一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法，該方法包括以下步驟：（1）竹蓀多糖的提??；（2）竹蓀多糖的分離；（3）竹蓀多糖的純化；（4）在竹蓀多糖溶液中加入無機鋅源進行螯合反應；（5）醇沉（6）冷凍干燥，得竹蓀多糖-鋅螯合物。本發(fā)明所研制的竹蓀多糖-鋅螯合物，有效應用于補鋅保健品及藥品的制備，且通過MTT法、流式細胞術、Hoechst33258染色法、DNALadder及JC-1染色法實驗證明該螯合物具有明顯的抗腫瘤生理活性，有望成為治療癌癥尤其是肝癌的高效低毒藥劑。
【專利說明】一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤物質的制備方法及其應用，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]鋅是人體必須的微量元素，是人體200種金屬酶的組成成分或輔酶，對全身代謝都有廣泛作用，如參與能量代謝、核酸和蛋白質的合成、細胞與體液免疫過程等。機體缺鋅會導致基礎代謝下降、蛋白質利用率降低、食欲與消化功能低下、影響生長發(fā)育等。而以往和現(xiàn)在臨床上補鋅多用硫酸鋅和單純葡萄糖酸鋅等制劑，它們絕大部分在體內以離子形式吸收。鋅離子一方面容易與膳食中的植酸、草酸、脂肪酸等物質結合，容易生成不溶物而導致大量流失；另一方面受結合蛋白不足等因素影響，吸收率低。
[0003]糖類是自然界中分布最為廣泛的生物分子之一，是組成有機體結構的主要成分，也是細胞能量的最主要來源。糖類尤其是多糖，具有大量的活性基團、多樣化的分子量和多變的化學組成，具有其他材料無可比擬的優(yōu)勢:生物相容性、生物可降解性、無細胞毒性等等。此外，多糖還可以通過與其他生物分子如蛋白質、核酸等分子相互作用傳遞識別過程，部分多糖分子還具有調節(jié)免疫力、抗腫瘤、促進腫瘤細胞凋亡等生物活性。多糖配合物作為補鋅劑不僅具有合適的配合穩(wěn)定性，對胃腸道無或甚少刺激作用，而且當其釋放鋅后，配體多糖就可以發(fā)揮其多方面的生理活性。
[0004]竹蓀也叫竹參、竹雞蛋或面紗菌，也被稱為“真菌之花”、“山珍之王”，是世界上名貴的大型食用菌之一。竹蓀多糖廣泛存在于子實體的細胞壁中，是具有高活性的大分子物質，在抗腫瘤、抗凝血、抗炎癥、刺激免疫以及降血糖方面都有一定的保健作用，對病毒感染性疾病也有一定的抑制作用。竹蓀多糖主要的生理功能有:(1)調節(jié)免疫功能；(2)抑制腫瘤和癌細胞作用；⑶延緩衰老的作用；⑷抑菌作用；(5)降血糖、降血脂的作用；(6)對肝臟的保護作用；(7)抗誘變作用。
[0005]為了大力開發(fā)利用竹蓀資源及提供一種高效的補鋅劑，我們提取竹蓀多糖并分離純化后和鋅離子螯合。竹蓀多糖-鋅螯合物不僅是一種高效的補鋅劑，其還具有很高的抗腫瘤活性，在用于補鋅劑保健品及藥品制備的同時，還有望成為治療癌癥的高效低毒藥劑。
[0006]有關多糖-鋅螯合物的研究目前甚少。目前公開的中國專利中與多糖-鋅螯合物相關的專利只有一個:中國專利申請公布號CN 102351959A中公開了 “首烏藤多糖螯合鋅的制備方法及應用”，該專利中涉及的是首烏藤多糖-鋅螯合物增強機體免疫力的作用。
[0007]綜上所述，有關多糖-鋅螯合物抗腫瘤活性的報道目前尚無。本發(fā)明人以竹蓀為原料，提取竹蓀多糖并分離純化后與無機鋅源進行螯合，經醇沉，洗滌，制備具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物。本發(fā)明原料豐富，方法簡單，制得的產品安全性高，可大量生產，在作為補鋅劑的同時還具有極高的抗腫瘤活性，可發(fā)展成為治療癌癥尤其是肝癌的高效低毒藥劑。
【發(fā)明內容】
[0008]本發(fā)明的目的在于通過竹蓀多糖與無機鋅鹽的螯合制備出具有抗腫瘤活性的補鋅劑，為相關抗癌藥物的開發(fā)提供一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法。
[0009]一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法，包括如下步驟:
[0010](1)竹蓀多糖的提取:將干燥的竹蓀子實體粉碎后，沸水浴提取多糖，濃縮，真空冷凍干燥；
[0011](2)竹蓀多糖的分離:用Sevage法對竹蓀多糖除蛋白后，加入乙醇，3000?6000r/min離心10?20min,棄去上清液,將沉淀溶解于蒸懼水，重復3?5次，將得到的溶液冷凍干燥，得到竹蓀多糖；
[0012](3)竹蓀多糖的純化:把步驟(2)得到的竹蓀多糖溶于水，用DEAE-52纖維素離子交換層析柱純化，以0.05?2mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，再用S印hadex G-200葡聚糖凝膠色譜柱純化，以0.05?2mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到螯合用的竹蓀多糖；
[0013](4)在竹蓀多糖溶液中加入無機鋅源進行螯合反應:將無機鋅鹽溶于蒸餾水配成1?3mg/mL的溶液，用0.5?2mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH 2.0?3.0，使無機鋅鹽充分溶解，再按多糖與無機鋅鹽質量比為1:1?1:3加入3?5mg/mL的竹蓀多糖溶液，漩渦混勻，用5%?10%的氨水溶液調節(jié)pH 8.0?10.0，溫度保持在45?65°C下震蕩反應36?50h ；
[0014](5)將反應液濃縮后加入3?5倍體積的無水乙醇將產物沉淀出來，抽濾，用60 %?80 %的乙醇洗滌，沉淀，最后用無水乙醇洗滌，沉淀。
[0015](6)冷凍干燥，得竹蓀多糖-鋅螯合物。
[0016]上述方法中，步驟(2)所述Sevage試劑的配制方法為氯仿、正丁醇按體積比3:1?5:1混合,Sevage法脫蛋白的方法為多糖與Sevage試劑按體積比1:1?1:3混合，振搖10?30min, 2000?4000r/min離心10?20min,取出上層多糖溶液,再按上述步驟重復3?5次。
[0017]上述方法中，步驟(5)所述醇沉，洗滌次數(shù)為3?5次。
[0018]上述方法中，所述無機鋅鹽包括ZnCl2或ZnS04中的一種以上。
[0019]所述竹蓀多糖-鋅螯合物應用于肝癌藥物的制備。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0021]1、本發(fā)明公布的具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物經過醇沉，洗滌后已經除去了沒有螯合上的鋅離子，且通過MTT法和配體竹蓀多糖對腫瘤細胞增殖的抑制能力進行了對比，結果表明，竹蓀多糖-鋅螯合物的抗腫瘤活性并不是來自多糖，相反多糖還能促進部分腫瘤細胞的增殖，只有當竹蓀多糖和鋅離子形成螯合物后才具有抗腫瘤活性。
[0022]2、本發(fā)明公布的抗腫瘤活性竹蓀多糖-鋅螯合物能明顯抑制肝癌細胞!fepG2、乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細胞A549、子宮頸癌細胞Hela以及前列腺癌細胞PC3的增殖，其中對Η印G2細胞的抑制作用最為明顯。
[0023]3、本發(fā)明公布的抗腫瘤活性竹蓀多糖-鋅螯合物制備工藝簡單，產品安全，可規(guī)?；a。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖la和圖lb為竹蓀多糖和竹蓀多糖-鋅螯合物分別對正常細胞和不同腫瘤細胞增殖的抑制作用圖，其中圖la為竹蓀多糖對各組細胞的影響圖，其中圖lb為竹蓀多糖-鋅螯合物對各組細胞的影響圖；
[0025]圖2a-圖2d為Hoechst 33258染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對HepG2細胞DNA的損傷情況圖；其中圖2a為空白濃度，圖2b的濃度為250 μ g/mL,圖2c的濃度為500 μ g/mL,圖2d的濃度為1000 μ g/mL ；
[0026]圖3為DNA Ladder檢測不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞DNA的損傷情況圖；
[0027]圖4a-圖4d為JC_1染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞線粒體膜電位的影響圖，其中圖4a為空白濃度，圖4b的濃度為250μ g/mL，圖4c的濃度為500 μ g/mL,圖 4d 的濃度為 1000 μ g/mL。
【具體實施方式】
[0028]以下結合具體實施例對本發(fā)明的實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施不限于此。
[0029]實施例1和實施例2中所述Sevage試劑的配制方法為氯仿、正丁醇按體積比4:1混合，Sevage法脫蛋白的方法為多糖與Sevage試劑按體積比1:1混合，振搖20min, 3000r/min離心lOmin,取出上層多糖溶液，再按上述步驟重復5次。
[0030]實施例1:
[0031](1)竹蓀多糖的提取:將100g干燥的竹蓀子實體粉碎后，于沸水浴中振蕩2h提取多糖，過濾，濃縮，真空冷凍干燥；
[0032](2)竹蓀多糖的分離:用Sevage法對竹蓀多糖除蛋白后，加入乙醇，3000r/min離心20min，棄去上清液，將沉淀溶解于蒸餾水，重復5次，將得到的溶液冷凍干燥；
[0033](3)竹蓀多糖的純化:把步驟(2)得到的竹蓀多糖溶于水，用DEAE-52纖維素離子交換層析柱純化，以0.05mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，再用S印hadex G-200葡聚糖凝膠色譜柱純化，以0.05mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到竹蓀多糖；
[0034](4)竹蓀多糖抗腫瘤功效:通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗腫瘤功效。
[0035]實施例2:
[0036](1)竹蓀多糖的提取:將100g干燥的竹蓀子實體粉碎后，于沸水浴中振蕩2h提取多糖，過濾，濃縮，真空冷凍干燥；
[0037](2)竹蓀多糖的分離:用Sevage法對竹蓀多糖除蛋白后，加入乙醇，3000r/min離心20min，棄去上清液，將沉淀溶解于蒸餾水，重復5次，將得到的溶液冷凍干燥；
[0038](3)竹蓀多糖的純化:把步驟(2)得到的竹蓀多糖溶于水，用DEAE-52纖維素離子交換層析柱純化，以0.05mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，再用S印hadex G-200葡聚糖凝膠色譜柱純化，以0.05mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到竹蓀多糖；
[0039](4)在竹蓀多糖溶液中加入無機鋅源進行螯合反應:將ZnS04溶于蒸餾水配成lmg/mL的溶液，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH 2.0，使ZnS04充分溶解，再按多糖與ZnS04質量比為1:1加入5mg/mL的竹蓀多糖溶液，漩渦混勻，用5%氨水溶液調節(jié)pH 10.0，溫度保持在45°C下震蕩反應50h ；
[0040](5)將反應液濃縮后加入3倍體積的無水乙醇將產物沉淀出來，抽濾，用80%的乙醇洗滌，沉淀，最后用無水乙醇洗滌，沉淀。
[0041](6)冷凍干燥，得竹蓀多糖-鋅螯合物，通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗腫瘤功效。
[0042]實施例3:
[0043](1)竹蓀多糖的提取:將100g干燥的竹蓀子實體粉碎后，于沸水浴中振蕩6h提取多糖，過濾，濃縮，真空冷凍干燥；
[0044](2)竹蓀多糖的分離:用Sevage法對竹蓀多糖除蛋白后，加入乙醇，6000r/min離心lOmin，棄去上清液，將沉淀溶解于蒸餾水，重復3次，將得到的溶液冷凍干燥；
[0045](3)竹蓀多糖的純化:把步驟(2)得到的竹蓀多糖溶于水，用DEAE-52纖維素離子交換層析柱純化，以2mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝膠色譜柱純化，以2mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到螯合用的竹蓀多糖；
[0046](4)在竹蓀多糖溶液中加入無機鋅源進行螯合反應:將ZnCl2溶于蒸餾水配成3mg/mL的溶液，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH 2.0，使ZnCl2充分溶解，再按多糖與ZnCl2質量比為1:3加入3mg/mL的竹蓀多糖溶液，漩渦混勻，用5%氨水溶液調節(jié)pH 8.0，溫度保持在65°C下震蕩反應36h ；
[0047](5)將反應液濃縮后加入5倍體積的無水乙醇將產物沉淀出來，抽濾，用60%的乙醇洗滌，沉淀，最后用無水乙醇洗滌，沉淀。
[0048](6)冷凍干燥，得竹蓀多糖-鋅螯合物，通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗腫瘤功效。
[0049]本實施方式通過不同的試驗證明竹蓀多糖-鋅螯合物的抗腫瘤活性:(1)通過MTT法分別檢測竹蓀多糖和竹蓀多糖-鋅螯合物對不同細胞增殖的抑制作用；(2)流式細胞術檢測不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞周期的影響；(3) Hoechst 33258染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞DNA的損傷情況；(4)DNA Ladder檢測不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對HepG2細胞DNA的損傷情況；(5) JC-1染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞線粒體膜電位的影響。
[0050](1)通過ΜΤΤ法分別檢測竹蓀多糖和竹蓀多糖-鋅螯合物對不同細胞增殖的抑制作用(圖la和圖lb)；
[0051]事先培養(yǎng)正常肝細胞L02、肝癌細胞Η印G2、乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細胞Α549、子宮頸癌細胞Hela以及前列腺癌細胞PC3，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞3min制成單細胞懸液，以5X 103個細胞/孔接種96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中(37°C，5% C02)預培養(yǎng)24h后，加入含有不同濃度的竹蓀多糖或竹蓀多糖-鋅螯合物的培養(yǎng)基100 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。往培養(yǎng)板加入MTT (5mg/mL) 20 μ L/孔，37°C孵育4h后棄上清，加入DMS0 100 μ L/孔，振蕩lOmin，紫色結晶物充分溶解后，測定各孔0D57(I值。以對照組od57(i為100%，計算藥物處理后各組細胞存活率。
[0052]細胞存活率(％ ) = (OD570實驗組/OD570對照組)X100%
[0053]由圖中可觀察得到竹蓀多糖-鋅螯合物的抗腫瘤活性并不是來自單獨的多糖，而是通過多糖和鋅生成的螯合物才具有的。竹蓀多糖-鋅螯合物對正常肝細胞L02、肝癌細胞Η印G2、乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細胞A549、子宮頸癌細胞Hela以及前列腺癌細胞PC3增殖都有抑制作用，其中對Η印G2細胞的抑制作用最為明顯，而對正常肝細胞影響不大。這表明，該螯合物不僅對肝癌細胞和正常細胞間有選擇性，而且對不同的腫瘤細胞也有一定的選擇性，具有應用于腫瘤治療的潛力。
[0054](2)流式細胞術檢測不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對HepG2細胞周期的影響；
[0055]用0.25%胰蛋白酶消化貼壁Η印G2細胞3min制成單細胞懸液，以5X 103個細胞/孔接種6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中(37°C，5% C02)預培養(yǎng)24h后，分別加入250 μ g/mL、500 μ g/mLU000 μ g/mL竹蓀多糖-鋅螯合物的培養(yǎng)基100 μ L/孔，并以空白為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48h。流式細胞法計數(shù)細胞周期各期的細胞數(shù)目。
[0056]檢測結果，S期細胞明顯增多，細胞被阻滯在S期，從而抑制癌細胞DNA合成和細胞增殖。
[0057](3) Hoechst 33258染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞DNA的損傷情況(圖2a-圖2d)；
[0058]按上述方法，用不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物培養(yǎng)Η印G2細胞，涂片，Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對HepG2細胞的影響。
[0059]從圖中可觀察得到，隨著濃度的增加，熒光亮度增加，HepG2細胞核固縮，在1000 μ g/mL濃度下能明顯觀察到凋亡小體。
[0060](4)通過DNA Ladder檢測不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞DNA的損傷情況(圖3);
[0061]按上述方法，用不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物培養(yǎng)Η印G2細胞，DNA Ladder檢測試劑盒提取DNA,瓊脂糖凝膠電泳分析DNA條帶。A、B、C、D、E條帶分別為Marker、對照、250 μ g/mL、500 μ g/mL、1000 μ g/mL。
[0062]從圖中可觀察得到，隨著濃度的增加，癌細胞出現(xiàn)明顯凋亡特征。
[0063](5)JC_1染色法觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對！fepG2細胞線粒體膜電位的影響(圖4a_圖4d)；
[0064]按上述方法，用不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物培養(yǎng)Η印G2細胞，涂片，JC-1染色，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度的竹蓀多糖-鋅螯合物對Η印G2細胞的影響。
[0065]從圖中可觀察得到，隨著竹蓀多糖-鋅螯合物濃度的增加，細胞出現(xiàn)綠色熒光的數(shù)量增多，說明線粒體膜電位下降，線粒體膜外翻，癌細胞凋亡。
【權利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的竹蓀多糖-鋅螯合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)竹蓀多糖的提取:將干燥的竹蓀子實體粉碎后，沸水浴提取多糖，濃縮，真空冷凍干燥； (2)竹蓀多糖的分離:用Sevage法對竹蓀多糖除蛋白后，加入乙醇，3000?6000r/min離心10?20 min，棄去上清液，將沉淀溶解于蒸餾水，重復3?5次，將得到的溶液冷凍干燥，得到竹蓀多糖； (3)竹蓀多糖的純化:把步驟(2)得到的竹蓀多糖溶于水，用DEAE-52纖維素離子交換層析柱純化，以0.05?2 mo I/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，再用S印hadex G-200葡聚糖凝膠色譜柱純化，以0.05?2 mol/L NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到螯合用的竹蓀多糖； (4)在竹蓀多糖溶液中加入無機鋅源進行螯合反應:將無機鋅鹽溶于蒸餾水配成I?3mg/mL的溶液，用0.5?2 mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH 2.(Γ3.0，使無機鋅鹽充分溶解，再按多糖與無機鋅鹽質量比為1:1?1:3加入3?5 mg/mL的竹蓀多糖溶液，漩渦混勻，用5%?10%的氨水溶液調節(jié)pH 8.0?10.0,溫度保持在45?65 °C下震蕩反應36?50 h ; (5)將反應液濃縮后加入3?5倍體積的無水乙醇將產物沉淀出來，抽濾，用60%?80%的乙醇洗滌，沉淀，最后用無水乙醇洗滌，沉淀； (6)冷凍干燥，得竹蓀多糖-鋅螯合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述Sevage試劑的配制方法為氯仿、正丁醇按體積比3:1?5:1混合，Sevage法脫蛋白的方法為多糖與Sevage試劑按體積比1:1?1:3混合，振搖10?30 min, 2000?4000 r/min離心10?20 min，取出上層多糖溶液，再按上述步驟重復3?5次。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)所述醇沉，洗滌次數(shù)為3?5次。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述無機鋅鹽包括ZnCl2或ZnSO4中的一種以上。
5.權利要求1所述的方法制備得到的竹蓀多糖-鋅螯合物應用于肝癌藥物的制備。
【文檔編號】A61K31/715GK104277134SQ201410468143
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權日:2014年9月15日
【發(fā)明者】楊繼國, 張榕, 廖文鎮(zhèn), 任嬌艷, 林澤華, 寧正祥 申請人:華南理工大學