青錢柳在制備用于抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別是涉及青錢柳的應(yīng)用領(lǐng)域，更為具體的說是涉及青錢柳在制備用于抑制apoB48分泌的藥物中的應(yīng)用。利用青錢柳葉醇提物對腸道apoB48的合成、分泌的抑制作用，達(dá)到有效地控制由長期外源性脂質(zhì)過度攝入造成的高血脂癥的目的。
【專利說明】青錢柳在制備用于抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別是涉及青錢柳的應(yīng)用領(lǐng)域，更為具體的說是涉及青錢柳在制備用于抑制apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]脂質(zhì)代謝紊亂是指多種原因?qū)е碌囊环N全身血脂代謝異常的高發(fā)疾病，體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，血液粘稠度將會增加，血管壁上極易沉積有血脂，從而易引發(fā)動脈粥樣硬化、心肌梗塞、腦中風(fēng)、冠心病等疾病。
[0003]體內(nèi)脂質(zhì)有兩個來源:一是來自食物的外源性脂質(zhì)主要包括大部分甘油三酯和少部分膽固醇，經(jīng)消化后由小腸吸收被利用；二是由人體自身合成的內(nèi)源性脂質(zhì)。隨著生活水平提高，不健康飲食習(xí)慣日益加劇，導(dǎo)致日常攝取的食物中高脂肪、高膽固醇過多，因此外源性脂質(zhì)過度吸收已成為引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂及相關(guān)疾病的重要誘因。通過藥物調(diào)控外源性脂質(zhì)的吸收代謝，對防治此類疾病具有重要意義。
[0004]外源性脂質(zhì)吸收和代謝是一個復(fù)雜的生理過程。由于脂質(zhì)不溶或微溶于水，其吸收代謝過程中必須與一種特殊蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，這種擔(dān)負(fù)著運(yùn)轉(zhuǎn)脂類的蛋白質(zhì)被稱為載脂蛋白(Apolipoprotein, Apo)。
[0005]研究小腸來源ApoB48的表達(dá)量的改變會對小腸脂蛋白的合成，乃至肝臟脂蛋白的合成產(chǎn)生重要的影響。研究表明，小腸ApoB48的產(chǎn)量增加會使更多的肝臟被運(yùn)送至肝臟，肝臟VLDL的產(chǎn)量也會增加。此外，Apo B48表達(dá)異常不僅導(dǎo)致高脂血癥，而且還與動脈粥樣硬化、肥胖等疾病密切相關(guān)。胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，CM在血中清除率降低，CM殘基易沉積在血管壁；肥胖病人體內(nèi)，ApoB48的水平也顯著提高。因此對小腸apoB48的調(diào)節(jié)有助于改善外源性脂質(zhì)的攝入，有效地控制動脈粥樣硬化、肥胖、高血脂癥等疾病的發(fā)生。
[0006]現(xiàn)在用于臨床的腸道降膽固醇藥物主要為膽汁酸螯合劑，近幾年也研發(fā)出新的腸道降脂藥物，如MTTP抑制劑和apoB表達(dá)抑制劑。通過減少膽汁酸重吸收，抑制MTTP和apoB的表達(dá)來調(diào)節(jié)體內(nèi)的高脂水平和外源性脂質(zhì)的過渡攝入，但是apoB表達(dá)抑制劑主要集中在apoB-100降脂劑藥物的開發(fā)上，因此相關(guān)腸道apoB48的藥物開發(fā)有限，不能完全地控制因脂質(zhì)過多攝入而引發(fā)的高血脂癥，造成病情延誤。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對目前相關(guān)腸道調(diào)節(jié)apoB48藥物開發(fā)的局限性，公開了青錢柳在制備用于抑制apoB48合成、分泌藥物中的應(yīng)用。
[0008]更進(jìn)一步地說，所述青錢柳為青錢柳醇提物。
[0009]通過研究，我們發(fā)現(xiàn)青錢柳葉醇提物能夠抑制apoB48的過度分泌，特別地，是對于長期高脂飲食造成的高血脂癥引起的apoB48的抑制效果。因此，我們基于這一理論分別用不同方法做了驗(yàn)證試驗(yàn)，表明青錢柳對于高脂狀態(tài)下，腸道apoB48的分泌具有抑制作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為青錢柳醇提物在高脂小鼠血清中apoB48的蛋白電泳分析圖。
[0011]圖2為青錢柳醇提物在高脂小鼠血清中apoB48的Elisa分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分所用的材料如下:
[0013]KM小鼠(購買)，青錢柳醇提物(自制)，總膽固醇試劑盒(南京建成生物工程研究所),apoB48酶聯(lián)免疫分析(Elisa)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，山羊抗apoB抗體(Santa Cruz B1technology, Inc.),兔抗山羊辣根過氧化物酶二抗(Cell SignalingTechnology, Inc.),酶聯(lián)免疫檢測儀(B1Tek Corporat1n),垂直電泳槽(B1-rad),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(南京科寶儀器研究所)，控溫離心機(jī)(Beckman Coulter), X線膠片暗匣(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)以上未提及的材料，除非特別說明，否則均為市售產(chǎn)品。
[0014]實(shí)施例1青錢柳醇提物的制備
[0015]青錢柳葉在提取前，去除雜質(zhì)和較粗的枝干。取生藥量2.5kg，采用8倍量80%的乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取物，得浸膏466g。浸膏溶于0.5% CMC-Na中，制成懸浮液。
[0016]實(shí)施例2血清樣本的制備
[0017]40只雄性KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)I周，隨機(jī)分為兩組，空白組10只，給予普通飼料和普通水，余下造模組30只，給予高脂飼料6周。6周后，小鼠眼眶取血(取血前禁食12h)，3000r/min離心15min，取血清測量空腹總膽固醇(TC)水平，以TC > 3.85mmol/L(150mg/dL)為高血脂癥成功模型，按TC值隨機(jī)分為3組，每組10只。高脂模型組12h)，3000r/min離心15min，取血清測量空腹總膽固醇(TC)水平，以TC > 3.85mmol/L (150mg/dL)為高血脂癥成功模型，按TC值隨機(jī)分為3組，每組10只。高脂模型組(HC)，青錢柳醇提物低劑量組(EEL，2g/kg)，醇提取物中劑量組(EEM，4g/kg)，醇提取物高劑量組(EHl，8g/kg)。各組給予CMC-Na懸浮液，空白組和高脂模型組給予等體積0.5% CMC-Na。灌胃給藥4周。
[0018]4周后小鼠禁食過夜，用10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉，眼眶取全血，3000r/min,離心 15min 得血清。取 200 μ L 血清，加 4mI KBr 溶液(density = 1.006g/ml)，60，000Xg, 15°C離心3h。離心得樣品上層液。
[0019]實(shí)施例3樣品apoB48含量的測定
[0020]實(shí)施例3.1蛋白質(zhì)印跡法測定apoB48含量
[0021]實(shí)施例3.1.1 SDS-PAGE凝膠電泳工作液配制
[0022]A液(丙烯酰胺儲存液，10mL):29.2g丙烯酰胺，0.8g雙丙烯酰胺，置通風(fēng)櫥操作，加雙蒸水至10mL,緩慢攪拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，并以石蠟封口，4°C儲存。
[0023]B液(4X 分離膠緩沖液，10mL):75mL 2M Tris-HCl (PH 8.8)，4mL 10% SDS，21mL雙蒸水，4 °C儲存。
[0024]C液(4X 堆積膠緩沖液，10mL):50mL IM Tris-HCl (PH 6.8), 4mL 10% SDS,46mL
雙蒸水，密閉，4°C儲存。
[0025]電泳緩沖液(IL):3g Tris-base，14.4g甘氨酸，Ig SDS，加雙蒸水至 1L，PH 8.3左右，室溫保存。
[0026]5Χ 樣品緩沖液(1mL):0.6mL IM Tris-HCl (PH6.8), 5mL 50% 的甘油，2mL 10%SDS, 0.5mL 2-巰基乙醇，ImL I %溴酚藍(lán)，0.9mL的雙蒸水，可在4°C儲存數(shù)周。
[0027]實(shí)施例3.L 2電泳
[0028]制備10%聚丙烯酰胺分離膠:A液3.96mL, B液3mL，雙蒸水5.04mL, 10%過硫酸胺60 μ L，TEMED 6 μ L，總量12mL ;制備聚丙烯酰胺堆積膠:A液3.45mL, C液1.5mL,雙蒸水3.45mL, 10%過硫酸胺45 μ L，TEMED7.5 μ L，總量6mL ;將分離膠注入垂直電泳槽的玻璃平板夾層中，至凝膠距玻璃板上邊緣約Icm為止，緩緩加入雙蒸水至頂部，37°C聚合0.5h ;吸盡覆蓋在分離膠上的雙蒸水，加入堆積膠至夾層頂部，緩慢傾斜插入梳子，37°C聚合15min ；凝膠聚合后，小心拔出梳子；凝膠板放入電泳槽內(nèi)，將電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中，使凝膠上下端均能浸泡在電泳液中，使用B1-Rad微型凝膠系統(tǒng)；待測樣品(蛋白含量50 μ g)加1/4樣本體積的5X樣品緩沖液混勻，并于沸水中煮lOmin，冷卻后4°C、3000rpm離心lmin,加入加樣孔中，對照孔加入預(yù)染蛋白Marker (12kDa-170kDa);接通電源,恒壓電泳分離蛋白質(zhì)(90V恒壓1.5h);關(guān)閉電源，取下凝膠，去除堆積膠，置于轉(zhuǎn)移液中為后續(xù)步驟備用。
[0029]實(shí)施例3.1.3轉(zhuǎn)膜
[0030]轉(zhuǎn)移緩沖液的配制:3.03g Tris-HCl，14.4g甘氨酸，200mL甲醇(20% )加雙蒸水至1L，室溫保存；濾紙，膠均置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，PVDF膜先用甲醇預(yù)處理5min后，移入轉(zhuǎn)移緩沖液中進(jìn)行平衡；轉(zhuǎn)移夾層由下到上為:3層濾紙、PVDF膜、膠、3層濾紙。注意夾層中不能有氣泡；按3-4mA/cm2XPVDF膜面積計算電流大小，恒流轉(zhuǎn)膜45min ;關(guān)閉電源，取出轉(zhuǎn)印膜，少量TBST漂洗后，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫檢測。
[0031]實(shí)施例3.1.4蛋白質(zhì)免疫檢測
[0032]將轉(zhuǎn)印膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST溶液或3% BSA的TBST溶液)室溫封閉2h或者4°C過夜；取出轉(zhuǎn)印膜放入TBST稀釋的一抗(I: 800)中，4°C放置過夜；取出轉(zhuǎn)印膜；TBST洗膜，1min/次，洗滌4次；將洗滌后的轉(zhuǎn)印膜放入TBST稀釋的二抗(I: 10000)中，37°C放置Ih;取出轉(zhuǎn)印膜，TBST洗膜，1min/次，洗滌3次。
[0033]實(shí)施例3.1.5顯影、壓片、圖像分析
[0034]膜正面覆蓋ECL Plus發(fā)光試劑(A液和B液等體積混合)，去盡殘液，包好，放入X光片夾中，暗處反應(yīng)30s ;于暗室中對膠片進(jìn)行顯影和定影。將膠片進(jìn)行拍照，并用圖象處理系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)分析目標(biāo)條帶的光密度值。
[0035]蛋白印記結(jié)果表明HC組血清中總apoB48的含量中較NC組顯著升高，而不同劑量青錢柳醇提物能夠顯著地降低apoB48的表達(dá)(P < 0.01)。光密度值定量印證此結(jié)果，即HC組apoB48含量比NC組增加了 2倍，而較HC組，給藥組有效地抑制apoB48的分泌。
[0036]實(shí)施例3.2酶聯(lián)免疫分析apoB48的含量
[0037]實(shí)施例3.2.1測定步驟
[0038]標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品ΙΟΟμ 1，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ 1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取10ul分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋50μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I棄掉，再各取50 μ I分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μ I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ I棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50 μ 1，濃度分別為12 μ g/ml,8 μ g/ml,4 μ g/ml,2 μ g/ml,I μ g/ml)。
[0039]加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ 1，然后再加待測樣品10 μ I (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育:用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ 1，空白孔除外。溫育:操作同上。洗滌:操作同上。顯色:每孔先加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。終止:每孔加終止液50 μ 1，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測定:以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0040]實(shí)施例3.2.2計算apoB48的濃度
[0041]以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
[0042]酶聯(lián)免疫分析結(jié)果表明，HC組血清總apoB48的量較NC組增加了 I倍，而青錢柳醇提物劑量依賴性地抑制apoB48的表達(dá)量，且中低劑量青錢柳醇提物能夠顯著地降低apoB48 的量(P < 0.01)。
【權(quán)利要求】
1.青錢柳在制備用于抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述青錢柳為青錢柳醇提取物。
【文檔編號】A61K36/52GK104274513SQ201410524882
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】張健, 蔣翠花, 高萌, 殷志琦, 姚楠, 李玥, 馬永蘭, 林孜 申請人:江蘇省中醫(yī)藥研究院