七鰓鰻crbgp在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了七鰓鰻天然及重組CRBGP能夠抑制由bFGF誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC）的增殖，并呈劑量依賴性，其IC50為4.8μmol/L；同時(shí)發(fā)現(xiàn)七鰓鰻天然及重組CRBGP對(duì)由bFGF誘導(dǎo)的六日齡雞胚絨毛尿囊膜（chickenchorioallantoicmembrane，CAM）血管新生具有抑制作用，可應(yīng)用于制備低毒、高效的抗血管新生藥物。
【專利說(shuō)明】七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種七鰓鰻CRBGP的用途，尤其是一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]血管新生指從已存在的血管中發(fā)展出新的微血管，在一些正常的生理過(guò)程中(諸如胚胎發(fā)育、傷口愈合、黃體形成)扮演重要角色。然而，非預(yù)期的血管新生也會(huì)導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，如慢性炎癥、糖尿病引起的視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新生血管、銀屑病、骨髓增生異常綜合癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及腫瘤等，嚴(yán)重危害人類的生命健康和生活質(zhì)量。因此，開發(fā)低毒、高效的抗血管新生藥物是目前治療與炎癥相關(guān)血管新生異常疾病的熱點(diǎn)。
[0003]富含半胱氨酸分泌蛋白(Cysteinerich secretory proteins, CRISP)是一類在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，含有16個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，可形成8對(duì)二硫鍵?？臻g結(jié)構(gòu)主要由 N 端的 PR-1 結(jié)構(gòu)域(pathogenesis-related group I domain)、C 端的 CRD 結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich domain)以及連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)域三部分組成。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中的CRISP家族各成員主要分布于生殖道中，在精子的成熟、精卵融合以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用；而非哺乳動(dòng)物中的CRISP家族成員則主要分布于腺體的分泌液中，能夠阻斷K+、Ca2+及環(huán)核苷酸門控通道等，并與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
[0004]七觸鰻CRBGP是從日本七觸鰻(ZaffijDeira japonica) 口腔腺中分離純化出的一種新型富含半胱氨酸分泌蛋白，因與CRISP家族成員具有高度同源性，同樣具有16個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，因此將其命名為富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白(cysteine-richbuccal gland protein, CRBGP)。
[0005]七鰓鰻CRBGP的cDNA序列(開放閱讀框)含有774bp，其蛋白質(zhì)有257個(gè)氨基酸組成，質(zhì)譜測(cè)定分子量為25.6 kDa，其cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列如下:
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257
目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)七鰓鰻天然CRBGP是Na+通道阻斷劑，能夠阻斷海馬神經(jīng)元和背根神經(jīng)元的Na+電流，降低海馬神經(jīng)元和背根神經(jīng)元的動(dòng)作單位從而抑制神經(jīng)元的興奮性；此外還發(fā)現(xiàn)七鰓鰻CRBGP對(duì)海馬神經(jīng)元的K+通道也具有阻斷作用。迄今為止，尚未見有關(guān)富含半胱氨酸分泌蛋白抑制血管新生功能的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了七鰓鰻CRBGP的抗血管新生功能，從而發(fā)明了七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了七鰓鰻天然及重組CRBGP能夠抑制由bFGF誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈劑量依賴性,其IC50為4.8 μ mol/L ;同時(shí)發(fā)現(xiàn)七鰓鰻天然及重組CRBGP對(duì)由bFGF誘導(dǎo)的六日齡雞胚絨毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane,CAM)血管新生具有抑制作用，可應(yīng)用于制備低毒、高效的抗血管新生藥物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1七鰓鰻CRBGP對(duì)由bFGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用效果圖。
[0010]圖2七鰓鰻CRBGP對(duì)由bFGF誘導(dǎo)的六日齡雞胚絨毛尿囊膜血管新生的抑制作用效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明通過(guò)分子篩層析技術(shù)(S^hadex G75)從日本七鰓鰻口腔腺中分離得到電泳純度的七鰓鰻天然CRBGP。
[0012]利用基因克隆手段將七鰓鰻CRBGP基因連接至pEGX-4T-l表達(dá)載體(或其他形式載體)于疋coli Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并采用GST親和層析方法純化重組七鰓鰻CRBGP, 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白質(zhì)，其純度及準(zhǔn)確性與目標(biāo)蛋白相一致。
[0013]實(shí)驗(yàn):
1.MTT法測(cè)定七鰓鰻CRBGP對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0014](I)將狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞接種于96孔板中，并在含有bFGF (終濃度為3ng/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)；
(2)實(shí)驗(yàn)組依次加入不同濃度梯度(5μ L、10 μ L、15 μ L、20 μ L)的七鰓鰻天然CRBGP，對(duì)照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
(3)加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液10 μ L，于37°C，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；
(4)輕輕吸去培養(yǎng)液，并向96孔板中加入DMSO(100 μ L)，在37°C的搖床中振蕩培養(yǎng)10分鐘； (5)利用酶標(biāo)儀測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在492nm處的吸收值；
(6)每組實(shí)驗(yàn)均為3次實(shí)驗(yàn)取平均值；
(7)細(xì)胞的殺傷率=(對(duì)照組吸光度的平均值-實(shí)驗(yàn)組吸光度的平均值)/對(duì)照組吸光度的平均值X 100%。
[0015]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示:表明七鰓鰻CRBGP能夠抑制由bFGF誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈劑量依賴性,其IC50 為 4.8 μ mol/Lo
[0016]2.利用雞絨毛尿囊膜系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)抗血管新生功能測(cè)定。
[0017]選用雞絨毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane, CAM)模型觀察七觸鰻CRBGP對(duì)雞胚血管新生的抑制作用。CAM模型是目前篩選研究抗血管新生藥物和作用機(jī)制的最佳模型之一，具有實(shí)驗(yàn)周期短、結(jié)果快等特性，被廣大學(xué)者認(rèn)可。通常情況下，正常雞胚的血管從第6日開始便迅速形成和擴(kuò)張，此時(shí)血管發(fā)育旺盛，主要以芽生、套疊方式生成。首先采用bFGF (200 ng/embryo)誘導(dǎo)雞胚血管新生，24小時(shí)后采用不同濃度的七鰓鰻CRBGP或等量的PBS作用于雞胚。具體步驟如下:
(1)采用75%的酒精棉球?qū)傎?gòu)入的六日齡雞胚表面擦拭干凈；
(2)使用銼刀在距離胚頭的1/3處挫出Icm2的小窗；
(3)將無(wú)菌的玻璃纖維濾紙片置于CAM內(nèi)有血管處，并在濾紙片上加入bFGF(200 ng)或等量PBS ；
(4)用透明膠帶將小窗封好，于37°C恒溫箱中孵育24小時(shí)；
(5)在濾紙片上加入不同濃度梯度(0.5 μ g>l μ g>5 μ g>10 μ g、20 Ug的七觸鰻天然CRBGP或等量的PBS，并用透明膠帶封好；
(6)繼續(xù)放入37°C恒溫箱中孵育24小時(shí)；
(7)24小時(shí)后，將濾紙片小心揭除，隨即進(jìn)行拍照。
[0018]結(jié)果如圖2所示:與PBS對(duì)照組相比，經(jīng)bFGF處理的CAM血管更加清晰，呈葉脈狀且分枝繁多，血管的數(shù)目和直徑都明顯的增加。當(dāng)于第7日加入0.5 yg的七鰓鰻CRBGP時(shí)，雞胚血管的數(shù)目減少、在藥物處理周圍無(wú)放射狀的密集血管網(wǎng)絡(luò)、血管稀疏并細(xì)小。隨著七鰓鰻CRBGP濃度的增加(I μ g,5 μ gUO μ g)，雞胚血管的主枝出現(xiàn)明顯地?cái)嗔眩艿臄?shù)目也明顯地減少，血管色淡且呈淺黃。當(dāng)于第7日加入20 μ g的七鰓鰻CRBGP時(shí)，雞胚的血管完全被破壞，出現(xiàn)了明顯的無(wú)血管區(qū)域，且血管壁完全溶解。這表明七鰓鰻CRBGP對(duì)由bFGF誘導(dǎo)的雞胚血管新生具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。
【權(quán)利要求】
1.一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104288753SQ201410528552
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】李慶偉, 肖蓉, 劉宇, 姜琪, 王紅艷 申請(qǐng)人:遼寧師范大學(xué)