一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法及其應(yīng)用，通過培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA，設(shè)計(jì)副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對(duì)，以副溶血弧菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)重組轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將重組載體pET-28a(+)-lptD轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆搖菌過夜，轉(zhuǎn)接種子液，并在37℃，200r/min下培養(yǎng)至OD600約為0.4后，添加終濃度為1mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h，以誘導(dǎo)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表達(dá)，經(jīng)過純化最終得到副溶血弧菌外膜蛋白LptD。該副溶血弧菌外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能夠有效抵抗副溶血弧菌的感染，以及副溶血弧菌所引起的疾病。
【專利說明】一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]副溶血弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌,每年由該菌引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)副溶血弧菌也是食源性病原菌，對(duì)該菌的研究已引起全世界的關(guān)注。目前對(duì)該菌的預(yù)防和治療主要是依靠抗生素，但因長期大量使用，已引起抗藥性，且引起抗生素在動(dòng)物體內(nèi)的富集，對(duì)人類健康造成危害。近年來的研究表明暴露于副溶血弧菌外表面的外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性。因此，依賴于外膜蛋白的來研制相應(yīng)的疫苗來防治細(xì)菌性疾病是一種安全有效的方法，與其它防治途徑相t匕，以疫苗為主的免疫防治有不可替代的優(yōu)勢(shì)。因而利用篩選具高效保護(hù)性外膜蛋白，研制亞單位疫苗具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0003]外膜蛋白(outer membrane proteins, OMPs)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,約占外膜結(jié)構(gòu)的50%。外膜蛋白直接與外環(huán)境接觸，在維持外膜結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞表面識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起重要作用，而且某些外膜蛋白可促進(jìn)細(xì)菌粘附和定植、干擾或逃避宿主的免疫防御作用，是病原菌感染以及致病的關(guān)鍵因素之一。近年來的研究已證實(shí)某些外膜蛋白具有良好的免疫原性，可促進(jìn)宿主產(chǎn)生免疫防御反應(yīng)，是極具發(fā)展前景的疫苗靶位。
[0004]脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)也稱為內(nèi)毒素,也是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要組分之一，它對(duì)于絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌有著至關(guān)重要的作用。脂多糖不僅能為這些細(xì)菌提供保護(hù)，幫助它們抵御惡劣的環(huán)境和外界的毒素(包括抗生素)，也是導(dǎo)致炎癥和人體天然免疫反應(yīng)的主要原因，在人體免疫系統(tǒng)對(duì)抗細(xì)菌入侵時(shí)，LPS作為重要的抗原分子被抗原遞呈細(xì)胞捕獲，從而引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。目前，脂多糖在細(xì)菌胞質(zhì)中的合成已經(jīng)有了很深入的了解，但直到近年才發(fā)現(xiàn)脂多糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及在外膜上的組裝由LptA-G蛋白質(zhì)復(fù)合物負(fù)責(zé)完成。而定位于外膜上的跨膜蛋白LptD (LPS-assembly protein, LPS轉(zhuǎn)運(yùn)和裝配蛋白)通過與外膜脂蛋白LptE相互作用轉(zhuǎn)運(yùn)脂多糖跨過細(xì)菌外膜并組裝形成細(xì)菌外膜的外小葉。LptD-LptE膜蛋白復(fù)合體被認(rèn)為是革蘭氏陰性細(xì)菌存活的“命門”。因而LptD對(duì)細(xì)菌的生理功能和毒力具有關(guān)鍵作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法，包含以下步驟:
[0008]I)培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA ；
[0009]2)設(shè)計(jì)副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對(duì)，以副溶血弧菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010]3)PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，已含卡那霉素平板進(jìn)行突變篩選陽性克隆，并對(duì)篩選得到的陽性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序分析，以驗(yàn)證成功獲得溶血弧菌外膜蛋白LptD基因的重組載體；
[0011]4)將重組載體pET_28a(+)-1ptD轉(zhuǎn)化至Ε.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中；
[0012]5)挑取單克隆搖菌過夜，轉(zhuǎn)接種子液，并在37°C，200r/min下培養(yǎng)至0D600約為
0.4后，添加終濃度為ImM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，以誘導(dǎo)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表達(dá)；
[0013]6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的純化。
[0014]本發(fā)明所述引物對(duì)的核苷酸序列為:
[0015]上游引物:5，-CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3，；
[0016]下游引物:5’ -CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3 ’。
[0017]步驟⑵和步驟(3)中所述的PCR反應(yīng)體系均為:10XTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ I, 1mM dNTPsly 1，上游引物和下游引物各I μ 1，Taq DNA聚合物I μ 1，模板DNA2 μ 1，超純水38 μ I，PCR反應(yīng)體系共50 μ I。
[0018]本發(fā)明所述的溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的純化具體為:收集誘導(dǎo)后的菌體，用PBS洗滌后超聲破碎后，4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清。用1mM的Tris-HCl (pH8.0)、ImM的EDTA、0.5%的Triton X_100、2M尿素洗滌沉淀，重復(fù)3次，去除雜蛋白；4°C，12000r/min條件下離心lOmin，取沉淀制樣，SDS-PAGE后割膠回收，將膠塊碾碎，用萃取液(50mM的 Tris-HCl pH7.9,0.1mM EDTA、150mM NaCl、0.1 % SDS)4°C 萃取過夜，10000r/min 離心15min,取上清裝入透析袋,用PBS進(jìn)行透析,濃縮得到LptD蛋白。
[0019]本發(fā)明提供了副溶血弧菌外膜蛋白LptD作為疫苗組分的應(yīng)用，所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染，所述的細(xì)菌為副溶血弧菌。
[0020]本發(fā)明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白LptD在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用，所述的細(xì)菌為副溶血弧菌。
[0021]本發(fā)明的有益效果為該副溶血弧菌外膜蛋白LptD能有效的保護(hù)小鼠免于副溶血弧菌的感染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是誘導(dǎo)前后的菌體經(jīng)電泳上樣緩沖液處理后的全菌蛋白樣品電泳圖；
[0023]圖2是誘導(dǎo)所得菌體經(jīng)超聲破碎后的沉淀和上清液的蛋白樣品電泳圖；
[0024]圖3是純化的LptD蛋白的SDS-PAGE電泳圖；
[0025]圖4是Dot-ELISA法檢測(cè)免疫小鼠抗血清的效價(jià)；
[0026]圖5是感染副溶血弧菌后對(duì)照組及免疫組小鼠的存活率。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0028]實(shí)施例1
[0029]一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法，包含以下步驟:
[0030]I)培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA:從平板上挑一個(gè)副溶血弧菌單菌落，至5mLLB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至穩(wěn)定期；取1.5ml菌液12000rpm離心2min，棄去上清后，用無菌水Iml重懸菌體，洗滌兩次，再次離心菌體2min ;棄去上清后，用270 μ I TE重懸菌體(RNas eA);加入10mg/ml的溶菌酶15 μ 1，37°C水浴30min，依次加入10%的SDS15y I和100mg/ml的蛋白酶KlO μ 1，混勻后65°C水浴30min ;加入預(yù)冷的5M NaC1200 μ 1，劇烈振蕩后加入酚、氯仿和異戊醇(體積比25:24:1) 500 μ I,渦旋振蕩混勻，1000rpm離心lOmin，將上清液移至1.5ml EP管中，反復(fù)抽提(至少3次)至分界面處無明顯白色絮狀物；上清移至1.5ml EP管，用氯仿500 μ I再次抽提取上清液，加入異丙醇500 μ I沉淀，冰浴1min后14000rpm離心1min ;用預(yù)冷的70%乙醇反復(fù)洗漆后自然吹干,沉淀溶于50 μ ITE中；取抽提產(chǎn)物5μ I進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0031]2)設(shè)計(jì)副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對(duì)，以副溶血弧菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:上游引物:5’ -CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3，;下游引物:5’ -CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3’，PCR 反應(yīng)體系為:10XTaq DNA 聚合酶緩沖液 5 μ 1，1mM dNTPsly 1，上游引物和下游引物各1μ l，Taq DNA聚合物I μ 1，模板DNA2 μ 1，超純水38 μ 1，PCR反應(yīng)體系共50 μ 1，PCR反應(yīng)循環(huán)的參數(shù):首先在94°C下預(yù)變性3min，然后重復(fù)940C 30s, 55°C退火30s，72°C延伸90s三個(gè)循環(huán)過程，共30個(gè)循環(huán)，隨后繼續(xù)在72°C下繼續(xù)延伸lOmin，并在4°C下保存。最后用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定DNA片段的長度并回收DNA片段。
[0032]3)PCR產(chǎn)物和載體pET_28a(+)分別進(jìn)行雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，已含卡那霉素平板進(jìn)行突變篩選陽性克隆，并對(duì)篩選得到的陽性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序分析，以驗(yàn)證成功獲得溶血弧菌外膜蛋白IptD基因的重組載體:PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書操作，回收PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別酶切PCR產(chǎn)物和載體pET-28a (+)，酶切反應(yīng)體系為:限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I各2.5 μ I，1 X HBuf fer 5 μ I，載體25 μ 1，超純水15 μ 1，根據(jù)DNA連接試劑盒使用說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為:酶溶液I μ 1，pET-28a(+)雙酶切片段1.5 μ 1，PCR產(chǎn)物雙酶切片段6 μ 1，用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10μ 1，于16°C水浴連接12h，將10 μ I的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞100 μ I中，輕輕吹懸混勻，冰上靜置30min ;然后42°C熱激90s，再冰浴5min ;加入lml37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37°C，250r/m搖菌復(fù)蘇Ih ;3，000r/m離心2min，吸去上清，剩余100 μ I菌液用移液槍吹打重懸菌體，涂布于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基的平板上，37°C正置培養(yǎng)30min，然后倒置培養(yǎng)12h左右；挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆菌落點(diǎn)下PCR管底，加入混合好的PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸1min。通過I %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并篩選陽性單克隆。
[0033]4)將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒pET-28a(+)_lptD轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(過程同轉(zhuǎn)化DH5 α )，挑單克隆至含50 μ g/ml卡那霉素的3ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/m,搖菌過夜。
[0034]5)將過夜培養(yǎng)的種子液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素50 μ g/ml的10mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/m振蕩培養(yǎng)至0D600約為0.4，加入IPTG至終濃度為0.5mM,在37°C，220r/m條件下繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，以誘導(dǎo)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表達(dá)。取適量誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體制備成樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
[0035]由圖1可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，LptD的表達(dá)量顯著提高，表明成功得到LptD高表達(dá)菌株。而根據(jù)圖2，菌體超聲破碎后的上清液和沉淀中均有較高濃度的LptD蛋白，且上清中的條帶明顯比全菌中的條帶要細(xì)，表明表達(dá)的LptD主要以包涵體形式存在于沉淀中。
[0036]6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的純化:收集誘導(dǎo)后的菌體，用PBS洗滌后超聲破碎后，4°C，12000r/min 離心 1min,棄上清。用 1mM 的 Tris-HCl (ρΗ8.0) UmM 的 EDTA、
0.5%的Triton X_100、2M尿素洗滌沉淀，重復(fù)3次，去除雜蛋白；4°C，12000r/min條件下離心lOmin，取沉淀制樣，SDS-PAGE后割膠回收，將膠塊碾碎，用萃取液(50mM的Tris-HClρΗ7.9、0.ImM EDTA、150mM NaCl、0.I % SDS) 4°C萃取過夜，10000r/min 離心 15min，取上清裝入透析袋，用PBS進(jìn)行透析，濃縮得LptD蛋白，蛋白樣品的SDS-PAGE結(jié)果見圖3。
[0037]實(shí)施例2 LptD蛋白免疫原性及免疫保護(hù)性分析
[0038]將純化的LptD蛋白50 μ g與等體積的弗氏完全佐劑混合并乳化(共300 μ I)，用皮下多點(diǎn)注射法，分別免疫ICR小鼠(共5只)，對(duì)照組5只小鼠分別注射300 μ I不含LptD蛋白的佐劑。然后，隔周用20yg LptD蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合、乳化(共200 μ I)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫共3次，第3次免疫后7d尾部取少量血清進(jìn)行免疫原性分析及效價(jià)測(cè)定。
[0039]將血清按1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000 和 1:10000 倍稀釋，采用
Dot-ELISA法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示，所有5只免疫小鼠抗血清均與LptD蛋白有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其中有3只小鼠抗血清的效價(jià)大于1:5000，2只小鼠的效價(jià)僅有1:2000。
[0040]實(shí)施例3 LptD蛋白的免疫保護(hù)性分析主動(dòng)保護(hù)性分析
[0041]LptD蛋白的免疫保護(hù)性采用小鼠主動(dòng)保護(hù)性試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。在實(shí)施例2第3次小鼠免疫后的的12d，對(duì)照及免疫組小鼠菌均以2.5X107cfu數(shù)量的副溶血弧菌經(jīng)腹腔注射感染小鼠，觀察并記錄小鼠的死亡率。結(jié)果如圖5所示，對(duì)照組小鼠在觀察的第一天就已全部死亡；免疫組小鼠有I只在第一天死亡，另一只在第二天死亡(2只小鼠抗血清的效價(jià)相對(duì)較低，為1:2000)，其余3只小鼠(抗血清的效價(jià)為1:5000及以上)在10天的觀察期內(nèi)一直存活，免疫組小鼠的相對(duì)存活率(Relative percent survival, RPS)為60%，說明蛋白LptD對(duì)小鼠有保護(hù)作用。結(jié)合圖3抗血清效價(jià)測(cè)定的結(jié)果可知，當(dāng)效價(jià)為1:5000以上時(shí)能有效的保護(hù)小鼠免于副溶血弧菌的感染。
【權(quán)利要求】
1.一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法，其特征在于包含以下步驟: 1)培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA； 2)設(shè)計(jì)副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對(duì)，以副溶血弧菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，已含卡那霉素平板進(jìn)行突變篩選陽性克隆，并對(duì)篩選得到的陽性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序分析，以驗(yàn)證成功獲得溶血弧菌外膜蛋白IptD基因的重組載體； 4)將重組載體pET-28a(+)-1ptD轉(zhuǎn)化至Ε.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆搖菌過夜； 5)轉(zhuǎn)接種子液，并在37°C，200r/min下培養(yǎng)至0D600約為0.4后，添加終濃度為Immol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3?4h，以誘導(dǎo)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表達(dá)； 6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法，其特征在于:所述的引物對(duì)的核苷酸序列為:上游引物:5’ -CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3’ ；下游引物:5’-CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制備方法，其特征在于:步驟⑵和步驟(3)中所述的PCR反應(yīng)體系均為:10 X Taq DNA聚合酶緩沖液5 μ 1，1mMdNTPsly 1，上游引物和下游引物各1μ 1，Taq DNA聚合物I μ 1，模板DNA2 μ 1，超純水38 μ I，PCR反應(yīng)體系共50 μ I。
4.利要求I所述的一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD作為疫苗組分的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的細(xì)菌為副溶血弧菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌外膜蛋白LptD在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的細(xì)菌為副溶血弧菌。
【文檔編號(hào)】A61K39/106GK104231061SQ201410475962
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】潘建義, 李楚楚, 葉智鸧, 溫良優(yōu), 陳冉, 田麗花 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)