一種多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】一種多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，是由異長春花堿、脂材及功能性靶向配體組成的；所述脂質(zhì)體為雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為水溶性空腔；所述異長春花堿包封在脂質(zhì)體水溶性空腔中；所述脂材由卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺組成；所述功能性靶向配體由脂質(zhì)體表面的修飾物和脂質(zhì)體雙分子層中的靶向材料組成；所述脂質(zhì)體雙分子層中的靶向材料為粉防己堿，粉防已堿包封在脂質(zhì)體雙分子層中；所述脂質(zhì)體表面的修飾物為伐普肽-聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與膽固醇-聚乙二醇-聚乙烯亞胺。本發(fā)明還提供一種多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體的制備方法，使藥物在跨過血腦屏障后靶向到腦膠質(zhì)瘤部位，增加藥物在腦腫瘤部位的分布，提高化療效果。
【專利說明】-種多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于治療腦膠質(zhì)瘤的多功能祀向異 長春花堿脂質(zhì)體及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤作為惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為癌癥死亡的十大因素之一，嚴(yán)重危及人們 的生命和健康。目前臨床上對于腦膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療等 方案。腦膠質(zhì)瘤具有強(qiáng)浸潤性的特點(diǎn)，可W快速地浸潤和破壞正常腦組織結(jié)構(gòu)，因而，臨床 中不可能通過手術(shù)切除的方法完全治愈腦膠質(zhì)瘤。放射治療由于自身治療精度的限制也不 能完全清除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且該方法副作用大，對正常細(xì)胞的損傷明顯?；煼椒ㄊ〉?主要原因在于化療藥物很難順利的跨越血腦屏障，藥物通過靜脈給藥后不能充分的到達(dá)腦 實(shí)質(zhì)，據(jù)研究大約只有1%的化療藥物能通過血腦屏障到達(dá)中樞腫瘤組織。血腦屏障是指腦 毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障，該屏障的生理功能是阻止大 部分的外來物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定并更好的保護(hù)腦組 織。由此可見，腦膠質(zhì)瘤的上述特點(diǎn)使得腦腫瘤患者的預(yù)后極差，且中位生存期往往少于16 個月。
[0003] 因此，我們需要構(gòu)建一個多功能祀向載體，該個載體可W攜帶化療藥物順利跨越 機(jī)體的血腦屏障，然后將藥物祀向輸送至腦腫瘤組織，該多功能祀向載體的成功構(gòu)建是腦 膠質(zhì)瘤綜合治療策略中至關(guān)重要的一步。
[0004] 異長春花堿（Vinore化ine，VRB)是從中藥長春花中提取并經(jīng)半合成的一種生物堿 類化合物，能抑制乳腺癌，支氣管肺癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞增殖，主要通過作用 腫瘤細(xì)胞微管蛋白而干擾腫瘤細(xì)胞代謝。異長春花堿幾乎不溶于水，并且具有明顯的毒副 作用，其應(yīng)用受到極大的限制。脂質(zhì)體制劑可W明顯改善其生物利用度，改變被包封藥物的 體內(nèi)分布，使其具有一定的祀向特性。目前國內(nèi)已有將長春花屬生物堿制成靜脈注射用微 乳、長循環(huán)脂質(zhì)體及脂質(zhì)微球的專利，但未發(fā)現(xiàn)有將異長春花堿制備成多功能祀向脂質(zhì)體 的專利。
[0005] 伐普膚（Vapreotide, VAP)是D-苯丙氨醜-半脫氨醜-酪氨醜-D-色氨醜-賴 氮醜-額氨醜-半脫氨醜-色氨醜胺-環(huán)二硫離單醋酸鹽，是一種抑制腦垂體分泌生 長激素的神經(jīng)調(diào)節(jié)膚，屬于生長抑素（SST)的一種。生長抑素受體（SSTR)廣泛分布在各種 實(shí)體瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌的腫瘤中。與正常組織相比，腫瘤組織部位的生長抑素受體具有高表 達(dá)的特點(diǎn)，生長抑素受體具有與生長抑素的高度親和的能力，目前生長抑素已經(jīng)作為腫瘤 治療的新的祀分子而在研究中被廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)已有將伐普膚作為祀向配體的專利 (CN101439182A)，但未發(fā)現(xiàn)有將伐普膚與聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋（TPGSi。。。）通過 醜化反應(yīng)結(jié)合而修飾在脂質(zhì)體表面的專利。
[0006] 聚己帰亞胺（polyet的Ienimine, PEI)是一種高效的非病毒型遞送載體，低分 子量PEI分子表面具有高密度正電荷，可W與腫瘤微血管及腫瘤細(xì)胞表面所帶的負(fù)電荷結(jié) 合，從而實(shí)現(xiàn)高效、快速的祀向目的。目前，PEI作為非病毒基因載體已經(jīng)被廣泛的研究，但 未發(fā)現(xiàn)有將聚己帰亞胺與膽固醇-聚己二醇-NHS (CHOL-陽G-NHS)通過縮合反應(yīng)結(jié)合而修 飾在脂質(zhì)體表面的專利。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體及其制備方法，能夠使 藥物在跨過血腦屏障后祀向到腦膠質(zhì)瘤部位，從而增加藥物在腦腫瘤部位的分布，減小化 療藥物的毒副作用，提高化療的效果。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0009] 本發(fā)明提供一種多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體，是由異長春花堿、脂材及功能 性祀向配體組成的；所述脂質(zhì)體為雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有水溶性空腔；所述異長春花堿 包封在脂質(zhì)體水溶性空腔中；所述脂材由卵磯脂（DPPC)、膽固醇（CH0L)、聚己二醇-二 硬脂醜磯脂醜己醇胺（DS陽-PEGw。。）組成；所述功能性祀向配體由脂質(zhì)體表面的修飾物 和脂質(zhì)體雙分子層中的祀向材料組成；所述脂質(zhì)體雙分子層中的祀向材料為粉防己堿 (tetran化ine, TET)，所述粉防已堿包封在脂質(zhì)體雙分子層中；所述脂質(zhì)體表面的修飾 物為伐普膚-聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)與膽固醇-聚己二醇-聚 己帰亞胺（CH0L-PEG-PEI)，所述TPGSww-VAP通過醜化反應(yīng)修飾在脂質(zhì)體的表面，所述 CH0L-PEG-PEI通過縮合反應(yīng)修飾在脂質(zhì)體的表面。
[0010] 所述 DPPC、CH0L、DS陽-PEG2。。。、TPGSiow-VAP 和 CHOkWG-PEI 的物質(zhì)的量之比為 (55-65): (18-22): (3-3. 5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8)，所述異長春花堿與脂材的質(zhì)量比 為1:50-1:70,所述粉防己堿與脂材的質(zhì)量比為1:10-1:30。
[0011] 所述伐普膚-聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)是由伐普膚（VAP) 中的氨基與經(jīng)戊二酸活化的聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋的駿基（TPGSiwa-COOH)發(fā) 生醜化反應(yīng)合成的，所述聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋（TPGSi。。。）經(jīng)戊二酸活化；所述 醜化反應(yīng)的縮合劑為碳二亞胺（邸C)和N-輕基玻巧醜亞胺（N服），所述醜化反應(yīng)的溫度為 20-25°C、時間為20-2化，所述醜化反應(yīng)在二甲基亞諷（DMSO)溶劑中進(jìn)行，所述醜化反應(yīng)中 VAP: TPGSi圓-COOH: EDC:畑S=I: 1:8:8 (摩爾比）。
[0012] 所述膽固醇-聚己二醇-聚己帰亞胺（CH0L-陽G-PEI)是由聚己帰亞胺（PEI)中 的氨基與膽固醇-聚己二醇-N服（OTOkWG-N服）中的N-輕基玻巧醜亞胺（N服）發(fā)生縮 合反應(yīng)合成的；所述縮合反應(yīng)的溫度為20-25C，時間為30-3化，所述縮合反應(yīng)可W在二甲 基甲醜胺（DMF)溶劑中進(jìn)行，DMF溶液用N-甲基嗎晰調(diào)節(jié)抑為8. 5-9. 5,所述縮合反應(yīng)中 陽I: CHOkWG-N服=5:1 (摩爾比）。
[001引所述TPGSiwa-VAP與CH0L-PEG-PEI的合成方法還包括分別將兩種化合物的反應(yīng)液 在去離子水中進(jìn)行透析(截留值為2000 Da)純化，然后將透析后的液體凍干得到兩種祀向 配體材料。
[0014] 所述TPGSww-VAP與CHOkWG-PEI為兩種共輛化合物，均作為主動祀向的祀向配 體，修飾在多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的表面，W增加所述脂質(zhì)體跨越血腦屏障和主動 識別祀向腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。
[0015] 所述粉防己堿修飾在脂質(zhì)體雙分子層中，W克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。
[0016] 所述脂質(zhì)體經(jīng)過TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己堿修飾，在順利跨血腦屏障 后，通過主動識別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上的P-評外排蛋白過度表達(dá)而發(fā) 揮多重祀向的目的。
[0017] 本發(fā)明還提供一種多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟。
[0018] 步驟1、粉防己堿、TPGSww-VAP、CHOL-陽G-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去氯仿，得到脂膜。
[0019] 步驟2、將所述脂膜用硫酸饋溶液水化，水化液超聲lOmin，然后使用脂質(zhì)體擠出 儀分別擠過400nm、200nm和IOOnm孔徑的濾膜各3次，制備空白多功能祀向脂質(zhì)體。
[0020] 步驟3、將所述空白多功能祀向脂質(zhì)體密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中， 置磯酸鹽緩沖液（PBS)中透析3次，每次12h。
[0021] 步驟4、取處方量的異長春花堿，加至透析后的空白多功能祀向脂質(zhì)體，置4(TC恒 溫振蕩器中，lOOr/min振搖30min，得到多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體。
[0022] 所述脂材由卵磯脂（DPPC)、膽固醇（CH0L)、聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DS陽-PEG2。。。）組成；所述 DPPC、CHOL、DS陽-PEG2〇w、TPGSiwa-VAP 及 CHOkWG-PEI 的物質(zhì)的 量之比為（55-65): (18-22): (3-3. 5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8);所述異長春花堿與脂材 的質(zhì)量比為1:50-1:70,所述粉防己堿與脂材的質(zhì)量比為1:10-1:30。
[0023] 所述多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體用于制備腦腫瘤細(xì)胞抑制劑。
[0024] 所述腦腫瘤可為腦膠質(zhì)瘤，具體可為C6膠質(zhì)瘤。
[00巧]所述多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體粒徑約為lOOnm，Zeta電位接近30mv。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0027] 本發(fā)明提供的多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體及其制備方法，通過將抗腫瘤藥異長 春花堿包封于脂質(zhì)體水溶性空腔中，脂質(zhì)體經(jīng)過TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己堿修 飾，得到了一種全新的多功能祀向脂質(zhì)體，該多功能祀向脂質(zhì)體能夠使藥物在跨過血腦屏 障后祀向到腦膠質(zhì)瘤部位，避免了多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，從而增加了藥物在腦腫瘤部位的 分布，減小了化療藥物的毒副作用，提高了化療的效果。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤化療提供了一個 新的對策，有助于對腦膠質(zhì)瘤的非侵入性治療的研究，具有重要的理論意義與臨床意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[002引圖1為本發(fā)明多功能碑!向異長春花堿脂質(zhì)體示意圖。
[0029] 圖 2A 為 TPGSiow-COOH 的 MALDI-TOF-MS 圖譜。
[0030] 圖 2B 為祀向配體 TPGSiow-VAP 的 MALDI-T0F-MS 圖譜。
[0031] 圖 3A 為 OlOkWG-N服的 MALDI-T0F-MS 圖譜。
[0032] 圖 3B 為祀向配體 CHOkWG-PEI 的 MALDI-T0F-MS 圖譜。
[0033] 圖4A為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的透射電鏡照片。
[0034] 圖4B為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體原子力顯微鏡二維照片。
[0035] 圖4C為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體原子力顯微鏡H維照片。
[0036] 圖5A為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的粒徑分布圖。
[0037] 圖5B為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的Zeta電位圖。
[0038] 圖6為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗增殖作用。
[0039] 圖7為流式細(xì)胞儀測定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取異長春花堿的情況。
[0040] 圖8為激光共聚焦顯微鏡共定位測定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取異長春花堿的情況。
[0041] 圖9A為體外血腦屏障模型的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0042] 圖9B為透過血腦屏障能力的測定圖。
[0043] 圖10為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞色素C釋放的影響。
[0044] 圖11為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞調(diào)亡的影響。
[0045] 圖12A為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)亡酶化spase 9的影響。
[0046] 圖12B為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)亡酶化spase 3的影響。
[0047] 圖13為不同脂質(zhì)體在C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球中的穿透能力情況。
[0048] 圖14為不同脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球破壞的影響。
[0049] 圖15A為藥物在ICR荷瘤小鼠活體狀態(tài)下的組織分布情況。
[0050] 圖15B為藥物在ICR荷瘤小鼠離體狀態(tài)下的組織分布情況。
[0051] 圖16為C6膠質(zhì)瘤小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線。

【具體實(shí)施方式】
[005引一、儀器與試藥。
[005引 1. 1、儀器；電子分析天平（AY220,日本島津公司）；電熱恒溫水浴鍋師-4,上 海醫(yī)療器械五廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細(xì)胞搗碎機(jī) (JY92-2D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；脂質(zhì)體擠出儀（LF-1，加拿大AVESTIN公 司）；聚碳酸脂膜(孔徑400皿、200皿、100皿，德國Whatman公司）；恒溫振蕩器（S監(jiān)-82,上 海儀純實(shí)業(yè)有限公司）；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MLDI-T0F-MS，日本島津公 司）;激光散射粒徑測定儀狂etasizer 3000HS，英國馬爾文公司）；透射電子顯微鏡（Tecnai G220ST，美國陽I公司）;原子力掃描探針顯微鏡（SPI3800N，日本精工株式會社);掃描電子 顯微鏡（JSM-5600 LV,日本電子株式會社）；WJ-80B- II二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（WJ-80B- II， 上海新苗醫(yī)療器械有限公司）；超凈工作臺（AirTECH，中國蘇凈安泰公司）；倒置顯微鏡 狂DS-1B，中國重慶光學(xué)電學(xué)儀器公司）；酶標(biāo)儀（MR-96,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限 公司）；激光共聚焦顯微鏡（SP8,德國LEICA公司）;流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國Becton Dickinson公司）；多功能小動物活體成像系統(tǒng)（巧，美國柯達(dá)公司）。
[0054] 1. 2、試劑與試藥；聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺（DSPE-PEG2。。。）、膽固醇-聚 己二醇-NHS (CH0L-PEG-NHS)、卵磯脂（DPPC)(日本油脂株式會社）；聚己二醇1000維生素 E玻巧酸醋（TPGSi。。。)、聚己帰亞胺（PEI)(美國Sigma公司）；戊二酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北 京有限公司）；膽固醇（cholesterol, CHOL)(美國Avanti公司）；異長春花堿、粉防己堿(美 侖生物技術(shù)有限公司）；碳二亞胺（EDC)(上海Me化巧公司）；二甲基甲醜胺（DMF)、N-輕基 玻巧醜亞胺（N服）（北京騰達(dá)科技有限公司）;伐普膚（VAP)(上海楚膚生物科技有限公司）。 [00巧]二、多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的制備與表征。
[0056] 請參閱圖1，圖1為本發(fā)明多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體示意圖。本發(fā)明提供一種 多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體，是由異長春花堿、脂材及功能性祀向配體組成的；所述脂質(zhì) 體為雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為水溶性空腔；所述異長春花堿包封在脂質(zhì)體水溶性空腔中；所 述功能性祀向配體由脂質(zhì)體表面的修飾物和脂質(zhì)體雙分子層中的祀向材料組成；所述脂質(zhì) 體雙分子層中的祀向材料為粉防己堿，所述粉防已堿包封在脂質(zhì)體雙分子層中；所述脂質(zhì) 體表面的修飾物為伐普膚-聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)與膽固醇-聚 己二醇-聚己帰亞胺（CHOL-PEG-PEI )，所述TPGSww-VAP通過醜化反應(yīng)修飾在脂質(zhì)體的表 面，所述CHOL-PEG-PEI通過縮合反應(yīng)修飾在脂質(zhì)體的表面。
[0057] 2. 1、TPGSiw〇-VAP 和 OTOkWG-PEI 的合成與表征。
[0058] 2. 1. 1、TPGSiw〇-VAP 和 CHOkWG-PEI 的合成。
[0059] TPGSww-VAP由經(jīng)戊二酸活化的聚己二醇1000維生素E玻巧酸醋上的駿基 TPGSww-COOH和伐普膚上的氨基通過醜化縮合而成，W EDC和N服為反應(yīng)縮合劑。將 1011111〇1了口081圓一〇)地、8011111〇1￡0(：和8011111〇1畑8溶解在211110150溶液中，方口人1011111〇1 伐普膚，將反應(yīng)液在20-25C下攬拌20-2化得粗產(chǎn)物，該粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋(截留分子量 2000化)，在去離子水中透析4她，除去未反應(yīng)的原料。接下來將透析后的產(chǎn)物冷凍干燥，得 到干燥的產(chǎn)物混合物白色粉末。
[0060] CHOL-PEG-PEI由CH0L-PEG-NHS上的N服和PEI上的氨基通過縮合而成，將 40 y mol陽I和8 y mol OlOkWG-N服溶解在2ml DMF溶液中，將反應(yīng)液用N-甲基嗎晰調(diào) 節(jié)pH至9. 0,將反應(yīng)液在20-25C下攬拌30-3化得粗產(chǎn)物，該粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋(截留分 子量2000化)，在去離子水中透析4她，除去未反應(yīng)的原料。接下來將透析后的產(chǎn)物冷凍干 燥，得到干燥的產(chǎn)物混合物白色粉末。
[0061] 2. 1. 2、TPGSi圓-VAP 和 CHOkPEG-PEI 的表征。
[0062] 所述TPGSww-VAP和CHOL-PEG-PEI均為共輛化合物，分別將兩種共輛化合物 通過基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行檢測，如圖2A、2B、3A、3B所示，圖2A為 TPGSiow-COOH 的 MALDI-T0F-MS 圖譜，圖 2B 為祀向配體 TPGSiw〇-VAP 的 MALDI-T0F-MS 圖 譜，圖3A為CHOL-PEG-N服的MALDI-TOF-MS圖譜，圖3B為祀向配體CHOL-PEG-PEI的 MLDI-TOF-MS圖譜。請參閱圖2A與圖2B，TPGSiaw-COOH的加軸質(zhì)譜峰1710. 02 Da,終產(chǎn) 物中TPGSww-VAP的加鐘平均分子質(zhì)量為2859. 65 Da,兩者分子量的差值接近VAP的分子 質(zhì)量1131. 37 Da。請參閱圖3A與圖3B，CHOL-PEG-N服的分子量為2463. 72 Da,終產(chǎn)物中 CHOL-PEG-PEI的加鐘平均分子質(zhì)量為3062. 96 Da,兩者分子量的差值接近PEI的分子質(zhì)量 600. 00 Da。
[0063] 2. 2、不同脂質(zhì)體的制備。
[0064] 2. 2. 1、多功能碑!向異長春花堿脂質(zhì)體的制備。
[0065] 步驟1、粉防己堿、TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去氯仿，得到脂膜。所述DPPC、CHOL、DS陽-PEG2。。。、TPGSiwa-VAP和CHOkWG-PEI按物質(zhì)的 量之比為60:20:3:1.5:1.5溶解在氯仿中，氯仿液中加入粉防己堿，粉防已堿與脂材的質(zhì) 量比為1:20,超聲使其溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，在4(TC、100巧m條件下旋蒸形成薄膜，即 得脂膜。
[0066] 步驟2、將所述脂膜用5ml硫酸饋溶液水化，水化液超聲lOmin，使脂膜分散在水化 液中，然后水化液使用脂質(zhì)體擠出儀分別擠過400nm、200nm和IOOnm孔徑的濾膜各3次，制 備空白多功能祀向脂質(zhì)體。
[0067] 步驟3、空白多功能祀向脂質(zhì)體密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中，置磯酸 鹽緩沖液（PBS)中透析3次，每次12h。
[0068] 步驟4、取異長春花堿，異長春花堿與脂材的質(zhì)量比為1:60,加至透析后的空白多 功能祀向脂質(zhì)體，置4(TC恒溫振蕩器中，lOOr/min振搖30min，得到所述多功能祀向異長春 花堿脂質(zhì)體。
[0069] 2. 2. 2、不同祀向配體修飾的脂質(zhì)體的制備。
[0070] 為與本發(fā)明多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體進(jìn)行比較，制備了伐普膚修飾的異長春 花堿脂質(zhì)體（VAP修飾異長春花堿脂質(zhì)體)、聚己帰亞胺修飾的異長春花堿脂質(zhì)體（PEI修飾 異長春花堿脂質(zhì)體）及粉防己堿修飾的異長春花堿脂質(zhì)體（TET修飾異長春花堿脂質(zhì)體）作 為對照組，進(jìn)行功能效果比對。
[0071] VAP修飾異長春花堿脂質(zhì)體采用上述相同的方法制備，其中祀向配體 CHOL-PEG-PEI用CHOL-PEG-N服代替，且不加入粉防己堿。
[0072] PEI修飾異長春花堿脂質(zhì)體采用上述相同的方法制備，其中祀向配體TPGSiwa-VAP 用TPGSi。。。代替，且不加入粉防己堿。
[0073] TET修飾異長春花堿脂質(zhì)體通過上述相同的方法制備，其中祀向配體 CHOkWG-PEI 和 TPGSww-VAP 分別用 CHOkWG-N服和 TPGSi。。。代替。
[0074] 2. 2. 3、英光探針脂質(zhì)體的制備。
[0075] 為了考察多功能祀向脂質(zhì)體在荷瘤小鼠體內(nèi)外祀向性及其祀向機(jī)理，選擇香豆 素、柔紅霉素和DiR作為英光探針，分別制備不同的英光探針脂質(zhì)體。其中香豆素脂質(zhì)體、 VAP修飾香豆素脂質(zhì)體、PEI修飾香豆素脂質(zhì)體、TET修飾香豆素脂質(zhì)體及多功能祀向香豆 素脂質(zhì)體(香豆素與脂材的質(zhì)量比1:200);柔紅霉素脂質(zhì)體、VAP修飾柔紅霉素脂質(zhì)體、PEI 修飾柔紅霉素脂質(zhì)體、TET修飾柔紅霉素脂質(zhì)體及多功能祀向柔紅霉素脂質(zhì)體(柔紅霉素與 脂材的質(zhì)量比1:20) ;DiR脂質(zhì)體、VAP修飾DiR脂質(zhì)體、PEI修飾DiR脂質(zhì)體、TET修飾DiR 脂質(zhì)體及多功能祀向DiR脂質(zhì)體（DiR與脂材的質(zhì)量比1:300)分別按照上述相同的方法制 備，其中異長春花堿分別用香豆素、柔紅霉素和DiR代替。
[0076] 2. 3、脂質(zhì)體的表征。
[0077] 將所制備的各種脂質(zhì)體分別通過Se地adex G-IOO柱分離游離異長春花堿，并按照 W下公式計(jì)算異長春花堿的包封率；EE= (Wi/XnJ X 100%，其中，Wi是過Se地adex G-IOO柱 后被甲醇破壞的脂質(zhì)體中異長春花堿的質(zhì)量，WtMdi是相同體積的脂質(zhì)體直接經(jīng)過甲醇破壞 后的異長春花堿質(zhì)量。
[0078] 脂質(zhì)體表面及形態(tài)使用透射電子顯微鏡及原子力掃描探針顯微鏡進(jìn)行觀察。請參 閱圖4A、圖4B與圖4C，其中，圖4A為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡的照 片，圖4B為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的原子力掃描探針顯微鏡的二維照片，圖4C為多 功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的原子力掃描探針顯微鏡的H維照片。
[0079] 采用激光散射粒徑測定儀測定各種脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位。請參閱圖5A與圖 5B，其中，圖5A為多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體的粒徑分布圖，圖5B為多功能祀向異長春 花堿脂質(zhì)體的Zeta電位圖。
[0080] 脂質(zhì)體的表征結(jié)果見表1。
[008。 表1 ;脂質(zhì)體的表征結(jié)果。

【權(quán)利要求】
1. 一種多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于，包括：異長春花堿、脂材及功能性 靶向配體；所述脂質(zhì)體為雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有水溶性空腔；所述異長春花堿包封在脂 質(zhì)體水溶性空腔中；所述脂材由卵磷酯（DPPC)、膽固醇（CHOL)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺（DSPE-PEG 2_)組成；所述功能性靶向配體由脂質(zhì)體表面的修飾物和脂質(zhì)體雙分子 層中的靶向材料組成；所述脂質(zhì)體雙分子層中的靶向材料為粉防己堿，所述粉防已堿包封 在脂質(zhì)體雙分子層中；所述脂質(zhì)體表面的修飾物為伐普肽-聚乙二醇1000維生素 E琥珀酸 酯（TPGS_-VAP)與膽固醇-聚乙二醇-聚乙烯亞胺（CHOL-PEG-PEI)，所述TPGS_-VAP通 過?；磻?yīng)修飾在脂質(zhì)體的表面，所述CHOL-PEG-PEI通過縮合反應(yīng)修飾在脂質(zhì)體的表面。
2. 如權(quán)利要求1所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于：所述DPPC、CHOL、 DSPE-PEG^^TPGSh^-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物質(zhì)的量之比為（55-65): (18-22): (3-3. 5): (1. 3-1. 8) : (1. 3-1. 8)。
3. 如權(quán)利要求1所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于：所述異長春花堿 與脂材的物質(zhì)的量為1:50-1:70,所述粉防己堿與脂材的物質(zhì)的量為1:10-1:30。
4. 如權(quán)利要求1所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于：所述伐普肽-聚 乙二醇1000維生素 E琥珀酸酯（TPGS_-VAP)是由伐普肽（VAP)中的氨基與經(jīng)戊二酸活 化的聚乙二醇1000維生素 E琥珀酸酯的羧基（TPGS^^COOH)發(fā)生?；磻?yīng)合成的；所述 TPGS1(I(I(I-VAP為共軛化合物，所述酰化反應(yīng)的縮合劑為碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰 亞胺（NHS)，所述?；磻?yīng)的溫度為20-25°C、時間為20-24h，所述?；磻?yīng)在二甲基亞砜 (DMS0)溶劑中進(jìn)行，所述?；磻?yīng)中VAP: TPGS^a-COOH: EDC: NHS=1:1:8:8 (摩爾比）。
5. 如權(quán)利要求1所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于：所述膽固醇-聚 乙二醇-聚乙烯亞胺（CHOL-PEG-PEI)是由聚乙烯亞胺（PE I)中的氨基與膽固醇-聚乙 二醇-NHS (CHOL-PEG-NHS)中的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)發(fā)生縮合反應(yīng)合成的；所述 CHOL-PEG-PEI為共軛化合物，所述縮合反應(yīng)的溫度為20-25°C，時間為30-36h，所述的縮合 反應(yīng)可以在二甲基甲酰胺（DMF)溶劑中進(jìn)行，DMF溶液用N-甲基嗎啉調(diào)節(jié)pH為8. 5-9. 5， 所述縮合反應(yīng)中PEI:CH0L-PEG-NHS=5:1 (摩爾比）。
6. 權(quán)利要求1-5所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：包括 如下步驟： 步驟1、粉防己堿、TPGS1(I(I(I-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯 仿，得到脂膜； 步驟2、將所述脂膜用硫酸銨溶液水化，水化液超聲10min，然后使用脂質(zhì)體擠出儀分 別擠過400nm、200nm和100nm孔徑的濾膜各3次，制備空白多功能祀向脂質(zhì)體； 步驟3、將所述空白多功能靶向脂質(zhì)體密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中，置磷 酸鹽緩沖液（PBS)中透析3次，每次12h ; 步驟4、取處方量的異長春花堿，加至透析后的空白多功能靶向脂質(zhì)體，置40°C恒溫振 蕩器中，100r/min振搖30min，得到多功能祀向異長春花堿脂質(zhì)體。
7. 如權(quán)利要求6所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體，其特征在于：所述脂材由卵 磷脂（DPPC)、膽固醇（CH0L)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG 2_)組成；所 述 DPPC、CHOL、DSPE-PEG2Q(IQ、TPGS1(I(I(I-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物質(zhì)的量之比為（55-65): (18-22): (3-3.5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8);所述異長春花堿與脂材的質(zhì)量比為 1:50-1:70， 所述粉防己堿與脂材的質(zhì)量比為1:10-1:30。
8. 如權(quán)利要求7所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體的制備方法，其特征在 于：所述 DPPC、CHOL、DSPE-PEG2Q(IQ、TPGS1(I(I(I-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物質(zhì)的量之比為 60:20:3:1. 5:1. 5〇
9. 如權(quán)利要求7所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：所述 異長春花堿與脂材的質(zhì)量比為1:60,所述粉防己堿與脂材的質(zhì)量比為1:20。
10. 權(quán)利要求1所述的多功能靶向異長春花堿脂質(zhì)體的應(yīng)用，其特征在于：所述多功能 革巴向異長春花堿脂質(zhì)體用于制備腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制劑。
【文檔編號】A61K47/42GK104224718SQ201410526731
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】李學(xué)濤, 程嵐, 姜英, 呂佳, 袁子民, 劉玉強(qiáng), 趙琳 申請人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)