一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種融合蛋白以及含該融合蛋白的豬流行性腹瀉疫苗組合物及其應(yīng)用。該融合蛋白含豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白和免疫球蛋白Fc片段，該豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白含豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段的串聯(lián)組合而成的蛋白。本發(fā)明還提供了一種豬流行性病毒疫苗組合物，該疫苗組合物含有融合蛋白和載體。本發(fā)明還公開了含該疫苗組合物的制備方法及其在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病毒所引發(fā)疾病的藥物中的應(yīng)用。該融合蛋白制備的疫苗組合物，避免了用豬流行性腹瀉病毒全病毒制備傳統(tǒng)滅活疫苗過程中全病毒難以分離、培養(yǎng)的技術(shù)難題；該融合蛋白可利用基因工程技術(shù)進行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒的融合蛋白 及含該融合蛋白的疫苗組合物的制備與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhoea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起豬腹瀉的一種重要急性、接觸性、病毒性 腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為特征。該病可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡 越小，癥狀越重，死亡率越高，特別地，7日齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3-4天，呈現(xiàn)嚴重脫水 而死亡，死亡率高達50 %，最高的死亡率達100 %。該病最早于上世紀70年代發(fā)生在英國和 比利時，1973年先后在我國上海、遼寧、吉林等地分離到PEDV。PEDV可在豬群中持續(xù)存在， 各種年齡段的豬均易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達1〇〇%，尤以哺乳仔豬嚴 重，病死率達100%。目前，還沒有特效藥物可抵抗PEDV，由于該病發(fā)病急，流行快，豬群一 旦感染，就會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。
[0003] 中國于1980年首次分離到PEDV，以后許多地區(qū)相繼報道有本病發(fā)生，并主要在 冬春季節(jié)散發(fā)，造成的危害巨大。自2010年至今，在我國華南、華北部分省份暴發(fā)了嚴重 的傳染性腹瀉疾病，已超過100萬只的豬死亡（Sun RQ，Cai RJ，Chen YQ, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China. Emerging infectious diseases，2012, 18(1) : 161-162)。該疾病發(fā)病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時間長，應(yīng) 用各種抗生素防治均無效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成重大的經(jīng)濟損失，經(jīng)研究表明：該 疾病的罪魁禍首便是豬流行性腹瀉病毒變異株（Chen JF，Liu XZ，Shi D，et al. Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant.Journal of Virology, 2012, 86:3408)〇
[0004]目前，對于該疾病的防控主要采取傳統(tǒng)工藝以制備滅活疫苗免疫接種，但PEDV全 病毒難以分離、培養(yǎng)。因此，如何解決防控PEDV變異株所帶來的疾病的問題是豬流行性腹 瀉這一領(lǐng)域急需解決的技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，以及含該融合蛋白的疫 苗組合物與應(yīng)用。該疫苗組合物可有效預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病毒所導(dǎo)致的疾病。
[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包括：
[0007] (1)豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白；
[0008] (2)免疫球蛋白Fc片段。
[0009] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白"是指將具有免疫原性的豬流行性腹瀉病毒 蛋白片段進行串聯(lián)組合而制成的蛋白，包括但不限于豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段的串聯(lián) 組合而成的蛋白。
[0010] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段"是指具有免疫原性的豬流行性腹瀉病 毒S全蛋白的部分蛋白片段；所述豬流行性腹瀉病毒S全蛋白是指豬流行性腹瀉病毒 纖突蛋白（即spike蛋白），位于病毒粒子表面，由1380多個氨基酸組成（王樹坤， 郎洪武，李軼女等.豬流行性腹瀉病毒S基因片段的克隆及原核表達.生物技術(shù)進 展，2012, 2 (4) :282-287 ;Chen JF，Liu XZ，Shi D，et al. Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus variant. Journal of virology, 2012,86(6):3408)〇
[0011] 優(yōu)選地，豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段包括COE中和表位或SS2-SS6-2C10三個中 和表位的串聯(lián)以及COE中和表位二者SS2-SS6-2C10三個中和表位的串聯(lián)的組合。
[0012] 優(yōu)選地，所述COE中和表位的核苷酸序列編碼SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 8的編碼氨基酸序列。
[0013] 優(yōu)選地，所述SS2-SS6-2C10組合的中和表位的核苷酸序列編碼為SEQ ID No. 10 的氨基酸序列。
[0014] 術(shù)語"C0E中和表位"是Sl蛋白的一個中和表位區(qū)（499?639aa)根據(jù)CHANG SH BAE J L KANG T T，et al. Identification of theepitoperegion capable of inducing neutralizing anuibodoesagainst the porcine epidemic diarrhea virus MOL CELLS2002, 14(2)295-299鑒定，并把這段蛋白的編碼基因命名為COE基因，不同毒株之間 有1-2位氨基酸的移動。
[0015] 融合蛋白中豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白和免疫球蛋白Fc片段，可以用本領(lǐng)域 熟知的方式連接，在一個優(yōu)選的實施方式中豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白連接在豬免疫球 蛋白Fc的C端，中間可以選擇加上連接柔性蛋白作為連接器，也可以選擇不加柔性蛋白，作 為一種示例，柔性蛋白為GGSSGG大寫字母是氨基酸代碼。
[0016] 豬流行性腹瀉抗原表位SS2、SS6、2C10,是指Sl蛋白中具有中和活性的抗原 位點，具體描述參見 Jianfei Qien 言，Xiaozhen Liu, etl Detection and Molecular Diversity of Spike Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in China。 Viruses 2013, 5, 2601-2613 ;doi: 10. 3390/V510260此文獻全文本發(fā)明的一部分引用入本發(fā)明。
[0017] 豬流行性腹瀉抗原表位抗原SS2、SS6、2C10可以單獨和免疫球蛋白Fc片段融合表 達，也可以串聯(lián)在一起和免疫球蛋白Fc表達，在一個優(yōu)選的實施方式中豬流行性腹瀉抗原 表位抗原SS2、SS6、2C10串聯(lián)和免疫球蛋白Fc表達。
[0018] 術(shù)語融合蛋白：融合蛋白（fusion protein)有兩種不同的含義，一種是通過DNA 重組技術(shù)得到的兩個基因重組后的表達產(chǎn)物。將兩個不同的蛋白質(zhì)連成一個大分子?？梢?通過化學(xué)方法連接，也可通過基因的融合來實現(xiàn)。
[0019] 術(shù)語"免疫球蛋白Fc片段"是指含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)2 (CH2)和重鏈恒定區(qū) 3 (CH3)且不含免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)I(ChI)和輕鏈恒定區(qū)I(Ql)的蛋 白質(zhì)，還可進一步含有位于重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)，于本發(fā)明中主要用作藥物載體。此外，除 了重鏈和輕鏈可變區(qū)之外，所述免疫球蛋白Fc片段可能包含重鏈恒定區(qū)I (ChI)和/或輕 鏈恒定區(qū)I(Ql)的部分或全部。同樣，只要所述免疫球蛋白Fc片段具有與天然蛋白質(zhì)基 本上相似或優(yōu)于天然蛋白質(zhì)的生理學(xué)作用，則所述免疫球蛋白Fc片段可以是在CH2和/或 CH3氨基酸序列的相對較長部分中有缺失的片段。即本發(fā)明所述免疫球蛋白Fc片段可包含 (I)ChI結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，（2)C H1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，（3)CH1結(jié) 構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，（4)CH2結(jié)構(gòu)域和(^3結(jié)構(gòu)域，（5) -個或多個結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈 區(qū)（或鉸鏈區(qū)的部分）的組合，和（6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)各個結(jié)構(gòu)域的二聚體。
[0020] 術(shù)語"免疫球蛋白Fc片段"包括天然氨基酸序列和其序列衍生物（突變體）。所述 氨基酸序列衍生物是由于一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或 它們的組合而不同于天然氨基酸序列的序列，是具有與所述免疫球蛋白Fc片段同樣的生 物學(xué)活性或提高了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（如抗熱、抗pH等）的衍生物。如：在免疫球蛋白IgG Fc片 段中，已知對于結(jié)合重要且位于位點214-238、297-299、318-322或327-331處的氨基酸殘 基可用作修飾的適當靶目標。此外，其它各衍生物也是有可能的，包括其中能形成二硫鍵的 區(qū)域被缺失，或天然Fc形式末端的某些氨基酸殘基被除去或在此添加了甲硫氨酸殘基的 衍生物。此外，為了去除效應(yīng)器功能，缺失可以發(fā)生在補體結(jié)合位點，諸如Clq結(jié)合位點和 ADCC位點。制備所述免疫球蛋白Fc片段序列衍生物的技術(shù)參閱國際專利申請W097/34631 和TO96/32478。此外，若需要，所述免疫球蛋白Fc片段可通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖 基化、甲基化、法呢基化（farnesylation)、乙?；?、酰胺化等作用而被修飾。
[0021] 術(shù)語"免疫球蛋白Fc片段"可獲自從人或包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和 豚鼠在內(nèi)的其它動物中分離的天然形式，或可以是重組體或它們的衍生物，獲自被轉(zhuǎn)化的 動物細胞或微生物。在此，它們可通過從人或動物體中分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水 解酶加以處理而從天然的免疫球蛋白中獲得。木瓜蛋白酶將天然的免疫球蛋白消化成Fab 和Fc片段，而胃蛋白酶處理則導(dǎo)致了 pF' c和F (ab'）2片段的產(chǎn)生。可對這些片段進行如大 小排阻層析以分離Fc或pF' c。此外，所述免疫球蛋白Fc片段可以是具有天然糖鏈、與天然 形式相比糖鏈增加或與天然形式相比糖鏈減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫 球蛋白Fc糖鏈的增加、減少或去除可以通過本領(lǐng)域的通用方法完成，諸如化學(xué)法、酶促法、 利用為生物的遺傳工程法。將糖鏈從Fc片段中去除導(dǎo)致了它與第一補體成分Cl的Clq部 分的結(jié)合親和力明顯降低和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC)或補體依賴性細胞毒 性（CDC)的降低或喪失，從而不會在體內(nèi)引起不必要的免疫應(yīng)答。在這點上，去糖基化或未 糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更適于本發(fā)明作為藥物載體的目的。
[0022] 術(shù)語"去糖基化"是指從所述免疫球蛋白Fc片段中除去了糖基部分。
[0023] 術(shù)語"未糖基化"指所述免疫球蛋白Fc片段是以非糖基化的形式由原核生物產(chǎn) 生，優(yōu)選為由大腸桿菌產(chǎn)生。
[0024] 術(shù)語"免疫球蛋白Fc片段"可獲自從人類或其它動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、 倉鼠、大鼠和豚鼠，優(yōu)選豬。此外，所述免疫球蛋白Fc片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE和 IgM的Fe片段，或者通過它們的組合或雜合體制備而來的Fe片段；優(yōu)選為來自IgG或IgA ; 最優(yōu)選為來自豬的IgG。
[0025] 術(shù)語"組合"是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)的多肽與不同來源的單鏈 多肽連接形成二聚體或多聚體。所述二聚體或多聚體可由選自IgGIFc、IgG2Fc、IgG3Fc、 IgG4Fc片段中的兩種或多種片段所組成。
[0026] 術(shù)語"雜合體"是指編碼兩種或多種不同來源的免疫球蛋白Fe片段的序列存在于 單鏈免疫球蛋白Fe片段中。本發(fā)明中，各種類型的雜合體都是由可能的。即結(jié)構(gòu)域雜合體 可由選自IgGlFc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc的(^、(^、(^、以中的一種至四種結(jié)構(gòu)域組成， 且可能包含鉸鏈區(qū)。
[0027] IgG被劃分為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4四種亞型，本發(fā)明包括它們的組合和雜合體； 優(yōu)選來自豬IgGl、IgG2、IgG3、IgG4四種亞型，包括它們的組合和雜合體。
[0028] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，其特征在于，所述疫 苗組合物包括上述融合蛋白和載體。
[0029] 優(yōu)選地，所述融合蛋白的含量為0? 5 ii g/mL-200 ii g/mL，優(yōu)選5 ii g/mL-100 ii g/ mL〇
[0030] 優(yōu)選地，所述載體包括佐劑，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳 齊U、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍 生物的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺 佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、MS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾 種；優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑。
[0031] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬傳染性胃腸炎病 毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌 抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽 狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗 原為豬傳染性胃腸炎病毒抗原。
[0032] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述疫苗組合物由所述融合蛋白和獸醫(yī)學(xué)上可 接受的佐劑組成。
[0033] 術(shù)語"佐劑"可包括錯膠佐劑；阜苷（saponin)，如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation, Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水乳劑；丙烯酸或甲 基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物選出的化合物。
[0034] 術(shù)語"乳劑"可尤其基于輕液體石錯油（European Pharmacopea類型）；因烯經(jīng)寡 聚產(chǎn)生的類異戊二烯油（isoprenoid oil),如角藍燒（squalane)或角藍烯油（squalene oil)，尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇 二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇 的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離子表面活性 齊U，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無水甘露醇油酸酯）、脂肪族二元 醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、 蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚 物，尤其Pluronic產(chǎn)品，特別是L121。參見Hunter等編寫的《The theory and practical application of adjuvants》（Ed.by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell M 和 Newman M 編寫的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach)) (Plenum Press, 1995)第147頁描述的SPT乳劑及第183頁描述的MF59乳劑。
[0035] 術(shù)語"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優(yōu)選為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物， 尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)，這些化合物已知被稱為卡波姆（Carbomer， 商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8 (2))。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見美國專利 US2909462,其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所述化合物具有至 少3個羥基，優(yōu)選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和 脂經(jīng)基（aliphatic radical)取代。優(yōu)選的基團是那些含有2-4個碳原子的基團，例如乙烯 基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團 自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售，（BF Goodrich, Ohio, USA) 特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯(lián)。這其 中可提及卡波普974P、934P和971P，最優(yōu)選使用卡波普971P。
[0036] 術(shù)語"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸酐與乙烯 的共聚物EMA(Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中和至生理 pH，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0037] 術(shù)語"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、單憐醜脂質(zhì) A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素、MS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0038] 優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐劑系統(tǒng)、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不 耐熱腸毒素、霍亂毒素、頂S 1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述佐 劑為鋁膠佐劑。
[0039] 優(yōu)選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %，優(yōu)選為20 %。
[0040] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬流行性腹瀉"與"PED"、"豬流行性腹瀉病毒"與"PEDV"在本 發(fā)明中可互換使用。
[0041] 本發(fā)明所用縮略語為：AA，氨基酸；bp，堿基對。
[0042] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述 方法包括：（1)克隆表達所述融合蛋白；以及（2)按比例混合所述表達的所述融合蛋白和載 體。
[0043] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中克隆表達所述融合蛋白為分別克隆所述豬流行性腹瀉病 毒抗原性蛋白、所述免疫球蛋白Fc片段，再用基因工程手段將兩種蛋白進行融合表達。
[0044] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白是由豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段與 間隔子Linker串聯(lián)組合而成的蛋白，優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段的核苷酸 序列包括編碼 COE 中和表位的 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 8 的 氨基酸序列，以及編碼SS2-SS6-2C10組合的中和表位的SEQ ID No. 10的氨基酸序列。
[0045] 氨基酸序列；所述免疫球蛋白Fc片段的核苷酸序列編碼SEQIDNo.12氨基酸序 列。
[0046] 優(yōu)選地,所述的克隆表達方法為采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達。
[0047] 本發(fā)明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性 腹瀉病所引發(fā)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0048] 術(shù)語"預(yù)防和/或治療"在涉及豬流行性腹瀉病毒變異株感染時是指抑制豬流行 性腹瀉病毒的復(fù)制、抑制豬流行性腹瀉病毒的傳播或防止豬流行性腹瀉病毒普通株和變異 株在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕豬流行性腹瀉病毒感染的疾病或病癥的癥狀。若病毒荷載 量減少、病癥減輕和/或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效 果。
[0049] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0050] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0051] (1)所述融合蛋白制備的疫苗組合物，避免了用豬流行性腹瀉病毒普通株和變異 株全病毒制備傳統(tǒng)滅活疫苗過程中全病毒難以分離、培養(yǎng)的技術(shù)難題。
[0052] (2)所述疫苗組合物可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分即所述融合蛋白進 行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0053] 序列表中：
[0054] 序列1為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的核苷酸序列1 ;
[0055] 序列2為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的氨基酸序列1 ;
[0056] 序列3為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的人工合成核苷酸序列2 ;
[0057] 序列4為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的氨基酸序列2 ;
[0058] 序列5為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的核苷酸序列3 ;
[0059] 序列6為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的氨基酸序列3 ;
[0060] 序列7為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的核苷酸序列4;
[0061] 序列8為豬流行性腹瀉病毒COE中和表位的氨基酸序列4;
[0062] 序列9為豬流行性腹瀉病毒SS2-SS6-2C10串聯(lián)組合的中和表位的核苷酸序列；
[0063] 序列10為豬流行性腹瀉病毒SS2-SS6-2C10串聯(lián)組合的中和表位的氨基酸序列；
[0064] 序列11為豬免疫球蛋白IgG Fc片段的核苷酸序列；
[0065]序列12為豬免疫球蛋白IgG Fc片段的氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0066] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0067] 本發(fā)明實施例中所采用豬流行性腹瀉攻毒毒株為滬毒株或HN1301株（Porcine epidemic diarrhea virus, strain HN1301)，其中，滬毒株已在中國專利 CN101117627A 中 公開，農(nóng)業(yè)部公告270號文件中將該毒株作為豬流行性腹瀉普通株CV777株的效檢用強毒 株；HN1301株的保藏號為CCTCC NO. V201341，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 地址為中國武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月16日，但該實施方式無論在任何情況 下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0068] 本發(fā)明實施例中所用的磷酸鹽緩沖液為pH7.4PBS溶液，其配方為：1000mL蒸餾水 中加入 NaCl 8. 0g、KCl 0? 2g、Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、KH2PO4O. 24g，但該實施方式無論在任何 情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0069] 本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團，但該實施方式無論在任 何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0070] 本發(fā)明實施例以體積比為20%的鋁膠佐劑制備豬流行性腹瀉疫苗組合物為例進 行闡述，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0071] 本實施例中豬流行性腹瀉發(fā)病的判定標準為：厭食、通常黃色或淺黃色水樣腹瀉， 部分仔豬伴有嘔吐、寒顫、脫水等癥狀，在臨床觀察的5-6日之內(nèi)可能有部分仔豬脫水后死 亡。發(fā)病程度可能輕重不同，但判定發(fā)病最基本的、也是不可少的條件是腹瀉。
[0072] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明所述 的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途 徑獲得。
[0073] 實施例1融合蛋白1的制備、鑒定及含量測定
[0074] 根據(jù)NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的豬流行性腹瀉病毒（登錄 號JN599150. 1、AB857233. 1、AB857234. 1)中S蛋白片段中COE中和表位的基因序列（分別 見 SEQ ID No.l、SEQ ID No.3(人工合成）、SEQ ID No.5、SEQ ID N〇.7)、SS2-SS6-2C10 組 合的中和表位的基因序列（SEQ ID No. 9)，以及豬免疫球蛋白IgG(登陸號：NM_213828. I) 中Fe蛋白的基因序列（見SEQ ID No. 11)通過基因工程手段制備融合蛋白。
[0075] I. 1豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白的構(gòu)建及鑒定
[0076] 構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段中COE中和表位時，在該基因的5'-端和 3'-端引入特異性酶切位點如EcoRI和Hindlll，由上海生物工程有限公司采用人工合成 的方法制備而成，所合成的基因全長均約為400bp，并將合成的基因分別命名為AB1、AB2、 AB3、AB4。
[0077] 特別地，為了保證構(gòu)建出豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段SS2-SS6-2C10組合的中 和表位的正確結(jié)構(gòu)，防止在構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段中SS2-SS6-2C10組合的 中和表位串聯(lián)組合時出現(xiàn)新的表位，在兩表位之間引入間隔子Linker序列GGSSGG (即 ggcggcagcagcggcggc)，并在串聯(lián)組合基因的5'-端和3'-端引入特異性酶切位點如 EcoRI和Hindlll，由上海生物工程有限公司采用人工合成的方法制備而成，所合成的串聯(lián) 組合基因全長約lOObp，命名為⑶。
[0078] 將合成的基因AB1、AB2、AB3、AB4或CD分別和原核表達載體pET-30a(+)分別用 EcoRI和HindIII酶切，純化回收后使用核酸連接酶將AB1、AB2、AB3、AB4、CD基因片段連 接至 pET-30a(+)載體，以構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pET-30a-ABl、pET-30a-AB2、pET-30a-AB3、 pET-30a-AB4、pET-30a-CD，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)陽性篩選后，通過測定序列分別確 定陽性重組質(zhì)粒。
[0079] 1. 2豬免疫球蛋白Fe片段的構(gòu)建及鑒定
[0080] 用Primer5.0引物軟件設(shè)計擴增豬免疫球蛋白IgG Fe片段的特異性引物，并在序 列兩端引入HindIII與XhoI酶切位點，引物序列如下：
[0081]上游引物：5，AAGCTTCTTGAGGTCGTCGTGT3，
[0082]下游引物：5，CTCGAGACCCTGAGTCTTGGA3'。
[0083]參照OMEGA'其.BioteckRNA-SOLV*Reagent RNA Isolation Solvent的 產(chǎn)品說明進行組織RNA提取，具體操作如下：剪取約Ig凍存的肝臟置于研缽內(nèi)，迅速倒入少 許液氮，反復(fù)研磨至均勻粉狀，期間補加液氮，待液氮揮發(fā)完全后，按2ml/g加入RNA-Solv， 研磨均勻，待溶液變清亮后，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，用槍頭吹吸均勻。13000r/min離心 lmin，用槍頭吸出底部殘存的絮狀沉淀，加入1/5體積的氯仿（約200 ill)至EP管中，渦旋 混勻，冰浴IOmin,室溫llOOOr/min離心15min，取上清移入另一 EP管，加入500 Ii 1異丙醇， 混勻，室溫放置IOmin,室溫11000r/min離心IOmin,棄上清，加lmISO1% (V/V)乙醇，潤旋混 勻，室溫7000r/min，離心5min，吸棄乙醇，抽干，加入30 ill無RNA酶的CldH2O溶解，-80°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0084] 依TaKaRa Two St印RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明書，按照反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)體系配 制反應(yīng)液，具體為：MgCl225mM 2iil，IOXRNABuffer Iii l，RNase Free H2O 3. 85 iil，dNTPs 各 IOmM I iil，RNA Inhibitor40U/ill 0.25 iil，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 5U/ill 0.5 iil，下游引物 20mM 0. 5 ill，RNA模板I. 5 ill。將配制好的RT反應(yīng)體系震蕩混勻，并進行RT反應(yīng)，其中RT 反應(yīng)程序為：50°C反轉(zhuǎn)錄30min，99°C變性5min，4°C擱置5min。
[0085] RT反應(yīng)停止后，立即配制PCR反應(yīng)液，具體為：5XPCR BufferlO iil，H2O 29. 25 ii 1，TaKaRa Ex TaqHs 5U/ii I 0? 25 ii 1，上游引物 20mM0. 5 ii 1。將 RT 之后的 RT 反 應(yīng)體系加入PCR反應(yīng)液中，混勻，8000r/min離心30s，按PCR反應(yīng)程序進行擴增。其中PCR 反應(yīng)程序為：94°C預(yù)熱2min，循環(huán)1次；94°C變性30s、57°C復(fù)性30s、72°C延伸I. 5min，循環(huán) 35次；72°C延伸lOmin，循環(huán)1次；并于4°C保存20min，循環(huán)1次。
[0086] 將上述PCR產(chǎn)物電泳，結(jié)果在約IOOObp附近出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶，用DNA凝膠 快速回收試劑盒（上海生工）回收相應(yīng)DNA片段，純化片段連接至pMD18-T載體，構(gòu)建 pMD18-T-Fc重組載體，并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，經(jīng)陽性克隆后并測序，測序正確質(zhì)粒命名 為 pMD18-T-Fc。
[0087] 1. 3融合蛋白的制備及其生物活性鑒定
[0088] 將構(gòu)建的pET-30a-AB、pMD18-T-Fc重組質(zhì)粒分別使用Xhol、HindIII酶進行雙酶 切，酶切產(chǎn)物電泳后，分別在5900bp或5500bp、1000bp附近出現(xiàn)相應(yīng)的pET-30a-ABl、l、 pET-30a-AB2、pET-30a-AB3、pET-30a-AB4、pET-30a-CD 載體片段和 Fe 目的片段，使用 DNA 凝膠回收試劑盒回收酶切片段，然后使用核酸連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受 態(tài)細菌，挑選單克隆，接種LB培養(yǎng)液（Kan+)，提取核酸，經(jīng)酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送基因公 司測序，測序正確的質(zhì)粒分別命名為 pET-30a-ABl-Fc、pET-30a-AB2-Fc、pET-30a-AB3-Fc、 pET-30a-AB4-Fc、pET-30a-CD-Fc。鑒定正確的含有重組質(zhì)粒的重組菌接種LB平板，挑單菌 落接種5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng)箱220rpm過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物按1 % 加入新制備的無菌LB培養(yǎng)液中（Kan+)，于37°C培養(yǎng)箱220rpm培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 4-0. 6時， 于超凈臺無菌條件下加入〇. 4mM的IPTG誘導(dǎo)表達4-6小時，2000rpm離心30min收獲培養(yǎng) 物，按原培養(yǎng)物體積的20%加入蛋白裂解液，冰浴條件下進行超聲破碎處理301^11，2000(^ 離心20min收集沉淀4°C，棄上清。按照Ni-NTA組氨酸純化柱說明書純化蛋白，純化蛋白分 別經(jīng) SDS-PAGE 電泳及 Western blotting 分析，重組的融合蛋白 ABl-Fc、AB2_Fc、AB3_Fc、 AB4-Fc、CD-Fc大小與預(yù)期均相符，均能與鼠抗PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而同條件的 陰性對照未出現(xiàn)相應(yīng)片段。
[0089] 1.4融合蛋白含量的測定
[0090] 將純化后的融合蛋白ABl-Fc、AB2-Fc、AB3-Fc、AB4-Fc、CD-Fc分別命名為融合蛋 白1、融合蛋白2、融合蛋白3、融合蛋白4、融合蛋白5,將其經(jīng)Bradford定量，結(jié)果表明：重 組的融合蛋白1、融合蛋白2、融合蛋白3、融合蛋白4、融合蛋白5的濃度分別為190 ii g/ml、 200 u g/ml>252 u g/ml>285 u g/ml>220 u g/ml〇
[0091] 實施例2豬流行性腹瀉病毒疫苗組合物的制備
[0092] 使用pH7. 4PBS將實施例1制備的融合蛋白進行稀釋，并加入鋁膠佐劑充分混勻， 使疫苗組合物中所含重組的融合蛋白的含量如表1所示，同時保證鋁膠佐劑與疫苗組合物 的體積比為1:5。將制備好的疫苗組合物作為免疫原，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0093]表1豬流行性腹瀉疫苗組合物所含組分

【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白和免 疫球蛋白Fc片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白包 括豬流行性腹瀉病毒變異株S蛋白片段的串聯(lián)組合而成的蛋白，優(yōu)選地，所述豬流行性腹 瀉病毒S蛋白片段包括COE中和表位或SS2-SS6-2C10組合的中和表位，優(yōu)選地，所述豬流 行性腹瀉病毒S蛋白片段包括COE中和表位和SS2-SS6-2C10組合的中和表位串聯(lián)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述COE中和表位的核苷酸序列編碼 SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID Νο·6或SEQ ID %.8的氨基酸序列，所述552-556-2(：10 組合的中和表位的核苷酸序列編碼為SEQ ID No. 10的氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、 CH2、CH3、CH4結(jié)構(gòu)域中的一個至四個結(jié)構(gòu)域組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段還包括鉸鏈區(qū)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段選自IgG、IgG、 IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段選自來自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體，優(yōu)選為來自豬IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
8. -種疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包括權(quán)利要求1所述融合蛋白和載 體；優(yōu)選地，所述載體包括佐劑，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水 包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物 的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐 齊U、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所 述其他抗原包括豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬繁殖與呼 吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸 桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中 的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗原為豬傳染性胃腸炎病毒抗原。
10. -種制備權(quán)利要求8所述疫苗組合物的在預(yù)防豬流行性腹瀉藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選 地，所述的流行性腹瀉藥物中的應(yīng)用為變異豬流行性腹瀉。
【文檔編號】A61K39/215GK104262488SQ201410493162
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 王延輝, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司