知的。因此，可利用編碼野生型SLO蛋白或編碼本 發(fā)明SLO突變蛋白的任何核酸分子（多核苷酸）來重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)。編碼野生型SL0、 SLO 突變體 P427L，W535F，C530G，AA248, W535F+D482N，P427L+W535F，P427L+C530G，和 P427L+C530G+W535F的核苷酸序列的例子提供在序列表中（也可分別見SEQ ID N0S:28， 29, 30, 31，32, 33, 34, 35,和36)。也可采用標準的核酸純化技術(shù)從合適的釀膿鏈球菌分離 編碼野生型SLO的核酸分子，或采用擴增技術(shù)，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)或用自動化合成 儀合成該核酸分子。參見 Caruthers 等，Nucl Acids Res Symp Ser. 215, 223, 1980 ;Horn 等，Nucl Acids Res Symp Ser. 225, 232, 1980 ;Hunkapiller等，Nature 310, 105-11，1984 ; Grantham 等，Nucl Acids Res. 9, r43_r74,1981。
[0057] 可用標準分子生物學技術(shù)，以mRNA為模板制備cDNA分子。然后可用本領(lǐng)域熟知 的分子生物學技術(shù)復(fù)制cDNA分子?？衫没蚪MDNA或cDNA作模板，以擴增技術(shù)，如PCR 獲得更多拷貝的本發(fā)明多核苷酸。
[0058] 如果需要，可用本領(lǐng)域眾所周知的方法為各種原因工程改造多核苷酸以改變抗原 編碼序列，包括但不限于導致克隆、加工和/或多肽或mRNA產(chǎn)物表達的修飾等的改變。可 采用基因片段和合成寡核苷酸的隨機片段化和PCR重裝配來改組DNA，從而工程改造核苷 酸序列。例如，可利用定點誘變插入新的限制性酶位點，改變糖基化模式，改變密碼子偏愛， 產(chǎn)生剪接變體，引入突變等等。
[0059] 可利用序列修飾，例如加入純化標簽序列或優(yōu)化密碼子來促進表達。例如，用編碼 標簽蛋白如聚組氨酸（"HIS"）或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（"GST"）的序列替代N-末端前導 序列?？衫眠@種標簽蛋白促進表達蛋白的純化、檢測和穩(wěn)定性?？蛇x擇具體的原核或真 核宿主偏愛的密碼子來提高蛋白表達率，或制備具有所需性能，如半壽期比天然序列產(chǎn)生 的轉(zhuǎn)錄物更長的RNA轉(zhuǎn)錄物。這些方法是本領(lǐng)域熟知的，在WO 05/032582中也有描述。
[0060] 表達載體
[0061] 可將編碼突變型SLO蛋白的核酸分子插入表達載體中，該表達載體含有轉(zhuǎn)錄和翻 譯插入的編碼序列所需的元件?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含編碼序列和合 適轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺 傳重組。
[0062] 宿主細胞
[0063] 能產(chǎn)生突變型SLO蛋白的宿主細胞可以是原核或真核細胞。優(yōu)選的宿主細胞 是大腸桿菌，其它合適的宿主包括：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂 亞種（lactococus cremoris)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、傷寒沙門菌（Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium)、 乳醜胺奈瑟菌（Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌（Neisseria cinerea)、分枝桿菌 (Mycobacteria)(如結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis))、酵母菌、桿狀病毒、哺乳動物細胞 等等。
[0064] 可選擇能以所需方式調(diào)節(jié)插入序列的表達或加工所表達多肽的宿主細胞株。多肽 的這種修飾包括但不限于：乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和?；Ｒ部衫们懈?前 蛋白（prepro) "形式多肽的翻譯后加工來幫助正確插入、折疊和/或行使功能?？蓮拿绹?式培養(yǎng)物保藏中心（ATCC;10801,大學大道，瑪娜絲，弗吉尼亞州（University Boulevard, Manassas，VA) 20110-2209)獲得具有翻譯后活化特異性細胞機制和特征機理的不同宿主細 胞，選擇這些宿主細胞以確保外源蛋白的正確修飾和加工。參見WO 01/98340。
[0065] 可采用已良好建立的技術(shù)將表達構(gòu)建物引入宿主細胞，包括但不限于：轉(zhuǎn)鐵蛋 白-聚陽離子介導的DNA轉(zhuǎn)移，用裸核酸或包裹的核酸轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導的細胞融合，包裹 DNA的膠乳珠的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，病毒感染，原生質(zhì)體融合、電穿孔，"基因槍"方法，和DEAE-或磷 酸鈣介導的轉(zhuǎn)染。
[0066] 將表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞培養(yǎng)在適合從細胞培養(yǎng)表達蛋白和回收的條件下。轉(zhuǎn) 化細胞產(chǎn)生的蛋白可能分泌出來或包含在細胞內(nèi)，這取決于所用的核苷酸的序列和/或表 達載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以設(shè)計含有信號序列的表達載體，其能引導可溶性抗原穿 過原核或真核細胞膜而分泌。
[0067] 純化
[0068] 可在重組產(chǎn)生的突變型SLO蛋白中包含信號輸出序列，以便用已知方法純化細胞 培養(yǎng)液中的抗原。或者，可用本領(lǐng)域熟知的方法，從工程改造的宿主細胞中分離本發(fā)明重組 產(chǎn)生的突變型SLO蛋白，使其與宿主細胞的其它組分，如蛋白質(zhì)、糖或脂質(zhì)分開。這類方法 包括但不限于：分子大小排阻層析、硫酸銨分級、離子交換層析、親和層析和制備型凝膠電 泳。純化的突變型SLO蛋白制品至少80%純，優(yōu)選該制品為90%、95%或99%純。可用本 領(lǐng)域已知的任何方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來評估制品的純度?？捎眠m當?shù)脑?齊U，如脲素來促進突變型SLO蛋白的溶解。
[0069] 化學合成
[0070] 突變型SLO蛋白的合成，例如可采用固相技術(shù)。參見，如Merrifield，J Am Chem Soc. 85, 2149-54, 1963 ;Roberge 等，Science 269, 202-04,1995?？刹捎檬止ぜ夹g(shù)或自動化 技術(shù)進行蛋白質(zhì)合成。實施自動化合成，例如可采用泊金艾爾默公司的應(yīng)用生物系統(tǒng)431A 膚合成儀（Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer，Perkin Elmer)?？扇芜x分 別合成突變型SLO蛋白的各片段，再用化學方法組合產(chǎn)生全長分子。
[0071] 抗體
[0072] 本發(fā)明提供了特異性結(jié)合本發(fā)明的突變型SLO蛋白但不結(jié)合野生型SLO蛋白 的抗體。術(shù)語"抗體"包括完整的免疫球蛋白分子，及其能結(jié)合抗原的片段。這些抗體 片段包括：雜交（嵌合）抗體分子（如Winter等，Nature 349, 293-99, 1991 ;美國專利 4, 816, 567) ;F(ab'）2和F(ab)片段及Fv分子；非共價連接的異質(zhì)二聚體（如Inbar等， Proc Natl Acad Sci. USA. 69,2659-62, 1972 ;Ehrlich 等，Biochem. 19,4091-96, 1980); 單鏈 Fv 分子（sFv)(如 Huston 等，Proc Natl Acad Sci. USA. 85, 5897-83, 1988); 二聚或三聚抗體片段構(gòu)建物；微小抗體（如Pack等，Biochem. 31，1579-84, 1992 ; Cumber 等，J Immunology. 149B, 120-26, 1992);人源化抗體分子（如 Riechmann 等，Nature. 332, 323-27, 1988 ;Verhoeyan 等，Scence. 239, 1534-36, 1988 和公開的英國專 利號GB2, 276, 169,1994/9/21公開）；獲自這些分子的任何功能性片段及通過非常規(guī)方法， 如噬菌體展示技術(shù)獲得的抗體?？贵w優(yōu)選為單克隆抗體。本領(lǐng)域熟知獲取單克隆抗體的方 法。
[0073] 形成表位通常需要至少6、7、8、10或12個毗連氨基酸。然而，包含非毗連氨基酸的 表位可能需要更多，例如，至少15、25或50個氨基酸?？刹捎酶鞣N免疫測定（例如，Western 印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫組化測定、免疫沉淀或本領(lǐng)域已知的其他免疫化學測定） 來鑒定具有所需特異性的抗體。許多競爭性結(jié)合或免疫放射測定方案是本領(lǐng)域熟知的。此 類免疫實驗通常包括檢測免疫原和特異性結(jié)合該免疫原的抗體之間形成的復(fù)合物。當用于 免疫化學測定時，特異性結(jié)合突變型SLO蛋白的抗體制品提供的檢測信號通常比用其他蛋 白質(zhì)提供的檢測信號高至少5_、10-或20-倍，且如果與野生型SLO蛋白結(jié)合則不提供可檢 測信號。優(yōu)選地，在免疫化學測定中，所述抗體不檢測其他蛋白質(zhì)并且可從溶液中免疫沉淀 特定抗原。
[0074] 抗體的制備
[0075] 可利用突變型SLO蛋白或非SLO多肽抗原（下文所述）免疫哺乳動物，例如小鼠、 大鼠、家兔、豚鼠、猴子或人來產(chǎn)生多克隆抗體。如果需要，可將抗原偶聯(lián)于載體蛋白，如牛 血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或匙孔蜮血藍蛋白。根據(jù)宿主種類，可采用不同的佐劑來增強免 疫應(yīng)答。這類佐劑包括但不限于：弗氏佐劑、無機膠體（如氫氧化鋁）和表面活性劑（如溶 血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔蜮.血藍蛋白和二硝基苯酚）。人用 佐劑中，特別采用BCG(卡介苗）和短棒桿菌。
[0076] 可采用通過連續(xù)培養(yǎng)細胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)來制備能特異性結(jié)合 抗原的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于：雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)和EBV 雜交瘤技術(shù)（Kohler 等，Nature 256, 495-497, 1985 ;Kozbor 等，J Immunol Methods 81，31-42,1985 ;Cote 等，Proc Natl Acad Sci. 80,2026-2030 ;Cole 等，Mol Cell Biol.62, 109-120,1984)。
[0077] 此外，可采用為產(chǎn)生"嵌合抗體"而開發(fā)的技術(shù)，該技術(shù)將小鼠抗體基因剪接 于人抗體基因獲得具有合適抗原特異性和生物學活性的分子（Morrison等，Proc Natl Acad Sci. USA. 81，68516855 ;Neuberger 等，Nature. 312, 604-608, 1984 ;Takeda 等， Nature. 314, 452-454, 1985)。也可"人源化"單克隆抗體和其它抗體以防止病人對所用治 療抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這類抗體的序列與直接用于治療的人抗體應(yīng)充分相似或可能需要改 變幾個關(guān)鍵殘基?？赏ㄟ^定點誘變單個殘基或移植整個互補決定區(qū)來取代不同于人序列的 殘基以最大程度減少嚙齒類抗體與人序列之間的序列差異。
[0078] 或者，可用以下所述重組方法產(chǎn)生人源化抗體。如美國專利5, 565, 332所述，特異 性結(jié)合特定抗原的抗體可包含部分或完全人源化的抗原結(jié)合位點。
[0079] 或者，可采取所述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)，用本領(lǐng)域已知方法來產(chǎn)生特異性結(jié)合 特定抗原的單鏈抗體。可從免疫球蛋白隨機組合庫的鏈改組來產(chǎn)生具有相關(guān)特異性但獨特 性組成不同的抗體（Burton 等，Proc Natl Acad Sci. USA. 88, 1112023)。
[0080] 也可用DNA擴增方法，如PCR，用雜交瘤cDNA作模板構(gòu)建單鏈抗體（Thirion等， 1996, Eur J Cancer Prev. 5,507-11)。單鏈抗體可以是單-或雙-特異性，可以是二 價或四價抗體。構(gòu)建四價雙特異性單鏈抗體可參見，例如Coloma and Morrison.，Nat Biotechnol. 15, 159-63, 1997中所述。構(gòu)建二價雙特異性單鏈抗體可參見Mallender和 Voss.，J Biol Chem. 269, 199-206, 1994 中所述。
[0081] 可用手工或自動化核苷酸合成構(gòu)建編碼單鏈抗體的核苷酸序列，如下所述，用標 準重組DNA方法將其克隆入表達構(gòu)建物中，再引入細胞而表達該編碼序列?；蛘?，可采用絲 狀噬菌體技術(shù)直接產(chǎn)生單鏈抗體（Verhaar等，Int J Cancer. 61,497-501，1995 ;Nicholls 等，J Tmmun〇I Meth. 165, 81-91，1993)。
[0082] 也可通過體內(nèi)誘導淋巴細胞群產(chǎn)生，或通過篩選文獻所述的免疫球蛋白庫或一些 高特異性結(jié)合物質(zhì)（Orlandi 等，Proc Natl Acad Sci. USA. 86, 3833-37, 1989 ;Winter 等， Nature 349,293-99,1991)來制備能特異性結(jié)合特定抗原的抗體。
[0083] 可按WO 93/03151所述構(gòu)建嵌合抗體。也可制備免疫球蛋白衍生的多價多特異性 結(jié)合蛋白，如WO 94/13804所述的"二抗體"。
[0084] 可用本領(lǐng)域熟知方法純化抗體。例如，可通過結(jié)合有相關(guān)抗原的層析柱來親和純 化抗體。然后可用高鹽濃度緩沖液洗脫結(jié)合的抗體。
[0085] 藥物組合物
[0086] 本發(fā)明也提供用作藥物的組合物（如免疫原性組合物或疫苗）?？捎帽景l(fā)明的組 合物預(yù)防和/或治療釀膿鏈球菌感染所引起的疾病，該組合物包含至少一種活性成分，可 以是多肽、核酸分子或抗體。所述疾病，例如可以是菌血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥期猩紅熱、猩紅熱、 丹毒、咽炎、膿皰病、壞死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克綜合征。
[0087] 含有突變型SLO蛋白的組合物優(yōu)選是免疫原性組合物，更優(yōu)選是疫苗組合物。這 種組合物的pH宜在6-8之間，優(yōu)選約7?？捎镁彌_劑維持此pH。該組合物可以無菌和/或 無熱原。組合物與人體等張。
[0088] 本發(fā)明的疫苗可用于預(yù)防或治療，但通常用于預(yù)防。因此，本發(fā)明包括治療或預(yù)防 性治療釀膿鏈球菌感染的方法。動物優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。該方法包括給予動物治療 或預(yù)防量的本發(fā)明免疫原性組合物。
[0089] 本發(fā)明的某些組合物包含本文所述的多肽突變型SLO蛋白。本發(fā)明的其它組合 物包含編碼突變型SLO蛋白的核酸分子及任選的可包含在此組合物中的其它抗原（見下 文）。參見例如Robinson 和Torres(1997)Seminars in Immunology 9:271-283 ;Donnelly 等，（1997)Ann Rev Immunol 15:617-648 ；Scott-Taylor&Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9:471-80 ；Apostolopoulos&plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2 ;441-47;Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1:116-20 ;Dubensky 等，（2000)M〇1 Med 6:723-32 ;Robinson&Pertmer(2000)Adv Virus Res 55:1-74 ;Donnelly 等，（2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt2):S190-193;Davis(1999)Mt Sinai J Med 66:84-90。所 述核酸分子通常是DNA分子，如質(zhì)粒形式。
[0090] 在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種其它活性劑。這種活性劑 包括但不限于：(a)本發(fā)明的另一種突變型SLO蛋白，（b)用于兒童疫苗的多肽抗原，（C)用 于老年人或免疫力低下個體的疫苗的多肽抗原，（d)編碼（a)-(c)的核酸分子和特異性結(jié) 合（a)-(c)的抗體。
[0091] 其它抗原
[0092] 本發(fā)明的組合物可與用于本發(fā)明治療或預(yù)防方法的一種或多種其他抗原一起給 予。合適的抗原包括以下所列的那些。此外，可用本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防以下所列任 何一種病原體引起的感染。除與以下所述抗原聯(lián)用外，本發(fā)明組合物也可與本文所述佐劑 聯(lián)用。
[0093] 可與本發(fā)明聯(lián)用的抗原包括但不限于一種或多種以下抗原，或衍生自一種或多種 以下病原體的抗原：
[0094] A?細菌抗原
[0095] 適合用于本發(fā)明的細菌抗原包括可從細菌分離、純化或衍生的蛋白質(zhì)、多糖、脂多 糖及外膜囊泡。此外，細菌抗原可包括細菌裂解物和滅活的細菌制劑?？芍亟M表達產(chǎn)生細 菌抗原。細菌抗原優(yōu)選包含在細菌生命周期至少某階段暴露在細菌表面的表位。細菌抗原 優(yōu)選多種血清型之間的保守性抗原。細菌抗原包括衍生自以下的一種或多種細菌及以下鑒 定的特異性示范抗原中的抗原。
[0096] 腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitides):腦膜炎球菌抗原可包括自奈瑟氏 腦膜炎球菌血清群如A、C、W135、Y和/或B純化的或衍生的蛋白質(zhì)（如參考文獻1-7所鑒 定的那些）、糖（包括多糖、寡糖或脂多糖）或外膜囊泡（參考文獻8、9、10、11)。可從粘附 蛋白、自身轉(zhuǎn)運蛋白（autotransporter)、毒素、Fe獲取蛋白和膜締合蛋白（優(yōu)選外膜整合 蛋白）中選擇腦膜炎球菌的蛋白抗原。
[0097] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae):肺炎鏈球菌抗原可包括肺炎鏈球菌 的糖（包括多糖或寡糖）和/或蛋白質(zhì)?？蛇x用血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的糖抗原?？蛇x用 TO 98/18931、WO 98/18930、美國專利號6, 800, 744、TO 97/43303和TO 97/37026所鑒定蛋白質(zhì)的蛋白抗原。 可從聚組氨酸Triad家族（PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族（CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX 截短物、CbpX-LytX截短嵌合蛋白、肺炎球菌溶酶（Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、 Sp 125或Sp 133蛋白選擇肺炎鏈球菌蛋白。
[0098] 釀膿鏈球菌（A群鏈球菌）：A組鏈球菌抗原可包括：W0 02/34771或 W02005/032582 中鑒定的蛋白質(zhì)（包括但不限于：GAS39(spy0266 ;gi-15674446)， GAS40(spy0269 ；gi-15674449), GAS42(spy0287 ；gi-15674461), GAS45(M5005_spy0249 ； gi-71910063), GAS57 (spy0416 ；gi-l5674549), GAS58(spy0430 ；gi-15674556), GAS84(spyl274 ；gi-15675229) , GAS95(sptl733 ；gi-15675582) , GASl17(spy0448 ； gi-15674571), GAS130 (spy0591 ；gi-15674677), GAS137(spy0652 ；gi-15674720), GAS159(spyll05 ；gi-15675088), GAS193(spy2025 ；gi-15675802), GAS202(spyl309 ； gi-15675258), GAS217(spy0925 ；gi-15674945), GAS236 (spy1126 ；gi-15675106), GAS253 (spyl524 ；gi-15675423) , GAS277 (spy1939 ；gi-15675742), GAS294(spy1173 ； gi-15675145)，GAS309 (spy0124 ;gi-15674341)，GAS366 (spyl525 ;gi-15675424)， GAS372(spyl625 ；gi-15675501) , GAS384 (spy1874 ；gi-15675693) , GAS389(spyl981 ； gi-15675772)，GAS504(spyl751 ;gi-15675600)，GAS509 (spyl618 ;gi-15675496)， GAS290(spyl959 ;gi-15675757)，GAS511 (spyl743 ;gi-15675592)，GAS527 (spyl204 ; gi-15675169)， GAS529(spyl280 ;gi-15675233)，和 GAS533(spyl877 ;gi-15675696))， GAS M 蛋白片段融合物（包括 TO 02/094851 以及 Dale，Vaccine(1999) 17:193-200,和 Dale，Vaccine 14(10) :944-948中描述的那些），纖連蛋白結(jié)合蛋白（Sfbl)，鏈球菌血紅 素相關(guān)蛋白（Shp)以及鏈球菌溶血素S(SagA)。進一步的GAS抗原包括：GAS68(Spy0163; gi13621456)、GAS84(Spy 1274 ;gi 13622398)、GAS88 (Spy 1361 ;gi13622470)、 GAS89(Spyl390 ；gi13622493) , GAS98(Spy 1882 ；gi13622916) , GAS99(Spy 1979 ； gi13622993)、GAS 102(Spy2016 ;gi13623025)、GAS 146(Spy0763 ;gi13621942)、 GAS195 (Spy2043 ；gil3623043) , GAS561 (Spyll34 ；gil3622269) , GAS179 (Spyl718 ； gil3622773)和 GAS681(Spyll52 ;gil362228)。
[0099] 粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis):粘膜炎莫拉菌抗原包括W002/18595和 WO 99/58562鑒定的抗原、外膜蛋白抗原（HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。
[0100] 百日咳博德特菌（Bordetella pertussis):百日咳菌抗原包括百日咳全毒素 (PT)和絲狀血凝素（FHA)，任選也與百日咳桿菌粘附素（pertactin)和/或凝集原2和3 聯(lián)用。
[0101] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus):金黃色葡萄球菌抗原包括任選與無 毒重組銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A偶聯(lián)的5型和8型金黃色葡萄 球菌莢膜多糖，例如StaphVAX?，或衍生自表面蛋白質(zhì)，侵染素（殺白細胞素、激酶、透明質(zhì) 酸酶），抑制吞噬細胞吞噬作用的表面因子（莢膜，A蛋白），類胡蘿卜素，過氧化氫酶產(chǎn)物， A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核細胞膜的膜破壞性毒素（任選脫毒的）（溶血素、 白細胞毒素、殺白細胞素）的抗原。
[0102] 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis):表皮葡萄球菌抗原包括粘質(zhì)結(jié)合抗 原（SAA)。
[0103] 破傷風梭菌（Clostridium tetani)(破傷風）：破傷風菌抗原包括破傷風類毒素 (TT)，優(yōu)選用作與本發(fā)明組合物結(jié)合/偶聯(lián)的載體蛋白質(zhì)。
[0104] 白喉棒狀桿菌（Cornynebacterium diphtheriae)(白喉）：白喉抗原包括白喉毒 素，優(yōu)選脫毒的，如CRM197。此外考慮將能調(diào)節(jié)、抑制ADP核糖基化或與之結(jié)合的抗原與本 發(fā)明組合物聯(lián)用/共同給藥/偶聯(lián)。所述白喉類毒素可用作運載體蛋白。
[0105] 流感嗜血桿菌 B (Haemophilus influenzae B) (Hib) :Hib 抗原包括 Hib 糖抗原。
[0106] 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa):銅綠假單胞菌抗原包括內(nèi)毒素A、Wzz 蛋白、銅綠假單胞菌LPS，更具體說是分離自PAOl (05血清型）的LPS和/或外膜蛋白，包括 外膜蛋白 F (OprF) (Infect Immun. 2001，May ;69 (5) :3510-15)。3510-3515).
[0107] 嗜肺軍團病桿菌（Legionella pneumophila):可以是衍生自嗜肺軍團桿菌病桿菌 的細菌抗原。
[0108] 無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae) (B群鏈球菌）：B群鏈球菌抗原包括WO 02/34771、W0 03/093306、W0 04/041157 或 WO 2005/002619 鑒定的蛋白或糖抗原（包括蛋 白 GBS80、GBS104、GBS276 和 GBS322 以及包括血清型 la、lb、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII 和VIII產(chǎn)生的糖抗原）。
[0109] 淋病奈瑟菌（Neiserria gonorrhoeae):淋病奈瑟菌抗原包括Por (或膜通道蛋 白）蛋白，如PorB (參見Zhu等，Vaccine (2004) 22:660-669)、轉(zhuǎn)移結(jié)合蛋白如TbpA和 TbpB(參見Price 等，Infection and immunity (2004) 71 (1):277-283)、混池蛋白（如 Opa)、還原可修飾蛋白（Rmp)和外膜囊泡（OMV)制品（參見Plante等，J Infectious Disease (2000) 182:848-55),也參見例如 TO 99/24578、TO 99/36544、TO99/57280、WO 02/0792430。
[0110] 砂眼衣原體（Chlamydia trachomatis):砂眼衣原體抗原包括血清型A、B、Ba和 C產(chǎn)生的抗原（砂眼致病因子，導致失明）、血清型LI、L2和L3產(chǎn)生的抗原（與性病性淋 巴肉芽腫（Lymphogranuloma venereum)有關(guān)）和血清型D-K產(chǎn)生的抗原。砂眼衣原體 抗原還可包括 WO 00/37494、WO 03/049762、W003/068811 或 WO 05/002619 鑒定的抗原， 包括 P印A(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-樣（CT242)、 L7/L12(CT316)、OmcA (CT444)、AtosA (CT467)、CT547、Eno (CT587)、HrtA (CT823)和 MurG(CT761)〇
[0111] 蒼白密螺旋體（Treponema pallidum)(梅毒）：蒼白密螺旋體抗原包括TmpA抗原。
[0112] 杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi)(導致軟性下推）：軟性下推抗原包括外 膜蛋白（DsrA)。
[0113] 奠腸球菌(^Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(^Enterococcus faecium):抗原 包括三糖重復(fù)序列或美國專利號6, 756, 361提供的其它腸球菌衍生抗原。
[0114] 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori):幽門螺桿菌抗原包括 Cag、Vac、Nap、HopX、 HopY和/或脲酶抗原。
[0115] 腐生性葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus):抗原包括160kDa腐生葡萄 球菌血凝素。
[0116] 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica):抗原包括 LPS(Infect Immun. 2002, Augst ；70 (8):4414)〇 4414).
[0117] 大腸桿菌（E. coli):大腸桿菌抗原可以是腸毒素性大腸桿菌（ETEC)、腸聚集性大 腸桿菌（EAggEC)、彌散性附性大腸桿菌（DAEC)、腸致病性大腸桿菌（EPEC)和/或腸溶血性 大腸桿菌（EHEC)產(chǎn)生的抗原。
[0118] 炭疽桿菌（Bacillus anthracis)(炭疽）：炭疽桿菌抗原任選是脫毒的，可選自 A-組分（致死因子（LF)和水腫因子（EF))，二者具有稱為保護性抗原（PA)的共同B-組分。
[0119] 鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis)(鼠疫）：鼠疫抗原包括Fl莢膜抗原（Infect Immun.，2003 年 1 月；71 (1) :374-383)，LPS(Infect Immun. 1999 年 10 月；67(10) :5395)， 鼠疫耶爾森菌 V 抗原（Infect Immun. 1997 年 11 月；65 (11): 4476-4482)。
[0120] 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis):結(jié)核菌抗原包括脂蛋白、LPS、BCG 抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任選配制在陽離子脂質(zhì)載體中（Infect Immun. 2004年10月；72 (10) :6148)，結(jié)核分枝桿菌（Mtb)異朽1檬酸脫氫酶相關(guān)抗原（Proc Natl Acad Sci USA. 2004 年 8 月 24 日；101 (34) : 12652)，和 / 或 MPT51 抗原（Infect Immun. 2004 年 7 月；72(7) :3829)。
[0121] 立克次體（Rickettsia):抗原包括外膜蛋白 A 和 / 或 B (OmpB) (Biochim Biophys Acta. 2004 年 11月 1 日；1702 (2): 145)，LPS 和表面蛋白抗原（SPA)(J Autoimmun. 1989 年 6月；2增刊：81)。單核細胞增多癥李斯特菌（Listeria monocytogenes):
[0122] 單核細胞增生利斯特菌（Listeria monocytogenes):細菌抗原可衍生自單核細胞 增多性利斯特菌。
[0123] 肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae):抗原包括WO 02/02606鑒定的那些抗原。
[0124] 霍亂弧菌（Vibrio cholerae):抗原包括蛋白酶抗原、LPS、特別是霍亂弧菌II的 脂多糖、OlInaba 0-特異性多糖、霍亂弧菌0139、IEM108疫苗的抗原（Infect Immun. 2003 年10月；71 (10) : 5498-504)和/或緊密連接毒素（Zot)。
[0125] 傷寒沙門菌（Salmonella typhi)(傷寒熱）：抗原包括莢膜多糖，優(yōu)選偶聯(lián)物（Vi, 即 vax-TyVi)。
[0126] 博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)(萊姆病）：抗原包括脂蛋白（如OspA、 0spB、0spC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相關(guān)蛋白（Erps)、核心蛋白多糖結(jié)合蛋白（如 DbpA)和抗原性可變的VI蛋白，如與P39和P13結(jié)合的蛋白（一種膜內(nèi)在蛋白，Infect Immun.2001 年5月；69 (5) :3323-34)、VLsE 抗原可變異蛋白（J Clin Microbiol. 1999 年 12 月；37 (12):3997)。
[0127] 牙銀卩卜啉單胞菌（Porphyromonas gingival is):抗原包括其牙銀卩卜啉單孢菌外膜 蛋白（OMP)。
[0128] 克雷伯菌（Klebsiella):抗原包括0MP，包括0MPA，或任選與破傷風類毒素偶聯(lián)的 多糖。
[0129] 本發(fā)明的其它細菌抗原可以是任何上述的莢膜抗原、多糖抗原或蛋白抗原。其它 細菌抗原也可包括外膜囊泡（OMV)制品。此外，抗原包括活的、減毒的和/或純化的任何上 述細菌。本發(fā)明的抗原可以衍生自革蘭-陰性菌或革蘭-陽性菌。本發(fā)明的抗原可以衍生 自需氧菌或厭氧菌。
[0130] 此外，可將上述細菌產(chǎn)生的任何一種糖（多糖、LPS、LOS或寡糖）與其它物質(zhì)或 抗原，如運載體蛋白（如CRM197)偶聯(lián)。這種偶聯(lián)可以是糖上羰基部分與蛋白質(zhì)氨基基 團還原胺化實現(xiàn)的直接偶聯(lián)，如美國專利5, 360, 897和Can J Biochem Cell Biol. 1984 年5月；62(5) :270-5所述。或者，糖可以通過連接基團偶聯(lián)，例如采用《生物偶聯(lián)技術(shù)》 (Bioconjugate Techniques)，1996 和 CRC，《蛋白質(zhì)偶聯(lián)與交聯(lián)化學》（Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking) ,1993中提供的琥拍酸酰胺或其他連接鍵。
[0131] B.病毒抗原
[0132] 適合本發(fā)明用的病毒抗原包括滅活（或殺傷）病毒、減毒病毒、裂解病毒制劑、純 化亞單位制劑、從病毒和病毒樣顆粒（VLP)分離、純化或衍生的病毒蛋白質(zhì)。病毒抗原可以 是在培養(yǎng)細胞或其它基質(zhì)上增殖病毒產(chǎn)生的抗原?；蛘撸芍亟M表達病毒抗原。病毒抗原 優(yōu)選包含在其生命周期至少某階段暴露在病毒表面的表位。病毒抗原優(yōu)選在多種血清型或 分離物中為保守的抗原。病毒抗原包括衍生自以下一種或多種病毒及以下鑒定的特異性抗 原例子的抗原。
[0133] 正粘病毒（Orthomyxovirus):病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙 型流感（病毒）。正粘病毒抗原可選自一種或多種病毒蛋白質(zhì)，包括血凝素（HA)、神經(jīng)氨 酸酶（NA)、核蛋白（NP)、基質(zhì)蛋白（Ml)、膜蛋白（M2); -種或多種轉(zhuǎn)錄酶組分（PB1、PB2和 PA)。優(yōu)選的抗原包括HA和NA。
[0134] 流感病毒抗原可以可衍生自流行病爆發(fā)間的（年度）流感毒株?；蛘?，流感病毒 抗原可以衍生自可能導致流行病爆發(fā)的毒株（即，與目前的流行毒株相比，具有新血凝素 的流感毒株，或者在禽類對象中致病并可能平行轉(zhuǎn)移至人群的流感毒株，或?qū)θ酥虏〉牧?感毒株）。
[0135] 副粘病毒科病毒：病毒抗原可以衍生自副粘病毒科病毒，如肺病毒屬（RSV)、副粘 病毒屬（PIV)和麻疹病毒屬（麻疹）。
[0136] 肺病毒屬：病毒抗原可以衍生自肺病毒屬，如呼吸道合胞病毒（RSV)、牛呼吸道合 胞病毒、小鼠肺炎病毒和火雞鼻氣管炎病毒產(chǎn)生的病毒抗原。優(yōu)選的肺病毒是RSV。肺病毒 抗原可選自以下一種或多種蛋白，包括表面融合蛋白（F)、糖蛋白（G)和小疏水蛋白（SH)、 基質(zhì)蛋白Ml和M2、核衣殼蛋白N、P和L及非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2。優(yōu)選的肺病毒抗原包括 F、G和M。參見J Gen Virol. 2004年11月；85 (部分11) : 3229。肺病毒屬抗原還可配制成 或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同時包含RSV和PIV的組分。
[0137] 副粘病毒屬：病毒抗原可衍生自副粘病毒屬，如1-4型副流感病毒（PIV)、腮腺炎 病毒、仙臺病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒優(yōu)選PIV或腮腺炎病 毒。副粘病毒抗原可以選自以下一種或多種蛋白：血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN)、融合蛋白Fl 和F2、核蛋白（NP)、憐蛋白（P)、大蛋白（L)和基質(zhì)蛋白（M)。優(yōu)選的副粘病毒屬蛋白包括 HN、F1和F2。副粘病毒屬抗原還可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒 可同時包含RSV和PIV的組分?？缮唐坊彽玫娜傺撞《疽呙绨▎蝺r形式或與麻疹和 風疹疫苗聯(lián)用（MMR)的減毒活腮腺炎病毒。
[0138] 麻疫病毒屬：病毒抗原可以衍生自麻疫病毒屬如麻疫病毒。麻疫病毒屬抗原可選 自以下一種或多種蛋白：血凝素（H)、糖蛋白（G)、融合因子（F)、大蛋白（L)、核蛋白（NP)、 聚合酶磷蛋白（P)和基質(zhì)（M)?？缮唐坊彽玫穆檎畈《疽呙绨ㄍǔＥc腮腺炎和風疹病 毒組成聯(lián)合減毒活疫苗（MMR)。
[0139] 微小RNA病毒：病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，如腸病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒 (Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。優(yōu)選衍生自腸病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒的抗原。
[0140] 腸道病毒：病毒抗原衍生自腸病毒，如1、2或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒、1-22型和24型 柯薩奇A病毒、B1-6型柯薩奇病毒、1-9型、11-27型和29-34型艾柯病毒（ECHO)，及68-71 型腸病毒。優(yōu)選的腸病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒。腸病毒抗原宜選自以下VPl、VP2、VP3和VP4衣 殼蛋白的一種或多種?？缮唐坊彽玫募顾杌屹|(zhì)炎疫苗包括滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗（IPV) 和口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗（OPV)。
[0141] 嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自可以是嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒（HAV)?？缮?品化購得的HAV疫苗包括滅活的HAV疫苗。
[0142] 披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如風疹病毒、a病毒或動脈炎病毒。優(yōu)選 衍生自風疫病毒屬，如風疫病毒的抗原。披膜病毒抗原可選自E1、E2、E3、C、NSP_1、NAP0_2、 NSP-3或NSP-4。優(yōu)選的披膜病毒抗原是E1、E2或E3?？缮唐坊彽玫娘L疹病毒疫苗包括 通常與腮腺炎和麻疹疫苗聯(lián)用的冷適應(yīng)的活病毒（MMR)。
[0143] 黃病毒屬：病毒抗原可衍生自黃病毒屬，如蝶傳腦炎（病毒）（TBE)、登革熱（病 毒）（1、2、3或4型）、黃熱?。ú《荆⑷毡灸X炎（病毒）、西尼洛河腦炎（病毒）、圣露易斯 腦炎（病毒）、俄羅斯春夏型腦炎（病毒）、波瓦桑腦炎病毒。黃病毒屬抗原可選自：PrM、M、 C、E、NS-l、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和 NS5。優(yōu)選的黃病毒屬抗原是 PrM、M 和 E?？缮?品化購得的TBE疫苗包括病毒滅活疫苗。
[0144] 鼠疫病毒：病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，如牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)、經(jīng)典豬瘟 病毒（CSFV)或邊界病病毒（BDV)。
[0145] 嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原 選自：表面抗原（L、M和S)、核心抗原（HBc、HBe)。可商品化購得的HBV疫苗包括含表面抗 原S蛋白的亞單位疫苗。
[0146] 丙型肝炎病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒（HCV)。HCV抗原可選自El、E2、El/ E2、NS345糖蛋白、NS345-核心多蛋白和/或非結(jié)構(gòu)區(qū)肽中的一種或多種（Houghton等， Hepatology(1991) 14:381)。
[0147] 桿狀病毒：病毒抗原可衍生自桿狀病毒，如如萊薩病毒（狂犬病病毒）和水泡病毒 (VSV)。桿狀病毒抗原可選自：糖蛋白（G)、核蛋白（NP)、大蛋白（L)、非結(jié)構(gòu)蛋白（NS)?？?商品化購得的狂犬病毒疫苗包含在人二倍體細胞或恒河猴胎肺細胞上培養(yǎng)的殺傷病毒。
[0148] 杯狀病毒科：病毒抗原可衍生自杯狀病毒科，如諾瓦克病毒，和諾瓦克樣病毒如夏 威夷病毒和雪山病毒。
[0149] 冠狀病毒：病毒抗原可衍生自冠狀病毒，SARS、人呼吸道冠狀病毒、禽傳染性支氣 管炎病毒（IBV)、小鼠肝炎病毒（MHV)和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)。冠狀病毒抗原可選 自：突刺（S)、包膜（E)、基質(zhì)（M)、核衣殼（N)和血凝素-脂酶糖蛋白（HE)。冠狀病毒抗原 優(yōu)選衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原參見WO 04/92360中的描述。
[0150] 逆轉(zhuǎn)錄病毒：病毒抗原可衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒，如腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。腫 瘤病毒抗原可衍生自HTLV-UHTLV-2和HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-I或HIV-2。逆 轉(zhuǎn)錄病毒抗原選自：gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu 和 vpr〇 HIV 抗原選 自：gag(p24gag 和 p55gag)、env(gpl60 和 gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白（優(yōu) 選p55gag和gpl40v缺失）。HIV抗原可衍生自以下一種或多種毒株：HIVIIIb，HIVSF2， HIVLAV，HIVLAI，HIVMN，HIV-1CM235, HIV-1US4。
[0151] 呼腸孤病毒：病毒抗原可衍生自呼腸孤病毒，如正呼腸孤病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病 毒或科羅拉多蜱傳熱病毒（Coltivirus)。呼腸孤病毒抗原可選自：結(jié)構(gòu)蛋白入1、入2、入3、 111、112、〇1、〇2或〇3或非結(jié)構(gòu)蛋白〇呢、11呢或〇18。優(yōu)選的呼腸孤病毒抗原可衍生 自輪狀病毒。輪狀病毒抗原選自 ：％1、￥?2、￥?3、￥?4(或切割產(chǎn)物￥?5和￥?8)、呢？1、￥卩6、 NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。優(yōu)選的輪狀病毒抗原包括VP4(或切割產(chǎn)物VP5和VP8)及 VP7。
[0152] 細小病毒：病毒抗原可衍生自細小病毒，如細小病毒B19。細小病毒抗原選自： VP-1、VP-2、NS-1和NS-2。優(yōu)選的細小病毒抗原是衣殼蛋白VP-2。
[0153] S -肝炎病毒（HDV):病毒抗原可以是衍生的HDV，特別是HDV的S -抗原（參見 例如美國專利號5, 378, 814)。
[0154] 戊肝病毒（HEV):病毒抗原可衍生自HEV。
[0155] 庚肝病毒（HGV):病毒抗原可衍生自HGV。
[0156] 人皰疫病毒：病毒抗原可衍生自人皰疫病毒，如單純皰疫病毒（HSV)、水痘-帶 狀皰疹病毒（VZV)、EB病毒（EBV)、巨細胞病毒（CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒 7(HHV7)和人皰疹病毒8(HHV8)。人皰疹病毒抗原可選自：立即早期蛋白（a)、早期蛋白 (3 )和晚期蛋白（Y )。HSV抗原可衍生自HSV-I或HSV-2毒株。HSV抗原選自：糖蛋白gb、 gC、gD和gH、融合蛋白（gB)或免疫逃避蛋白（gC、gE或gl)。VZV抗原可選自核心、核衣殼、 外被膜或包膜蛋白?？缮唐坊彽肰ZV減毒活疫苗。EBV抗原可選自早期抗原（EA)蛋白、 病毒衣殼抗原（VCA)和膜抗原（M)的糖蛋白。CM抗原可選自衣殼蛋白、包膜糖蛋白（如 gB和gH)和外被膜蛋白。
[0157] 乳多空病毒：抗原可衍生自乳多空病毒，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒。乳頭瘤病毒包 括冊￥血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。冊乂 抗原優(yōu)選衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原選自：衣殼蛋白（LI)和（L2)或E1-E7或 其融合蛋白。優(yōu)選將HPV抗原配制成病毒樣顆粒（VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。 多瘤病毒抗原選自VP1、VP2或VP3。
[0158] 《疫苗》（Vaccines)，第四版，（Plotkin和Orenstein編，2004);《醫(yī)學微生物》 (Medical Microbiology)，第四版，（Murray 等編，2002);《病毒學》（Virology)，第三版， (W.K. Joklik 編，1988);《基礎(chǔ)病毒學》（Fundamental Virology)，第二版，（B.N. Fields 和 D. M. Knipe編，1991)也描述其它抗原、組合物、方法和微生物，本發(fā)明的組合物涵蓋了這些 抗原。
[0159] C.真菌抗原
[0160] 可用于本發(fā)明的真菌抗原是以下一種或多種真菌產(chǎn)生的抗原。
[0161] 真菌抗原可衍生自皮膚真菌，包括：絮狀表皮癬菌（Epidermophyton fIoccusum)、 頭癬小抱子菌（Microsporum audouini)、犬小抱子菌、扭曲小抱子菌（Microsporum distortum)、馬小孢子菌（Microsporum equinum)、石膏樣小孢子菌、矮小孢子菌 (Microsporum nanum)、同心發(fā)癬菌（Trichophyton concentricum)、馬發(fā)癬菌、雞發(fā)癬 菌（Trichophyton gallinae)、石膏樣發(fā)癬菌（Trichophyton gypseum)、麥格發(fā)癬菌 (Trichophyton megnini)、須發(fā)癬菌、昆克努發(fā)癬菌（Trichophyton quinckeanum)、紅色 發(fā)癬菌（Trichophyton rubrum)、舍恩萊發(fā)癬菌（Trichophyton schoenleini)、斷發(fā)癬菌 (Trichophyton tonsurans)、撫狀發(fā)癬菌（Trichophyton verrucosum)、撫狀發(fā)癬菌 album 變種（var. album)、discoides 變種（var. discoides)、ochraceum 變種（var. ochraceum)、 堇色發(fā)癬菌（Trichophyton violaceum)和 / 或蜜塊狀發(fā)癬菌（Trichophyton faviforme)。
[0162] 真菌病原體可衍生自：煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、黃曲霉（Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、 土曲 霉（Aspergillus terreus)、聚多曲霉（Aspergillus sydowi)、黃麴菌（Aspergillus flavatus)、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus)、頭狀芽生裂殖酵母（Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌（Candida albicans)、烯醇酶假絲酵母（Candida enolase)、 熱帶念珠菌（Candida tropicalis)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、克魯斯念 珠菌（Candida krusei)、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis)、類星形念珠 菌（Candida stellatoidea)、克魯斯念珠菌、（Candida parakwsei)、葡萄牙念珠菌 (Candida Iusitaniae)、假熱帶念珠（Candida pseudotropicalis)、吉利蒙德念珠 菌（Candida guilliermondi)、卡里翁分支抱子菌（Cladosporium carrionii)、粗球 抱子菌（Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatidis)、新型隱 球菌（Cryptococcus neoformans)、棒地霉（Geotrichum clavatum)、夾膜組織胞菜 菌（Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生 菌（Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市囊蟲（Pneumocystis carinii)、腐霉菌 (Pythiumn insidiosum)、瓶形酵母（Pityrosporum ovale)、釀酒酵母（Sacharomyces cerevisae)、布拉第酵母菌（Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母（Saccharomyces pombe)、尖端賽多抱子菌（Scedosporium apiosperum)、申克（氏）抱子絲菌（Sporothrix schenckii)、白色毛抱子菌（Trichosporon beigeIii)、鼠弓形體（Toxoplasma gondii)、馬 尼弗（氏）青霉菌（Penicillium marneffei)、鱗斑霉屬（Malassezia spp.)、產(chǎn)色芽生菌 屬（Fonsecaea spp.)、萬吉拉菌屬（Wangiella spp.)、抱子絲菌屬（Sporothrix spp.)、擔 子菌團屬（Basidiobolus spp.)、耳霉屬（Conidiobolus spp.)、根霉菌屬（Rhizopus spp)、 毛霉屬（Mucor spp)、犁頭霉屬（Absidia spp)、被孢霉屬（Mortierella spp)、小克銀漢霉 屬（Cunninghamella spp)、瓶霉屬（Saksenaea spp)、鏈格抱屬（Alternaria spp)、彎抱霉 屬（Curvularia spp)、長懦抱屬（Helminthosporium spp)、鎌抱菌屬（Fusarium spp)、曲霉 菌屬（Aspergillus spp)、青霉菌屬（Penicillium spp)、褐腐病菌屬（Monolinia spp)、絲 核菌屬（Rhizoctonia spp)、擬青霉屬（Paecilomyces spp)、皮司霉屬（Pithomyces spp) 和分支抱子菌屬（Cladosporium spp)。
[0163] 制備真菌抗原的方法是本領(lǐng)域熟知的（參見美國專利號6, 333, 164)。在一優(yōu)選方 法中，提取溶解組分，將其與真菌細胞的不可溶組分分開，其中基本上除去或至少部分除去 了細胞壁，該方法的特征在于包括以下步驟：獲得活的真菌細胞；獲得基本上除去或至少 部分除去細胞壁的真菌細胞；使基本上除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞破裂；獲得 不可溶組分；和提取溶解的組分并將其與不可溶組分分開。
[0164] D. STD 抗原
[0165] 本發(fā)明的組合物可包含衍生自性傳播疾?。⊿TD)的一種或多種抗原。這種抗原可 供預(yù)防或治療STD，如衣原體、生殖器皰疹、肝炎（如丙肝）、生殖器疣、淋病、梅毒和/或軟 下推（參見WO 00/15255)?？乖裳苌砸环N或多種病毒或細菌性STD。用于于本發(fā)明的 病毒STD抗原可衍生自，例如，HIV、單純皰疹病毒（HSV-1和HSV-2)、人乳頭瘤病毒（HPV)和 肝炎（HCV)病毒。用于于本發(fā)明的細菌STD抗原可衍生自，例如，淋病奈瑟球菌、肺炎衣原 體（Chlamydia pneumoniae)、砂沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜克雷嗜血桿菌、大腸桿菌和 無乳鏈球菌。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例子。
[0166] E.呼吸性抗原
[0167] 本發(fā)明的組合物可包含一種或多種衍生自引起呼吸道疾病的病原體的抗原。例 如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正粘病毒（流感）、肺病毒（RSV)、副粘病毒（PIV)、 麻疹病毒（麻疹）、披膜病毒（風疹）、VZV和冠狀病毒（SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起 呼吸道疾病的細菌，如肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、百日咳博德特菌、結(jié)核分支桿菌、肺炎支 原體、肺炎衣原體、炭疽桿菌和粘膜炎莫拉菌。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例 子。
[0168] F.兒科疫苗抗原
[0169] 本發(fā)明的組合物可包含適合用于兒科對象的一種或多種抗原。兒科對象一般年齡 小于約3歲，或小于約2歲，或小于約1歲。兒科抗原可在6個月、1年、2年或3年的時間 中多次給予。兒科抗原可衍生自靶向兒科群體的病毒和/或兒科群體易受感染的病毒。兒 科病毒抗原包括衍生自以下一種或多種病毒的抗原：正粘病毒（流感）、肺病毒（RSV)、副粘 病毒（PIV和腮腺炎）、麻疹病毒（麻疹）、披膜病毒（風疹）、腸病毒（脊髓灰質(zhì)炎）、HBV、 冠狀病毒（SARS)和水痘-帶狀皰疹病毒（VZV)、EB病毒（EBV)。兒科細菌抗原衍生自以下 一種或多種細菌的抗原：肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌、釀膿鏈球菌（A群鏈球菌）、粘膜炎 莫拉菌、百日咳博德特菌、金黃色葡萄球菌、破傷風梭菌（破傷風）、白喉棒狀桿菌（白喉）、 流感嗜血桿菌B (Hib)、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌（B群鏈球菌）和大腸桿菌。上文描述了 這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例子。
[0170] G.適合用于老年人和免疫力低下個體的抗原
[0171] 本發(fā)明的組合物可包含適合用于老年人和免疫力低下個體的一種或多種抗原。所 述個體可能需要更經(jīng)常接種疫苗，用較高劑量或含佐劑的制劑以增強對靶抗原的免疫反 應(yīng)。用于老年人和免疫力低下個體的抗原包括衍生自以下一種或多種病原體的抗原：腦膜 炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌（A群鏈球菌）、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黃 色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破傷風梭菌（破傷風）、白喉棒狀桿菌（白喉）、流感嗜血桿菌 B(Hib)、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團病桿菌、無乳鏈球菌（B群鏈球菌）、糞腸球菌、幽門螺桿 菌、肺炎衣原體、正粘病毒（流感）、肺病毒（RSV)、副粘病毒（PIV和腮腺炎）、麻疹病毒（麻 疹）、披膜病毒（風疹）、腸病毒（脊髓灰質(zhì)炎）、HBV、冠狀病毒（SARS)、水痘-帶狀皰疹病 毒（VZV)、EB病毒（EBV)、巨細胞病毒（CMV)。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例 子。
[0172] H.適合用于青少年疫苗的抗原
[0173] 本發(fā)明的組合物可包含合用于青少年對象的一種或多種抗原。青少年可能需要以 前給予的兒科抗原的加強免疫。上文描述了適合用于青少年的兒科抗原。此外，青少年可 能需要接受衍生自STD病原體的抗原以在開始性活動前確保具有保護性或治療性免疫力。 上文描述了適合用于青少年的STD抗原。
[0174] I.抗原制劑
[0175] 本發(fā)明的其它方面，提供了吸附抗原微粒的生產(chǎn)方法。該方法包括：(a)將含有以 下成分的混合物分散來提供乳液：（i)水，（ii)洗滌劑，（iii)有機溶劑和（iv)生物可降解 的聚合物，所述聚合物選自：聚（a-羥酸）、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚 氰基丙烯酸酯。與有機溶劑相比，混合物中存在的所述聚合物濃度通常約1 % -約30 %，而 根據(jù)洗滌劑-聚合物的重量比，混合物中存在的洗滌劑通常約為〇. 00001:1-約〇. 1:1 (更 常見是約 0.0001:1_ 約 0. 1:1，約 0.001:1_ 約 0. 1:1，或約 0.005:1-約 0. 1:1) ;(b)除去乳 液中的有機溶劑；和（C)將抗原吸附到微粒表面。在一些實施方式中，與有機溶劑相比，所 述生物可降解聚合物的存在濃度是約3% -約10%。
[0176] 可以用可滅菌、無毒和生物可降解的材料制備本文所用的微粒。這些材料包括但 不限于：聚（a-羥酸）、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。 本發(fā)明所用的微粒優(yōu)選源自聚U-羥酸），特別是聚（丙交酯）（"PLA"）或D，L丙交酯 和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯）（"PLG"或"PLGA"）或 D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。微?？稍醋苑肿恿坎煌娜魏尉酆掀鹗疾牧?，以共聚物，例 如PLG為例，各種丙交酯：乙交酯的比例（其選擇在很大程度上是個選擇問題）部分取決 于共同給予的大分子。下文將更詳細地討論這些參數(shù)。
[0177] 其它抗原還包括外膜囊泡（OMV)制品。
[0178] 其它配制方法和抗原（特別是腫瘤抗原）參見美國專利序列號09/581，772。
[0179] J.抗原參考文獻
[0180] 以下參考文獻包含可與本發(fā)明組合物聯(lián)合使用的抗原
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[0243] 63 國際專利申請 W000/56360.
[0244] 64 國際專利申請 W000/67161.
[0245] 以上引用的所有專利、專利申請和雜志論文的內(nèi)容通過引用全文納入本文。
[0246] 當采用糖或碳水化合物抗原時，優(yōu)選將其與載體蛋白偶聯(lián)以增強免疫原性。參 見 Ramsay 等（2001)Lancet 357 (9251):195-196 ;Lindberg(1999)Vaccine 17 增刊 2:S28_36;Buttery 和 Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34:163-168 ;Ahmad 和 Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13:113_133，vii;Goldblatt(1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567 ;歐洲專利 0 477 508 ;美國專利 5,306,492 ;W098/42721 ; Conjugate Vaccines (偶聯(lián)物疫苗）（Cruse 等編）ISBN 3805549326,具體是 10:48-114 ; Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶聯(lián)技術(shù)）ISBN:0123423368 或 012342335X。優(yōu)選的載體蛋白是細菌毒素或類毒素，如白喉或破傷風類毒素。特別優(yōu)選 CRM197白喉類毒素。
[0247] 其它載體多肽包括：腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白（EP-A-0372501)、合成肽 (EP-A-0378881 和 EP-A 0427347)、熱激蛋白（TO 93/17712 和 TO 94/03208)、百日咳蛋 白（TO 98/58668和EP A 0471177)、流感嗜血桿菌蛋白D(TO00/56360)、細胞因子（W0 91/01146)、淋巴因子、激素、生長因子、艱難梭菌毒素A或B(W0 00/61761)、鐵攝取蛋白（W0 01/72337)等等。當混合物包含血清群A和C的莢膜糖時，優(yōu)選MenA糖：MenC糖的比例（w/ w)大于1(如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高）?？蓪⒉煌桥c相同或不同類型的載體蛋白 偶聯(lián)。需要時可采用任何適合的偶聯(lián)反應(yīng)，和任何適合的接頭。
[0248] 如需要可脫毒有毒性的蛋白抗原，如用化學和/或遺傳方法脫毒百日咳毒素。
[0249] 藥學上可接受的運載體
[0250] 本發(fā)明的組合物除了上述組分外，通常包含一種或多種"藥學上可接受的運載 體"。包含的這些運載體本身不會誘導產(chǎn)生對接受此組合物個體有害的抗體。合適的運載 體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸 共聚物和脂質(zhì)聚集物（如油滴或脂質(zhì)體）。這類運載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。所述組 合物也可包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助劑，如濕潤或乳化劑、PH緩沖 劑等?？蓮?Gennaro(2000) "Remington:The Science and Practice of Pharmacy (雷明 頓：藥物科學與實踐）"第20版ISBN: 0683306472 -書中獲得關(guān)于藥學上可接受組分的全 面論述。
[0251] 免疫調(diào)節(jié)劑
[0252] 佐劑
[0253] 本發(fā)明的疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給予。具體說，該組合物通常包含佐劑。本 發(fā)明可用的佐劑包括但不限于以下的一種或多種：
[0254] A.含礦物質(zhì)的組合物
[0255] 適合用作本發(fā)明佐劑的含礦物質(zhì)組分包括礦物鹽，如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦 物鹽,如氫氧化物（如羥基氧化物）、磷酸鹽（如羥基磷酸鹽,正磷酸鹽）、硫酸鹽等（例如參 見Powell 和 Newman主編的"疫苗設(shè)計（Vaccine Design...) "，第 8和 9 章，ISBN: 030644867X 普萊納姆出版社（Plenum.))或不同礦物質(zhì)化合物的混合物（如磷酸鹽與氫氧化物佐劑的 混合物，任選磷酸鹽過量），這些化合物可采取任何合適的形式（如凝膠、晶體、無定形等）， 這些鹽優(yōu)選（具有）吸附性。也可將含礦物質(zhì)的組合物配制成金屬鹽顆粒（W0 00/23105)。
[0256] 本發(fā)明疫苗中可包含鋁鹽，Al3+的劑量在0. 2-1. Omg/劑之間。
[0257] 在一實施方式中，本發(fā)明所用的鋁鹽佐劑是明礬（硫酸鉀鋁AlK(SO4) 2),或者，例 如通過在磷酸緩沖液中混合抗原與鋁鹽，再用堿如氫氧化銨或氫氧化鈉滴定和沉淀原位形 成的明礬衍生物。
[0258] 本發(fā)明疫苗制劑可用的另一種鋁佐劑是氫氧化鋁（Al (OH)3)或結(jié)晶堿式氫氧化鋁 (A100H)，這是一種極佳吸附劑，表面積約500m2/g?；蛘撸捎煤辛姿峄鶊F替代了氫氧化 鋁佐劑中的一些或全部羥基的磷酸鋁佐劑（AlPO 4)或羥基磷酸鋁。本文提供的優(yōu)選磷酸鋁 佐劑是無定形的并可溶于酸性、堿性和中性介質(zhì)。
[0259] 在另一實施方式中，本發(fā)明的佐劑包含磷酸鋁和氫氧化鋁。在一更具體的實施方 式中，此佐劑的磷酸鋁含量高于氫氧化鋁，例如以重量計，磷酸鋁與氫氧化鋁之比為2:1、3 ; 1、4:1、5;1、6:1、7:1、8:1、9:1或高于9:1。更具體說，該疫苗所含的錯鹽為：每疫苗劑量 0. 4-1. Omg、或每疫苗劑量0. 4-0. 8mg、或每疫苗劑量0. 5-0. 7mg或每疫苗劑量約0. 6mg。
[0260] 一般通過優(yōu)化分子間的靜電吸引使抗原在所需pH時攜帶與佐劑相反的電荷，從 而能選擇優(yōu)選的鋁佐劑或多種鋁佐劑，例如磷酸鋁與氫氧化鋁之比。例如，PH 7. 4時磷酸 鋁佐劑（iep = 4)吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶標，則應(yīng)選擇氫氧化鋁佐 劑（iep 11. 4)?；蛘?，用磷酸預(yù)處理氫氧化鋁可降低其等電點，使其成為堿性更高的抗原的 優(yōu)選佐劑。
[0261] B.油-乳劑
[0262] 適合用作本發(fā)明佐劑的油-乳劑包括角鯊烯-水乳劑，如MF59 (5 %角鯊烯、0. 5% 吐溫? 80和0. 5 %司盤85，用微流化器制成亞微米顆粒）。參見W090/14837。也參見Podda， Vaccine (2001) 19:2673-2680 ;Frey 等，Vaccine (2003) 21:4234-4237。MF59 已用作 FLUADtm 流感病毒三價亞單位疫苗中的佐劑。
[0263] 本發(fā)明組合物中所用的特別優(yōu)選佐劑是亞微米水包油乳劑。本文所用的優(yōu)選亞 微米水包油乳劑是任選含有不同含量的MTP-PE的角鯊烯/水乳劑，例如含4-5% w/v角 鯊烯、0. 25-1. 0 % w/v吐溫80?(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯）和/或0. 25-1. 0%司 盤85?(失水山梨醇三油酸酯）和任選的N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺 基-L-丙氨酸-2- (1' -2' -二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基）-乙胺（MTP-PE)的 亞微米水包油乳劑，例如稱為"MF59"的亞微米水包油乳劑（國際公布號W090/14837 ;美 國專利號6, 299, 884和6, 451，325 ;和Ott等，"MF59 -人用疫苗的一種安全而強效佐劑 的設(shè)計與評估"（MF59-Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines)，刊于《疫苗設(shè)計：亞單位和佐劑方法》(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach) (Powell，M. F?和 Newman，M. J?編），普萊納姆出版社（Plenum Press)， 紐約，1995,第 277-296 頁）。MF59 含有 4-5% w/v 角鯊烯（如 4. 3% )、0? 25-0. 5% w/v 吐 溫?80和0. 5 % w/v司盤85?，并任選含有各種含量的MTP-PE，用微流化儀，例如110Y型微 流化儀（微射流公司（Microfluidics),牛頓市，馬薩諸塞州）配制成亞微米顆粒。例如， MTP-PE的含量可以是約0-500 ii g/劑，更優(yōu)選0-250 ii g/劑，最優(yōu)選0-100 ii g/劑。本文 所用的術(shù)語"MF59-0"指不含MTP-PE的以上亞微米水包油乳劑，而術(shù)語"MF59-MTP"表示含 有MTP-PE的制劑。例如，"MF59-100"含有100 ii g MTP-PE/劑，等等。MF69是本文所用的 另一種亞微米水包油乳劑，其含有4. 3% w/v角鯊烯、0. 25% w/v吐溫?80和0. 75% w/v司 盤85?和任選的MTP-PE。還有另一種亞微米水包油乳劑是MF75,也稱為SAF，其含有10% 角鯊烯、0. 4%吐溫?80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亞微米乳 齊[J。MF75-MTP 表示含有 MTP 的 MF75 制劑，例如 100-400 ii gMTP-PE/ 劑。
[0264] 國際公布號TO90/14837 ;美國專利號6, 299, 884和美國專利6, 451，325詳細描述 了用于組合物中的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑，例如胞壁酰肽。
[0265] 弗氏完全（CFA)和不完全佐劑（IFA)也可用作本發(fā)明的佐劑。
[0266] C.皂苷制劑
[0267] 皂苷制劑也適用作本發(fā)明佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根、甚至花 中發(fā)現(xiàn)的固醇糖苷和三廠系糖苷的異質(zhì)混合物（heterologous group)。阜樹（Quillaia saponaria Molina)樹皮中分離的阜苷是廣泛研究的佐劑。阜苷也可商品化購自麗花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜（sarsaprilla))、維花絲石竹（Gypsophilla paniculata) (婚紗花（brides veil))和肥阜草（Saponaria officianalis)(阜根（soap root))。阜苷 佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質(zhì)制劑，例如ISC0M。
[0268] 已利用高效薄層色譜（HP-LC)和反相高效液相色譜（RP-HPLC)純化皂苷組合物。 已經(jīng)鑒定了用這些技術(shù)專門純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。 皂苷優(yōu)選QS21。美國專利號5, 057, 540披露了 QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇， 例如膽固醇（參見W096/33739)。
[0269] 可聯(lián)用皂苷和膽固醇來形成稱為免疫刺激復(fù)合物（ISCOM)的獨特顆粒。ISCOM - 般還含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM 優(yōu)選含有 QuilA、QHA 和 QHC 中的一種或多種。EP0109942、W096/11711 和 W096/33739 進一 步描述了 ISCOM。ISCOM任選不含其它洗滌劑。參見W000/07621。
[0270] 開發(fā)阜苷佐劑的綜述可參見Barr等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32:247-271〇 也可參見 Sjolander 等，Advanced Drug Delivery Reviews (1998)32:321-338。
[0271] D.病毒體和病毒樣顆粒（VLP)
[0272] 病毒體和病毒樣顆粒（VLP)也適用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或 多種任選與磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白質(zhì)。它們通常無致病性、不能復(fù)制，通常不 含有任何天然病毒基因組?？芍亟M產(chǎn)生或從完整病毒分離病毒蛋白。適用于病毒體或VLP 中的這些病毒蛋白包括源自以下的蛋白質(zhì)：流感病毒（例如HA或NA)、乙肝病毒（例如 核心或衣殼蛋白）、戊肝病毒、麻疫病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病 毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP -噬菌體（例如外殼蛋白）、GA-噬 菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty (例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)。W003/024480、 TOOVO2448I ;Niikura 等，（2〇〇2)，Virology 293:273-280 ;Lenz 等，（2〇01)，J. Immunol 166(9) :5246-5355 ;Pinto 等，（2003)，J. Infect. Dis. 1M: 327-338 ;和 Gerber 等， (2001) ，J. Virol.邊（10) :4752-4760 進一步討論了 VLP。例如，Gluck 等，（2002)，Vaccine 迦:BlO-B16進一步討論了病毒體。鼻內(nèi)三價INFLEXAL?產(chǎn)品（Mischler和Metcalfe， (2002) Vaccine 20,增刊5:B17-B23)和INFLUVAC PLUS?產(chǎn)品中使用免疫增強型重建流感 病毒體（IRIV)作為亞單位抗原遞送系統(tǒng)。
[0273] E.細菌或微生物衍生物
[0274] 適合用于本發(fā)明的佐劑包括細菌和微生物衍生物，如：
[0275] (1)腸細菌脂多糖（LPS)的無毒衍生物
[0276] 這種衍生物包括單磷酰基脂質(zhì)A (MPL)和3-0-脫?；鵐PL (3dMPL)。3dMPL是含 有4、5或6條?；湹?脫-0-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的混合物。EP 0 689 454公開了 3 脫-0-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的優(yōu)選"小顆粒"形式。3dMPL的這種"小顆粒"足夠小從而可經(jīng) 0. 22 ii m膜無菌過濾（參見EP 0689454)。其它無毒的LPS衍生物包括單磷?；|(zhì)A模 擬物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。參見Johnson等，（1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2273-2278。
[0277] (2)脂質(zhì)A衍生物
[0278] 脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌（Escherichia coli)的脂質(zhì)A衍生物，例如0M-174。 0M-174 描述于，例如 Meraldi 等（2003) Vaccine 21:2485-2491 ;和 Pajak 等（2003) Vaccine 21:836-842。
[0279] (3)免疫刺激寡核苷酸
[0280] 適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序（含有通過磷酸鍵 與隨后的鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的序列）的核苷酸序列。含有回文或聚（dG)序列的 細菌雙鏈RNA或寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。
[0281] CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾并且可以是雙鏈或單鏈?？?任選用類似物，例如2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷?？赡艿念愃莆锶〈蓞⒁奒andimalla 等，（2003)，Nucleic Acids Research.H(9) :2393-2400 ;W002/26757 和 W099/62923。 Krieg，（2003)，Nat. Med. 9(7):831-835 ;McCluskie 等，（2002)，F(xiàn)EMS Immunology and Medical Microbiology?拉:179-185 ;W098/40100 ;美國專利號 6, 207, 646 ;美國專利號 6, 239, 116和美國專利號6, 429, 199進一步討論了 CpG寡核苷酸作為佐劑的作用。
[0282] CpG 序列可涉及 TLR9,例如基序 GTCGIT 或 ITCGIT。參見 Kandimalla 等（2003) Biochemical Society Transactions. 31(部分 3):654_658。654-658. CpG 序列，例 如CpG-A ODN可特異性誘導Thl免疫應(yīng)答，或者，例如CpG-B ODN可更特異地誘導B細 胞應(yīng)答。Blackwell 等（2003) J. Immunol. 170(8) :4061-4068 ;Krieg(2002)TRENDS in Immunol. 23(2) :64-65;和WO 01/95935討論了 CpG-A和CpG-B ODN15CpG優(yōu)選是CpG-A 0DN。
[0283] 優(yōu)選將CpG寡核苷酸構(gòu)建為5'端易于為受體識別。任選將兩條CpG寡核苷酸序 列在它們的3'端相連以形成"免疫聚體"（immunomer)。參見，例如Kandimalla等（2003) BBRC 306:948-953 ;Kandimalla 等（2003)Biochemical Society Transactions. 31 (部分 3):664-658 ;Bhagat 等（2003)BBRC 300:853-861 ;和 TO03/035836。
[0284] (4) ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物
[0285] 細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。蛋白質(zhì)優(yōu)選源自 大腸桿菌（即，大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"LT"）、霍亂（弧菌）（"CT"）或百日咳（桿菌） ("PT")。W095/17211中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，W098/42375中 描述了將其用作胃腸道外佐劑。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LTR192G。 ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用見以下 參考文獻：Beignon 等，Infection and Immunity (2002) 70 (6): 3012-3019 ;Pizza 等， Vaccine (2001) 19:2534-2541 ;Pizza 等，Int.J. Med. Microbiol (2000) 290 (4-5) :455-461 ; Scharton-Kersten 等，Infection and Immunity(2000)68(9) :5306-5313 ;Ryan 等， Infection and Immunity (1999) 67 (12) : 6270-6280 ;Partidos 等，Immunol.Lett. (1999)67(3) :209-216 ;P印poloni 等，Vaccines (2003) 2 (2) :285-293 和 Pine 等，（2002) J. Control Release (2002) 85 (1-3) : 263-270。氨基酸取代的數(shù)字基準優(yōu)選以 Domenighini 等，Mol. Microbiol (1995) 15 (6) : 1165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列 對比為基礎(chǔ)。
[0286] F.生物粘合劑和粘膜粘合劑
[0287] 生物粘合劑（bioadhesive)和粘膜粘合劑（mucoadhesive)也可用作本發(fā) 明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球（Singh等，（2001)J.Cont. Release. 70:267-276)，或者粘膜粘合劑，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多 糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑。參見 W099/27960。
[0288] G?微粒
[0289] 微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。可從生物可降解和無毒的材料（例如，聚（a-羥 酸）、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等），優(yōu)選用聚（丙交酯-共_乙交酯）形成 微粒（即，直徑約IOOnm到150 Ii m，優(yōu)選約200nm到約30 Ii m，最優(yōu)選約500nm到約10 Ii m 的顆粒），任選將這些微粒處理成帶負電的表面（例如，用SDS)或帶正電的表面（例如，用 陽離子洗滌劑，如CTAB)。
[0290] H.脂質(zhì)體
[0291] 適合用作本發(fā)明佐劑的脂質(zhì)體制劑例子描述于美國專利6, 090, 406;美國專利 5, 916, 588 和 EP 0 626 169。
[0292] I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑
[0293] 適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯（參見，例如W099/52549)。 W099/52549.這種制劑還包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇 (W001/21207)以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如 辛苯糖醇（W0 01/21152)的混合物。
[0294] 優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬 脂酰基（steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂?；?、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂 醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
[0295] J.聚磷腈（PCPP)
[0296] PCPP 制劑描述于，例如 Andrianov 等，"Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions (通過凝聚聚憐臆水溶液制備 水凝膠微球），'，Biomaterials (1998) 19 (1-3) : 109-115 和 Payne 等，"Protein Release from Polyphosphazene Matrices (聚憐臆基質(zhì)的蛋白質(zhì)釋放）"，Adv. Drug. Delivery Review(1998)31(3):185-196〇
[0297] K?胞壁酰肽
[0298] 適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；鵢胞壁酰-L-蘇氨酰 基-D-異谷氨酰胺（thr-MDP)、N-乙?；?去甲胞壁酰（normuramyl) -L-丙氨?；?D-異 谷氨酰胺（去甲-MDP)和N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺-L-丙氨 酸-2- (1' -2' -二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基）-乙胺（MTP-PE)。
[0299] L.咪唑并喹啉化合物
[0300] 適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特（Imiquimod)及 其類似物，其描述參見 Stanley，Clin Exp Dermatol (2002) 27 (7) :571-577 Jones，Curr Opin Investig Drugs (2003) 4 (2) :214-218和美國專利 4, 689, 338、5, 389, 640、5, 268, 376、 4, 929, 624、5, 266, 575、5, 352, 784、5, 494, 916、5, 482, 936、5, 346, 905、5, 395, 937、 5, 238, 944 和 5, 525, 612。
[0301] M.縮氨基硫脲化合物
[0302] 所有適合用作本發(fā)明佐劑的縮氨基硫脲化合物的例子以及配制、制備和篩選這種 化合物的方法包括WO 04/60308所述的。縮氨基硫脲在刺激人外周血單核的細胞產(chǎn)生細胞 因子，例如TNF- a中特別有效。
[0303] N.色胺酮化合物
[0304] 所有適合用作本發(fā)明佐劑的色胺酮化合物的例子以及配制、制備和篩選這種化合 物的方法包括WO 04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血單核的細胞產(chǎn)生細胞因 子，例如TNF-a中特別有效。
[0305] 本發(fā)明還包括以上鑒定和一種或多種佐劑的組合。例如，以下佐劑組合物可用于 本發(fā)明：
[0306] (1)皂苷和水包油乳劑（W099/11241);
[0307] (2)皂苷（例如QS21) +無毒的LPS衍生物（例如3dMPL)(參見W094/00153);
[0308] (3)皂苷（例如QS21) +無毒的LPS衍生物（例如3dMPL) +膽固醇；
[0309] (4)皂苷（例如 QS21) +3dMPL+IL-12 (任選 + 固醇）（W098/57659);
[0310] (5)聯(lián)用3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑混合物（參見歐洲專利申請0 835 318 ;0 735 898 和 0 761 231);
[0311] (6)54?，含10%角鯊?fù)椤?.4%吐溫80、5%普流羅尼嵌段聚合物1121和讓1-1--， 微流化形成亞微米乳劑或渦旋形成較大粒徑的乳劑。
[0312] (7) RIBI? 佐劑系統(tǒng)（RAS)，（Ribi 免疫化學公司（Ribi Immunochem))，其含有 2 % 角鯊烯、0. 2%吐溫80和一種或多種由單磷酸酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯（TDM)和 細胞壁骨架（CWS)，優(yōu)選MPL+CWS (Detox?)組成的細菌細胞壁組分；和
[0313] (8) -種或多種無機鹽（例如鋁鹽）+無毒性LPS衍生物（例如3dMPL)。
[0314] (9) 一種或多種無機鹽（例如鋁鹽）+免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸（例如包含CpG基序的 核苷酸序列）。
[0315] 0.人免疫調(diào)節(jié)劑
[0316] 適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細胞因子，如白介素（如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等）、干擾素（如干擾素-Y )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤 壞死因子。
[0317] 可注射的流感疫苗采用的優(yōu)選佐劑是鋁鹽和MF59。粘膜遞送疫苗采用的優(yōu)選佐劑 是細菌毒素和生物粘合劑。
[0318] 以上引用的所有專利、專利申請和雜志論文的內(nèi)容通過引用全文納入本文。
[0319] 治療方法
[0320] 本發(fā)明提供的上述組合物可用于治療。本發(fā)明提供的上述組合物可誘導或增強對 釀膿鏈球菌的免疫反應(yīng)。本發(fā)明提供用上述組合物誘導或增強對釀膿鏈球菌的免疫反應(yīng) 的方法。免疫反應(yīng)優(yōu)選為保護性，包括抗體和/或細胞介導免疫力（包括全身和粘膜免疫 力）。免疫反應(yīng)包括增強反應(yīng)。
[0321] 青少年和兒童，包括學步兒童和嬰兒可接受預(yù)防用疫苗，而治療疫苗通常給予青 少年和成人。兒童疫苗也可給予成人，例如評估其安全性、劑量、免疫原性等。
[0322] 可按照本發(fā)明預(yù)防或治療釀膿鏈球菌引起的疾病，包括但不限于：咽炎（如鏈球 菌扁桃體炎）、猩紅熱、小膿皰疹、丹毒、蜂窩組織炎、敗血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋 膜炎和后遺癥，如風濕熱和急性腎小球腎炎。該組合物對其它鏈球菌，如GBS也有效。
[0323] 檢測免疫反應(yīng)效果的試驗
[0324] 一種評估治療性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測GSA感染。一種評 估預(yù)防性治療效果的方法涉及在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測對該組合物中突變型SLO蛋白 的免疫反應(yīng)。
[0325] 另一種評估本發(fā)明免疫原性組合物中組分蛋白的免疫原性的方法是重組表達突 變型SLO蛋白并通過免疫印跡篩檢患者的血清或粘膜分泌物。該蛋白與患者血清之間發(fā)生 陽性反應(yīng)表明該患者已對所述蛋白產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，即所述蛋白為免疫原。也可用此法鑒 定免疫優(yōu)勢蛋白和/或抗原表位。
[0326] 另一種核查治療性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測GSA感染。一種 核查預(yù)防性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后全身性（如監(jiān)測IgGl和IgG2a的產(chǎn) 生水平）和粘膜性（如監(jiān)測IgA的產(chǎn)生水平）監(jiān)測抗SLO的免疫反應(yīng)。血清特異性抗體反 應(yīng)通常在免疫后但攻擊前檢測，而粘膜特異性抗體反應(yīng)在免疫后和攻擊后檢測。
[0327] 可在給予宿主，如人前用體外和體內(nèi)動物模型評價本發(fā)明疫苗組合物。特別有用 的小鼠模型包括先腹膜內(nèi)免疫小鼠，然后腹膜內(nèi)攻擊或經(jīng)鼻攻擊的那些。
[0328] 也可在體內(nèi)確定本發(fā)明免疫原性組合物的功效，方法是用免疫原性組合物免疫動 物模型（如豚鼠或小鼠）并確定GAS攻擊后獲得的保護水平。
[0329] 體內(nèi)效力模型包括但不限于：（i)采用人GAS血清型的小鼠感染模型；（ii)采用 小鼠適應(yīng)GAS菌株，如在小鼠中特別有毒性的M23菌株的小鼠患病模型；（iii)采用人GAS 分離株的靈長動物模型。
[0330] 免疫反應(yīng)可以是THl免疫反應(yīng)和TH2免疫反應(yīng)之一或兩者。免疫反應(yīng)可能是改善 的或增強的或改變的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以是全身和粘膜免疫反應(yīng)之一或二者。優(yōu)選的 免疫反應(yīng)是增強的全身和/或粘膜反應(yīng)。
[0331] 提高的全身和/或粘膜免疫表現(xiàn)為提高的THl和/或TH2免疫反應(yīng)。增強的免疫 反應(yīng)優(yōu)選包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA產(chǎn)生增多。
[0332] 粘膜免疫反應(yīng)優(yōu)選是TH2免疫反應(yīng)。粘膜免疫反應(yīng)優(yōu)選包括IgA產(chǎn)生增多。
[0333] 活化的TH2細胞提高抗體產(chǎn)量，因而在應(yīng)對胞外感染時有價值。活化的TH2細胞 可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一種或多種。TH2免疫反應(yīng)可導致產(chǎn)生IgGl、IgE、 IgA和記憶B細胞，用于將來的保護作用。
[0334] TH2免疫反應(yīng)可包括與TH2免疫反應(yīng)相關(guān)的一種或多種細胞因子（例如IL-4、 IL-5、IL-6和IL-10)增加，或者IgGl、IgE、IgA和記憶B細胞產(chǎn)量增加中的一種或多種現(xiàn) 象。增強的Th2免疫反應(yīng)優(yōu)選包括IgGl產(chǎn)生增加。
[0335] THl免疫反應(yīng)可包括CTL中的一種或多種增加，與THl免疫反應(yīng)相關(guān)的細胞因子 (例如IL-2、IFN Y和TNFP )中一種或多種的增加，活化巨噬細胞的增加，NK活性增加，或 IgG2a產(chǎn)量增加。增強的THl免疫反應(yīng)優(yōu)選包括IgG2a產(chǎn)量的增加。
[0336] 本發(fā)明的免疫原性組合物，具體說，含本發(fā)明一種或多種突變型SLO蛋白的免疫 原性組合物可單獨使用或與其它GAS抗原聯(lián)用，任選與能引發(fā)Thl和/或Th2反應(yīng)的免疫 調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。
[0337] 本發(fā)明還包括含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，如礦物鹽（如鋁鹽）和含CpG基序的 寡核苷酸的免疫原性組合物。最優(yōu)選，該免疫原性組合物同時包含鋁鹽和含CpG基序的寡 核苷酸?；蛘?，該免疫原性組合物包含ADP核糖基化毒素（如脫毒的ADP核糖基化毒素） 和含CpG基序的寡核苷酸。優(yōu)選的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑包括佐劑。佐劑可選用THl佐劑 和TH2佐劑中的一種或多種。
[0338] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選能引發(fā)細胞介導免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)二者，以有效應(yīng)對 GAS感染。這種免疫應(yīng)答宜誘導產(chǎn)生長效（如中和性）抗體和在接觸一種或多種GAS抗原 后能快速反應(yīng)的細胞介導免疫力。
[0339] 在一特別優(yōu)選的實施方式中，該免疫原性組合物包含能引發(fā)中和抗體反應(yīng)的一種 或多種突變型SLO蛋白，和能引發(fā)細胞介導免疫反應(yīng)的一種或多種突變型SLO蛋白。以此 方法，中和抗體能防止或抑制最初的GAS感染，而細胞介導免疫反應(yīng)能引發(fā)增強的Thl細胞 反應(yīng)以防止GAS感染進一步擴散。
[0340] 通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者?？赏ㄟ^各種不同途徑單獨或作為組合物的 一部分給予本發(fā)明組合物。某些途徑對某些組合物可能更有利益，因為可產(chǎn)生更有效的免 疫反應(yīng)，優(yōu)選CMI反應(yīng)，或誘導副作用可能性較低，或較容易給藥。
[0341] 遞送方法包括：胃腸外注射（如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙注射） 和經(jīng)直腸、口服（如藥片、噴霧）、經(jīng)陰道、局部、經(jīng)皮（如參見W099/27961)、透皮（如參見 W002/074244和W002/064162)、鼻內(nèi)（如參見W003/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜 途徑給予。
[0342] 例如，本發(fā)明的組合物可通過全身途徑或粘膜途徑或經(jīng)皮途徑給予，或可直接給 予特定組織。本文所用的術(shù)語"全身給予"包括但不限于任何胃腸外途徑給藥。具體說，胃 腸道外給藥包括但不限于：皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或胸骨內(nèi)注射，靜脈內(nèi)、動 脈內(nèi)或腎透析灌注技術(shù)。優(yōu)選的全身性、胃腸外給藥是肌肉內(nèi)注射。本文所用的術(shù)語"粘膜 給予"包括但不限于：口服、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腸和眼部給藥。
[0343] 治療劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。初次免疫方案和/或加強免疫方案可 采用多劑量。在多劑量方案中，通過相同或不同途徑給予不同劑量，例如胃腸外初免和粘膜 加強，粘膜初免和胃腸外加強，等等。
[0344] 可將本發(fā)明組合物制成各種劑型。例如，可將組合物制成可注射的液體溶液或懸 浮液。還可以制備適合在注射前用液體運載體配制成溶液或懸浮液的固體劑型（如凍干的 組合物）?？芍苽淇诜o藥的組合物，如片劑或膠囊、噴霧劑，或糖漿（任選加入調(diào)味劑）。 可制備肺部給藥的組合物，如吸入劑，采用細粉或噴霧劑?？蓪⒔M合物制備成栓劑或陰道 栓?？芍苽浔遣俊⒍炕蜓鄄拷o藥的組合物，例如滴劑。組合物可以是試劑盒形式，如此設(shè) 計使得在給予患者之前可重建成合并的組合物。這種試劑盒裝有液體形式的一種或多種突 變型SLO和其它抗原及一種或多種凍干抗原。
[0345] 用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的突變型SLO或其它抗原（或編碼該 抗原的核酸分子），以及需要的其它組分，如抗生素。"免疫有效量"是以單劑量或一系列劑 量的一部分給予個體時能增強可測定的免疫反應(yīng)或防止或減少臨床癥狀的用量。
[0346] 本發(fā)明的免疫原性組合物可與抗生素治療方案組合給予。在一實施方式中，給予 抗生素然后給予本發(fā)明的抗原，或包含本發(fā)明的一種或多種突變型SLO蛋白的組合物。
[0347] 在另一實施方式中，先給予本發(fā)明的突變型SLO蛋白然后給予抗生素。適合用于 治療GAS感染的抗生素包括但不限于：青霉素或其衍生物,或克林霉素、先鋒霉素、糖肽類 (如萬古霉素）和環(huán)絲氨酸。
[0348] 然而，該組合物中活性藥物的含量可以不同，取決于所治療個體的健康和生理狀 況、年齡、所治療個體的物種分類（如非人靈長動物，靈長動物等）、個體的免疫系統(tǒng)合成抗 體的能力、所需的保護程度、疫苗制劑、治療醫(yī)師對醫(yī)學狀況的評估和其它相關(guān)的因素。此 用量落在可通過常規(guī)試驗確定的較廣泛范圍內(nèi)。
[0349] 試劑盒
[0350] 本發(fā)明還提供裝有本發(fā)明組合物的一個或多個容器的試劑盒。組合物可以是液體 形式或凍干形式，可以是各個抗原。組合物的合適容器包括，例如瓶子，小藥瓶，針筒和試 管。可用各種材料，包括玻璃或塑料制備容器。容器可配備無菌的入口（例如，容器可以是 裝有皮下注射針頭可刺破塞子的靜脈內(nèi)輸液袋或小藥瓶）。
[0351] 該試劑盒也可裝有包含藥學上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水、林格液或葡萄 糖液的第二容器。也可裝有終末用戶所用的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋液、過濾器、針 頭和針筒。該試劑盒還可裝有含另一活性藥物，如抗生素的第二或第三容器。
[0352] 該試劑盒也可裝有書面的包裝插頁，說明誘導抗釀膿鏈球菌免疫力或治療釀膿鏈 球菌感染的方法。該包裝說明書可以是未經(jīng)批準的草稿插頁或可以是經(jīng)食品藥物管理局 (FDA)或其它管理當局批準的包裝插頁。
[0353] 本文引用的所有專利、專利申請和參考文獻專門通過引用納入本文。以上公開內(nèi) 容已總體上描述了本發(fā)明。參考以下具體實施例可獲得更全面的理解，提供實施例的目的 只是說明而非限制本發(fā)明的范圍。
[0354] 實施例1.
[0355] 野生型和突變型SLO蛋白的克隆
[0356] 用表1所示SF370基因組的引物通過PCR擴增野生型和突變型SLO蛋白的編碼基 因。
[0357] 用NheI-XhoI消化PCR產(chǎn)物，再與用相同酶切割的pet24b+ (諾瓦基公司 (Novagen))載體連接。用連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a電感受態(tài)細胞。加入LBPTK培養(yǎng) 基，以250rpm振蕩在37°C培育1小時后將細菌鋪放到含50 ii g/ml卡那霉素的LBPTK平板 上。通過集落PCR鑒定陽性菌落。
[0358] 在含50 ii g/ml卡那霉素的LBPTK培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從其中制備陽性菌落的質(zhì) 粒，并通過DNA測序分析，分析證實了在17聚合酶啟動子控制下的預(yù)期的插入基因?？寺?基因的最終DNA序列和蛋白質(zhì)序列顯不在序列表中。參見表2。
[0359] 表 L
[0360]
【權(quán)利要求】
1. 一種純化的突變型鏈球菌溶血素0(SLO)蛋白，其在氨基酸位置A248包含氨基酸改 變，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO: 1編號，且其中所述突變型SL0蛋白的溶血活性相 比野生型SL0降低至少50%。
2. 如權(quán)利要求1所述的純化的突變型SL0蛋白，其還包含氨基酸位置C530的氨基酸改 變。
3. 如權(quán)利要求1所述的純化的突變型SL0蛋白，其中A248的氨基酸改變是缺失。
4. 如權(quán)利要求2所述的純化的突變型SL0蛋白，其中A248的氨基酸被亮氨酸取代， C530的氨基酸被甘氨酸取代。
5. 如權(quán)利要求1所述的純化的突變型SL0蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
6. 如權(quán)利要求1所述的純化的突變型SLO蛋白，其特征在于，該蛋白偶聯(lián)于載體蛋白。
7. 如權(quán)利要求6所述的純化的突變型SL0蛋白，其特征在于，所述載體蛋白選自：細菌 毒素、細菌類毒素、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、熱激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血桿菌蛋白D、 細胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、艱難梭菌毒素 A、艱難梭菌毒素 B和鐵攝取蛋白。
8. 編碼權(quán)利要求1-5中任一項所述的突變型SL0蛋白的核酸分子。
9. 如權(quán)利要求8所述的核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO: 58。
10. -種疫苗組合物，其包含： (a) 選自以下的活性劑： (i) 權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白；和 (ii) 編碼權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白的核 酸分子；和 (b) 藥學上可接受的運載體。
11. 如權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，其特征在于，該組合物還包含一種或多種選自 下組的活性劑： (a) GAS抗原；和 (b) 編碼GAS抗原的核酸分子。
12. 如權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，其特征在于，該組合物還包含兒童疫苗所用的 活性劑。
13. 如權(quán)利要求12所述的疫苗組合物，其特征在于，所述活性劑選自： (a) 選自以下的病原體的多肽抗原：腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、百日咳博德特菌、 粘膜炎莫拉菌、破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒、 腮腺炎病毒、風疹病毒和輪狀病毒多肽抗原；和 (b) 編碼所述多肽抗原的核酸分子。
14. 如權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，其特征在于，該組合物還包含用于老年人或免 疫力低下個體疫苗的第二種活性劑。
15. 如權(quán)利要求14所述的疫苗組合物，其特征在于，所述第二種活性劑選自下組： (a) 選自以下的病原體的多肽抗原：糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠 假單胞菌、嗜肺軍團病桿菌、單核細胞增多癥李斯特菌、流感病毒和副流感病毒多肽抗原； 和 (b) 編碼所述多肽抗原的核酸分子。
16. 有效量的疫苗組合物在制備治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的藥物中的應(yīng)用，該疫苗 組合物包含： (a) 選自以下的活性劑： (i) 權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白；和 (ii) 編碼權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白的核 酸分子；和 (b) 藥學上可接受的運載體。
17. 如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗組合物還包含一種或多種選自 下組的活性劑： (a) GAS抗原；和 (b) 編碼GAS抗原的核酸分子。
18. -種試劑盒，其包括： (a) 含有如權(quán)利要求10-15中任一項所述疫苗組合物的容器；和 (b) 用所述組合物治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的說明書。
19. 一種制備預(yù)防或治療釀膿鏈球菌感染的疫苗的方法，所述方法包括混合： (a) 選自以下的活性劑： (i) 權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白；和 (ii) 編碼權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白的核 酸分子；和 (b) 藥學上可接受的運載體。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述活性劑是純化的突變型SL0蛋白，所 述突變型SL0蛋白通過以下方法制備，該方法包括： (a) 培養(yǎng)含編碼所述突變型SL0蛋白的表達構(gòu)建物的宿主細胞；和 (b) 回收突變型SL0蛋白。
21. 如權(quán)利要求19所述的方法，還包括將藥學上可接受的運載體與一種或多種選自下 組的活性劑組合： (a) GAS抗原；和 (b) 編碼GAS抗原的核酸分子。
22. 活性劑在制造治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述活性劑選自： (a) 權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白；和 (b) 編碼權(quán)利要求1-5中任一項定義的純化的突變型鏈球菌溶血素 O(SLO)蛋白的核酸 分子。
23. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的純化的突變型SL0蛋白或如權(quán)利要求8或9所述 的核酸分子在制備作為疫苗的藥物中的應(yīng)用。
24. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的純化的突變型SL0蛋白、如權(quán)利要求8或9所述的 核酸分子、或如權(quán)利要求10-14中任一項所述的疫苗組合物在制備治療或預(yù)防釀膿鏈球菌 感染的藥物中的應(yīng)用。
25. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化的突變型SL0蛋白或如權(quán)利要求10-14中任 一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述突變型SL0蛋白還包括以下一種或多種： (a) C530取代為甘氨酸； (b) D482取代為天冬酰胺； (c) P427取代為亮氨酸、甘氨酸、賴氨酸或谷氨酸；和/或 (d) W535取代為苯丙氨酸。
【文檔編號】A61K38/16GK104292312SQ201410460591
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月21日
【發(fā)明者】G·本斯, I·馬格里特伊若斯, E·恰洛特, G·格蘭迪, M·斯卡塞利 申請人:諾華股份有限公司