功能性自組裝納米多肽水凝膠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的功能性自組裝納米多肽水凝膠(RADA16-I/KLT/RGD)，其包含離子互補(bǔ)型自組裝納米多肽RADA16-I、含VEGF模擬多肽片段的KLT功能多肽和含RGD短肽序列的RGD功能多肽。本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽水凝膠既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，是一種優(yōu)良的組織工程框架材料，可以用于組織工程技術(shù)或者細(xì)胞生物學(xué)等科學(xué)研究。本發(fā)明還提供了功能性自組裝納米多肽水凝膠的物理特性、制備方法和用途。
【專利說明】功能性自組裝納米多肽水凝膠

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種功能性自組裝納米多肽水凝膠及其制備方法。本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽水凝膠既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，可用作組織工程框架材料應(yīng)用于血管組織工程領(lǐng)域，還可以用于組織工程技術(shù)或者細(xì)胞生物學(xué)等科學(xué)研究。

【背景技術(shù)】
[0002]1993年張曙光教授等發(fā)現(xiàn)一種可以自組裝的離子互補(bǔ)型多肽，并用其合成了水凝膠。自組裝多肽水凝膠是多肽分子之間通過氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等非共價(jià)鍵自發(fā)形成的穩(wěn)定的聚集體，由此可得到不同結(jié)構(gòu)和功能的材料。其溶解于去離子水后，遇鹽溶液中的離子自發(fā)完成組裝，形成孔隙均勻的，含水豐富的三維框架材料，具有以下的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì):(I)隨著多肽的合成和分離技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，自然多肽非常容易通過人工設(shè)計(jì)、合成而獲得；(2)多肽序列本身來源于自然界，與生物體作用無免疫反應(yīng)和毒副作用；(3)通過多肽序列上的氨基或羧基，很容易對(duì)多肽序列進(jìn)行修飾與修改；(4)具備非常好的表面活性和生物相容性；(5)易于被生物降解，且降解后產(chǎn)物是氨基酸單體，非但無毒，而且還可以作為生物體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。自組裝多肽的這些優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)使其成為優(yōu)良的組織工程框架材料。
[0003]目前，經(jīng)過很多科研工作者的努力研究，多肽的合成已經(jīng)愈加成熟，特別是RADA序列，VEGF模擬片段，RGD短肽序列等都有研究報(bào)道。其中RADA中的一種RADA16-1是目前最常用的自組裝多肽，其氨基酸序列為:Ac- (RADA) 4-NH2 ；RGD短肽序列Arg-Gly-Asp，廣泛存在于粘連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，與細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合，是細(xì)胞貼附的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)；VEGF(vascular endothelial growth factor,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)模擬片段:GGGGKLTWQELYQLKYKGI，可以作為VEGF的類似物，模擬了 VEGF的17-25區(qū)間的螺旋區(qū)域，該區(qū)域能夠激活VEGF受體，因此激活包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在內(nèi)的VEGF相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路。
[0004]將設(shè)計(jì)和篩選出的功能多肽片段如RGD短肽序列或者VEGF模擬多肽片段復(fù)合在離子互補(bǔ)型自組裝多肽RADA16-1的羧基末端，形成RGD功能多肽和KLT功能多肽，其序列分別為 Ac-RGD- (RADA) 4_NH2 和 Ac_GGGGKLTWQELYQLKYKGI_ (RADA) 4_NH2，這樣就復(fù)合了不同功能的生物活性多肽片段以達(dá)到不同的應(yīng)用目的。由于修飾過的多肽分子自組裝成凝膠性能較差，為了促進(jìn)其進(jìn)行自組裝，有科研工作者將RADA16-1多肽和KLT功能多肽以1:1的比率混合(表示為RADA16-1/KLT)，從而保證其可以自組裝形成水凝膠，又附加了 KLT功能多肽的模擬VEGF功能片段的生物活性；同樣RADA16-1多肽和RGD功能多肽以1:1的比率混合(表示為RADA16-1/RGD)，保證了其既能自組裝形成水凝膠又能發(fā)揮RGD功能多肽的促進(jìn)細(xì)胞粘附生物活性。然而RADA16-1/KLT雖然具備了模擬VEGF片段的功能，但是其作為組織工程材料，在細(xì)胞的粘附方面功能較局限，這使得其在實(shí)際應(yīng)用中效率較低；RADA16-1/RGD雖然可以促進(jìn)細(xì)胞粘附，但是對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞并沒有模擬VEGF片段的特殊功能。
[0005]因此需要一種既保留了多肽的自組裝性能，又能夠?qū)崿F(xiàn)多肽功能片段(集合了KLT和RGD兩種功能多肽所含有的功能片段)的特殊功能的自組裝材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究和摸索，獲得了既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的可以成功進(jìn)行自組裝的功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD 水凝膠。
[0007]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝膠(在下文中簡(jiǎn)稱為“RADA16-1/KLT/RGD水凝膠”)，其包含離子互補(bǔ)型自組裝納米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模擬多肽片段的KLT功能多肽，其中RADA16-1多肽、RGD功能多肽和KLT功能多肽混合的摩爾比為2:1:1。
[0008]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，KLT功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模擬多肽片段GGGGKLTWQELYQLKYKGI形成的，RGD功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成功能片段RGD短肽序列形成的。
[0009]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RADA16-1多肽的序列為Ac- (RADA) 4_NH2 ；RGD功能多肽的序列為Ac-RGD- (RADA) 4_NH2 ；KLT功能多肽的序列為Ac_GGGGKLTWQELYQLKYKGI_(RADA) 4-NH2o
[0010]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝膠的方法(在下文中，有時(shí)簡(jiǎn)稱“本發(fā)明的方法”)，該方法包括以下步驟:將RADA16-1多肽、KLT功能多肽和RGD功能多肽的水溶液按2:1:1的摩爾比混合成多肽混合溶液，通過超聲處理使多肽完全溶解并混合均勻，然后在室溫下誘發(fā)上述多肽混合溶液自組裝形成水凝膠。
[0011 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽混合溶液的自組裝可以利用本領(lǐng)域常用的用于多肽自組裝的平衡鹽溶液(例如0.0lM的PBS緩沖液)，或細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，DMEM/F12)來誘發(fā)。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RADA16-1多肽、KLT功能多肽、RGD功能多肽的水溶液分別按1-5%質(zhì)量濃度,優(yōu)選I %質(zhì)量濃度配制。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，上述質(zhì)量濃度僅是示例性的，并不限于其他濃度范圍。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域中制備水凝膠的常規(guī)方法，選擇合適的濃度范圍。
[0013]在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的RADA16-1/KLT/RGD水凝膠在制備組織工程材料中的用途。
[0014]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織工程材料可以用來作為人工血管組織材料。
[0015]在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人工血管，所述人工血管通過將來源于哺乳動(dòng)物的離體血管內(nèi)皮細(xì)胞在本發(fā)明的RADA16-1/KLT/RGD水凝膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)而獲得。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，來源于哺乳動(dòng)物的離體血管內(nèi)皮細(xì)胞取自哺乳動(dòng)物的肺、大動(dòng)脈血管或臍血管。
[0017]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0018]在本發(fā)明中，哺乳動(dòng)物選自豬、馬、牛、兔、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人，優(yōu)選是豬，更優(yōu)選是人。
[0019]本發(fā)明的有益效果
[0020]本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽水凝膠是由離子互補(bǔ)型自組裝納米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模擬多肽片段的KLT功能多肽按摩爾比2:1:1混合而成。這個(gè)比率是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)組的成凝膠效果分析得出的，可以保證混合后的多肽溶液既保留了優(yōu)良的自組裝性能，又附加了多肽功能片段(集合了 VEGF模擬片段和RGD短肽序列兩種功能片段)的生物活性。
[0021]本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝膠可以用來進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)。本發(fā)明的RADA16-1/KLT/RGD水凝膠既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移成血管，使用其進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞三維培養(yǎng)，既可以提供血管內(nèi)皮細(xì)胞一種適宜環(huán)境使其增殖遷移成血管，又可以促進(jìn)其粘附到這種三維框架內(nèi)，從而負(fù)載更多的細(xì)胞，是一種集合了更多功能的更為優(yōu)良的組織工程框架材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是三種多肽溶液按RADA16-1:KLT:RGD = 2:1:1的摩爾比混合后制作樣本在原子力顯微鏡下觀察到的多肽納米纖維的顯微照片，其中圖1-1 (標(biāo)注比例尺1.Ομπι)和圖1-2 (標(biāo)注比例尺300nm)顯示混合后的該功能性自組裝納米多肽在水溶液中呈現(xiàn)纖維樣形態(tài)，為一種納米纖維材料，其纖維直徑約5-15nm，長(zhǎng)度約200_300nm。
[0023]圖2是用鹽溶液(0.0lM的PBS緩沖液)誘發(fā)摩爾比為2:1:1的RADA16-1/KLT/RGD多肽溶液自組裝后得到的水凝膠的照片，如圖2-1和圖2-2顯示，可見此比率的混合多肽溶液有較好的成膠效果，誘發(fā)后呈固態(tài)凝膠樣性狀，含水量極豐富，透明，可以將培養(yǎng)基滲透進(jìn)去來為細(xì)胞提供豐富的營(yíng)養(yǎng)。
[0024]圖3是RADA16-1/KLT/RGD水凝膠脫水制作成的樣本的掃描電鏡顯微照片，其中圖3-1 (放大400倍)和圖3-2 (放大1500倍)顯示其聚合成的聚合物纖維尺寸約10-50 μ m,其形成的網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)的孔徑約10-50 μ m。
[0025]圖4是在固態(tài)水凝膠中接種血管內(nèi)皮細(xì)胞后在倒置相差顯微鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的顯微照片，其中圖4-1 (放大100倍)顯示在A組多肽水凝膠(RADA16-1/KLT水凝膠組)中生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞；圖4-2 (放大100倍)顯示B組多肽水凝膠(RADA16-1/KLT/R⑶水凝膠組)中生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0026]圖5是將接種血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽納米水凝膠消化后通過Α0/ΕΒ染色細(xì)胞懸液后在熒光顯微鏡下的顯微照片(放大100倍)，其中圖5-1顯示RADA16-1/KLT水凝膠組的細(xì)胞染色結(jié)果，圖5-2顯示RADA16-1/KLT/RGD水凝膠組的細(xì)胞染色結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0027]部分術(shù)語定義
[0028]“功能多肽”:在本發(fā)明中，“功能多肽”是指已經(jīng)結(jié)合了所需功能或活性的多肽片段的多肽，例如“RGD功能多肽”含有功能片段RGD短肽序列，而“KLT功能多肽”含有VEGF模擬多肽片段。
[0029]本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝膠的制備方法:
[0030]作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明的功能性自組裝納米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝膠的制備方法可以利用下面的示例性步驟進(jìn)行:
[0031]按RADA16-1 多肽的序列 Ac-(RADA) 4_NH2、RGD 功能多肽序列 Ac-RGD-(RADA)4-NH2和KLT功能多肽序列Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA)4-NH2合成多肽后，將其分別按1%質(zhì)量濃度溶解于生物級(jí)去離子超純水并按摩爾比2:1:1混合后用超聲作用(例如，在20KHz頻率下超聲15分鐘)使其完全溶解混合均勻，后用本領(lǐng)域中常用的鹽溶液如0.0lM的PBS緩沖液誘發(fā)其在室溫(20-25°C )下進(jìn)行自組裝形成功能性自組裝納米多肽水凝膠RADA16-1/KLT/腳。
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是下面的實(shí)施例僅用于給出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而非限制本發(fā)明的范圍。
[0033]實(shí)施例1、多肽的設(shè)計(jì)與合成
[0034]1.1、離子互補(bǔ)型自組裝納米多肽RADA16-1的序列:Ac_(RADA)4_NH2，可以保證混合后多肽溶液發(fā)生自組裝。
[0035]1.2、RGD短肽序列Arg-Gly-Asp廣泛存在于粘連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，與細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合，是細(xì)胞貼附的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，將RADA16-1羧基末端合成功能片段RGD短肽序列即為本發(fā)明所用的RGD功能多肽，其序列為Ac-RGD-(RADA)4-NH2。
[0036]1.3、VEGF模擬多肽片段GGGGGKLTWQELYQLKYKGI，作為 VEGF 的類似物，模擬了 VEGF的17-25區(qū)間的螺旋區(qū)域。該區(qū)域能夠激活VEGF受體，因此激活包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在內(nèi)的VEGF相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路。將RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模擬多肽片段即為本發(fā)明所用的KLT功能多肽，其序列為Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA)4_NH2。
[0037]以上三種多肽合成后均附有其質(zhì)量分析報(bào)告，報(bào)告指明三種多肽純度均在95%以上，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
[0038]實(shí)施例2、多肽溶液的制備及原子力顯微鏡檢測(cè)
[0039]合成的RADA16_1、KLT及RGD三種多肽粉體分別溶解在生物級(jí)去離子超純水中，分別得到三種質(zhì)量濃度均為10g/L(l% )的多肽溶液，用超聲探針20KHz超聲15min，使多肽完全溶解。在經(jīng)過設(shè)計(jì)大量實(shí)驗(yàn)組研究各種比率混合方法的自組裝成凝膠效果后，確定按RADA16-1:KLT:RGD = 2:1:1的摩爾比率來混合。將RADA16-1多肽、KLT功能多肽及RGD功能多肽的水溶液以2:1:1的摩爾比率混合并超聲混勻，得到混合多肽溶液(RADA16-1/KLT/RGD)，準(zhǔn)備用其制備功能性自組裝多肽水凝膠?；旌虾蟮亩嚯娜芤貉杆偈褂?.22 μ m的無菌濾器過濾滅菌備用。多肽溶液稀釋100倍并超聲混勻后，取10 μ I滴到新鮮剝開的云母片上，氮?dú)獯蹈珊笥迷恿︼@微鏡觀察其是否具有納米纖維形態(tài)。
[0040]實(shí)施例3、功能性自組裝多肽水凝膠的制備及掃描電鏡觀察凝膠的顯微結(jié)構(gòu)
[0041]3.1、為了組裝成具有一定形狀的完整的水凝膠，本研究使用transwell小室來完成鹽溶液誘發(fā)自組裝。將所需數(shù)目的transwell小室放入每孔加入400uL 0.0lM的PBS緩沖液的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，將培養(yǎng)板放入37°C孵箱中過夜使transwell小室的基底膜通透。然后將transwell小室中透過的液體吸出，小室中分別加入100 μ L的混合多肽溶液(RADA16-1/KLT/RGD),然后37°C下(此溫度可以加速成膠)孵育至少Ih以凝膠。凝膠形成后取出一個(gè)小室，小心割下基底膜取出凝膠，2.5%戊二醛固定30分鐘后梯度酒精脫水制作掃描電鏡樣本送檢，測(cè)試結(jié)果的顯微照片如圖3。
[0042]3.2、由于RADA16-1/KLT水凝膠的促進(jìn)血管內(nèi)皮內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移活性已被相關(guān)研究證明，因此本研究中采用其作為對(duì)照來證明本發(fā)明所特有的功能活性。使用同樣的方法將RADA16-1多肽與KLT功能多肽溶液按摩爾比率1:1混合并用超聲探針超聲混勻，得到混合多肽溶液A (RADA16-1/KLT)，用其制備多肽水凝膠A，此組用于對(duì)照來證明本發(fā)明的特殊功能。而上面述及的RADA16-1/KLT/R⑶水凝膠則分組為B。用血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM2-MV取代PBS緩沖液加入24孔板的孔中37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜，使培養(yǎng)基緩慢滲透到所有A、B組小室中的水凝膠中，反復(fù)換培養(yǎng)基3次來中和水凝膠中的培養(yǎng)基成分，保證細(xì)胞接種后的滲透壓、PH值及營(yíng)養(yǎng)成分均合適細(xì)胞生長(zhǎng)。從而制備出可以接種細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)的功能性自組裝多肽水凝膠。
[0043]實(shí)施例4、血管內(nèi)皮細(xì)胞在功能性自組裝納米多肽水凝膠的體外三維培養(yǎng)
[0044]將人血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25%的胰酶-EDTA從培養(yǎng)瓶中消化下來，然后調(diào)整細(xì)胞懸液中細(xì)胞的密度為I X 106/ml，各取100 μ L分別接種到Α、Β組小室中的水凝膠中，2小時(shí)后吸出未滲入凝膠中的細(xì)胞懸液。此時(shí)使用的水凝膠是上述制備好的可以接種細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)的功能性自組裝多肽水凝膠。接種后每2天換一次24孔板里面的培養(yǎng)基，來保證小室水凝膠中的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。經(jīng)過5天的培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的形貌、遷移狀態(tài)。然后將小室中的水凝膠用消化酶消化后使用Α0/ΕΒ快速染色30秒后熒光顯微鏡觀察，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，凋亡情況并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析Α、B兩組有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0045]結(jié)果:
[0046]1、制備的多肽溶液經(jīng)超聲后由粘稠渾濁變得澄清，說明其已溶解并均勻。制備原子力顯微鏡檢測(cè)樣本后觀察，可見混合多肽溶液表現(xiàn)出納米纖維樣結(jié)構(gòu)，其纖維直徑約5-15nm，長(zhǎng)度約200-300nm，確實(shí)為納米纖維材料屬性(可見圖1)。
[0047]2、制備的摩爾比率2:1:1的RADA16-1/KLT/RGD的多肽溶液經(jīng)0.0lM的PBS緩沖液誘發(fā)自組裝后得到的水凝膠的照片，其中圖2-1和圖2-2顯示，可見此比率的混合多肽溶液有較好的成膠效果，誘發(fā)后呈固態(tài)凝膠樣性狀，含水量極豐富，透明，可以將培養(yǎng)基滲透進(jìn)去來為細(xì)胞提供豐富的營(yíng)養(yǎng)。制成掃描電鏡樣本后檢測(cè)顯示其聚合成聚合物纖維(如圖3)，尺寸約10-50μπι，其形成的網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)的孔徑約10-50 μ m，而大部分真核細(xì)胞的尺寸約5-30 μ m,適合細(xì)胞在里面粘附遷移生長(zhǎng)。自組裝多肽納米水凝膠材料能夠提供真正意義上的三維培養(yǎng)環(huán)境。
[0048]3、將細(xì)胞接種于多肽水凝膠2小時(shí)并棄去未滲入水凝膠的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)5天后可見B組多肽水凝膠(RADA16-1/KLT/RGD水凝膠)同A組多肽水凝膠(RADA16-1/KLT水凝膠)有相似的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞伸展良好，且互相連接，有圍成管腔的形態(tài)學(xué)趨勢(shì)。RADA16-1/KLT水凝膠已被相關(guān)研究證實(shí)有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管活性，通過本次實(shí)驗(yàn)中比較A、B兩組水凝膠，得出RADA16-1/KLT/RGD水凝膠同RADA16-1/KLT水凝膠一樣具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的活性。
[0049]4、分別將A、B兩組水凝膠用消化酶消化后,Α0/ΕΒ染色細(xì)胞懸液30秒后在倒置相差熒光顯微鏡下觀察，4倍物鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野可見A、B兩組均出現(xiàn)較少凋亡細(xì)胞(少于5 % )(橙色熒光)，說明細(xì)胞在兩種多肽水凝膠中均能較好生存，但是細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度卻有較大差異，其中A組(RADA16-1/KLT水凝膠組)平均每個(gè)視野約45個(gè)細(xì)胞，而B組(RADA16-1/KLT/RGD水凝膠組)平均每個(gè)視野可見約70個(gè)細(xì)胞，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以證明B組(RADA16-1/KLT/RGD水凝膠組)多肽水凝膠負(fù)載的細(xì)胞數(shù)量明顯高于A組，說明了RADA16-1/KLT/RGD水凝膠除了有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，還有促進(jìn)細(xì)胞粘附的活性。
[0050]討論:
[0051]上述所涉及的檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)均支持本發(fā)明所設(shè)計(jì)的既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的功能性自組裝納米多肽水凝膠RADA16-1/KLT/RGD，其中原子力顯微鏡檢測(cè)多肽溶液可以證明其納米纖維材料屬性；并且使用鹽溶液(0.0lM的PBS緩沖液)成功地進(jìn)行了對(duì)RADA16-1多肽、KLT功能多肽、RGD功能多肽按摩爾比率2:1:1混合的多肽溶液的誘發(fā)自組裝成水凝膠；通過掃描電鏡檢測(cè)可見其內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移。在其功能活性方面，同已被證實(shí)具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的RADA16-1/KLT水凝膠組對(duì)照，接種血管內(nèi)皮細(xì)胞后可以發(fā)現(xiàn)RADA16-1/KLT/RGD水凝膠同RADA16-1/KLT水凝膠一樣具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的活性。消化水凝膠制備細(xì)胞懸液后Α0/ΕΒ染色證明在此兩種多肽水凝膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)的細(xì)胞均存活較好，凋亡細(xì)胞少于5%，最為關(guān)鍵的是通過消化水凝膠后對(duì)其中生長(zhǎng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，可證明本發(fā)明中設(shè)計(jì)的RADA16-1/KLT/RGD水凝膠，能在一定時(shí)間內(nèi)使更多數(shù)量的細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，從而可以負(fù)載更多數(shù)量的細(xì)胞，所以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的既能促進(jìn)細(xì)胞粘附，又能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的功能性自組裝納米多肽水凝膠RADA16-1/KLT/RGD是一種集合了更多功能的更為優(yōu)良的組織工程框架材料。
[0052]在實(shí)際應(yīng)用方面，鑒于其合成方便、易于對(duì)其修飾、安全無免疫反應(yīng)毒副反應(yīng)以及易降解等共有優(yōu)點(diǎn)，加上本發(fā)明附加的促進(jìn)細(xì)胞粘附和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移活性功能，使其為細(xì)胞生物學(xué)研究中模擬體內(nèi)環(huán)境對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)提供一定的支持，并且其可以在血管組織工程技術(shù)中，負(fù)載血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植，有較好的體內(nèi)成毛細(xì)血管功能，相比單純注射細(xì)胞療法有更好的細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移，從而對(duì)于組織工程中組織存活起到重要作用，因此其作為一種負(fù)載血管內(nèi)皮細(xì)胞的三維材料在血管組織工程領(lǐng)域有更好的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種功能性自組裝納米多肽水凝膠，其特征在于其包含離子互補(bǔ)型自組裝納米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模擬多肽片段的KLT功能多肽，其中RADA16-1、RGD功能多肽和KLT功能多肽的摩爾比為2:1:1。
2.權(quán)利要求1所述的功能性自組裝納米多肽水凝膠，其特征在于KLT功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模擬多肽片段GGGGKLTWQELYQLKYKGI形成的，且RGD功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成功能片段RGD短肽序列形成的。
3.權(quán)利要求2所述的功能性自組裝納米多肽水凝膠，其特征在于所述RADA16-1多肽的序列為Ac-(RADA) 4-NH2 ;所述RGD功能多肽的序列為Ac-RGD-(RADA) 4-NH2 ;且所述KLT功能多肽的序列為 Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA) 4-NH2。
4.制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的功能性自組裝納米多肽水凝膠的方法，所述方法包括以下步驟:將RADA16-1多肽、KLT功能多肽和RGD功能多肽的水溶液按2:1:1的摩爾比混合成多肽混合溶液，通過超聲處理使多肽完全溶解并混合均勻，然后在室溫下誘發(fā)多肽混合溶液自組裝形成水凝膠。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的功能性自組裝納米多肽水凝膠在制備組織工程材料中的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述組織工程材料是人工血管組織材料。
7.—種人工血管，其特征在于所述人工血管通過將來源于哺乳動(dòng)物的離體血管內(nèi)皮細(xì)胞在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的功能性自組裝納米多肽水凝膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)而獲得。
8.權(quán)利要求7所述的人工血管，其特征在于所述離體血管內(nèi)皮細(xì)胞取自哺乳動(dòng)物的肺、皮膚、大動(dòng)脈血管或臍血管。
9.權(quán)利要求7所述的人工血管，其特征在于所述血管內(nèi)皮細(xì)胞是微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的人工血管，其特征在于所述哺乳動(dòng)物選自豬、馬、牛、兔、貓、猴、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人，優(yōu)選是豬，更優(yōu)選是人。
【文檔編號(hào)】A61L27/52GK104356402SQ201410531552
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】孫念峰, 劉占鰲, 黃文柏, 周冠洲, 范魯峰, 邵聞沖 申請(qǐng)人:孫念峰, 劉占鰲