治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染及相關(guān)病狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及預(yù)防和治療受試者的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法和組合物。本發(fā)明的治療性組合物包含殺白細胞素E和/或D蛋白或多肽和抗殺白細胞素E和/或D抗體。本發(fā)明進一步涉及鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑和LukE/D-白細胞結(jié)合的抑制劑的方法。
【專利說明】治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染及相關(guān)病狀的方法
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01280039370. 5、申請日為2012年6月19日、發(fā)明名稱為"治 療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染及相關(guān)病狀的方法"的中國發(fā)明專利申請的分案申請,原申 請為國際申請?zhí)枮镻CT/US2012/043179的國家階段申請,該國際申請要求申請日為2011年 6月19日,申請?zhí)枮?1/498, 596的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。
[0002] 本申請要求2011年6月19日提交的美國臨時專利申請序列號61/498, 596的權(quán) 益,其據(jù)此通過引用整體并入。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及篩選、治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染和金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀的 方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 金黃色葡萄球菌("S. aureus")是超過25%的人口共生定植的細菌。重要的是, 這種生物能夠突破其初始定植部位,導致細菌傳播和疾病。金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染的 主要原因,是感染性心內(nèi)膜炎以及皮膚和軟組織感染最常見的病原,并且是食物傳染疾病 的四大主要原因之一??傮w來說,在美國醫(yī)院金黃色葡萄球菌每年感染超過120萬患者。耐 抗生素菌株(即,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株),包括耐受被視為對金黃色葡萄 球菌感染的最后防線的抗生素,萬古霉素(vancomycin)的菌株的出現(xiàn)進一步突顯了金黃 色葡萄球菌對人類健康的威脅。這些事實突顯了研發(fā)對這種重要病原體的新型療法的重要 性。
[0006] 金黃色葡萄球菌產(chǎn)生很多不同的毒力因子和毒素,使這種細菌能夠中和并經(jīng)受 住不同種類的免疫細胞,特別是組成身體一級防御系統(tǒng)的白血細胞亞群的攻擊。這些毒 力因子和毒素的產(chǎn)生使金黃色葡萄球菌維持感染狀態(tài)(見Nizet, "Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel Therapeutic Targets, "J. Allergy Clin. Immunol. 120(1) :13-22(2007))。在這些毒力因子中,金黃 色葡萄球菌產(chǎn)生幾種雙組分白細胞毒素,其通過兩種非相關(guān)蛋白或亞基的協(xié)同作用損壞 宿主防御細胞和紅細胞的膜(見Menestrina等人,"Mode of Action of Beta-Barrel Pore-Forming Toxins of the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family,,'Toxic ol. 39(11) :1661-1672(2001))。在這些組分白細胞毒素中,Y-溶血素(HlgAB和HlgCB)和 Pantone-Valentine殺白細胞素(PVL)最有特征。
[0007] 殺白細胞素對哺乳動物細胞的毒性涉及兩個組分或亞基的作用。第一亞基命 名為S類亞基(即,"慢洗脫型"),而第二亞基命名為F類亞基(即,"快洗脫型")。S 和F亞基協(xié)同作用以在白血細胞,包括單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞和中性粒細胞(總 稱為吞噬細胞)上形成孔隙(見Menestrina等人,"ModeofActionofBeta-Barrel Pore-FormingToxinsoftheStaphylococcalAlpha-HemolysinFamily,,'Toxic ol. 39(11) :1661-1672(2001))。雙組分毒素在靶細胞膜上形成孔隙的機制未完全了解。提 出的這些毒素的作用機制涉及S亞基很可能通過受體與靶細胞膜的結(jié)合,接著是F亞基 與S亞基的結(jié)合,從而形成寡聚體,寡聚體依次形成插入祀細胞膜內(nèi)的前孔隙(pre-pore) (Jayasinghe 等人,"The Leucocidin Pore:Evidence for an Octamer With Four LukF Subunits and Four LukS Subunits Alternating Around a Central Axis, ''Protein. Sci. 14(10) :2550-2561 (2005))。雙組分白細胞毒素形成的孔隙通常為陽離子選擇型???隙形成經(jīng)由溶解導致細胞死亡,已經(jīng)報道在靶白血細胞的情況下,這由歸因于陽離子流入 的滲透不平衡引起(Miles 等人,"The Staphylococcal Leucocidin Bicomponent Toxin Forms Large Ionic Channels,''Biochemistry 40(29) :8514-8522(2001))。
[0008] 除PVL (也稱為殺白細胞素S/F-PV或LukSF-PV)和Y -溶血素(HlgAB和HlgCB) 夕卜,已知金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的雙組分白細胞毒素的清單包括殺白細胞素E/D("LukE/D")、 殺白細胞素A/B( "LukAB")和殺白細胞素M/F( "LukMF")。因此,這些雙組分殺白細胞 素的 S 類亞基包括 HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、LukA 和 LukM,而 F 類亞基包括 HlgB、LukD、 LukF-PV、LukB和LukF'-PV。金黃色葡萄球菌S和F亞基并非殺白細胞素特異性。即,它們 可互換,以致其它雙組分組合可在白血細胞中產(chǎn)生功能性孔隙,大大增多了白細胞毒素清 單(Meyer 等人,"Analysis of the Specificity of Panton-Valentine Leucocidin and Gamma-Hemolysin F Component Binding,,'Infect. Immun. 77 (I) : 266-273 (2009)) 〇
[0009] 設(shè)計治療MRSA感染的有效療法特別具有挑戰(zhàn)性。除對甲氧西林和相關(guān)抗生素 的抗性外,還已發(fā)現(xiàn)MRSA具有顯著水平的對大環(huán)內(nèi)酯(例如,紅霉素(erythromycin))、 ¢-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合(例如,Unasyn、Augmentin)和氟喹諾酮(fluoroquinolone) (例如,環(huán)丙沙星(ciprofloxacin))以及對氯潔霉素(clindamycin)、三甲氧節(jié)二氨啼陡 (trimethoprim)/橫胺甲卩惡唑(sulfamethoxisol) (Bactrim)和利福平(rifampin)的抗性。 在嚴重的金黃色葡萄球菌感染情況下,臨床醫(yī)師已經(jīng)采取靜脈注射萬古霉素。然而,已經(jīng)有 金黃色葡萄球菌對萬古霉素抗性的報道。因此,需要研發(fā)有效抗擊金黃色葡萄球菌感染的 新療法。
[0010] 本發(fā)明涉及克服本領(lǐng)域的這些和其它限制。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明的第一方面涉及包含治療有效量的分離殺白細胞素E(LukE)蛋白或其多 肽、分離殺白細胞素D(LukD)蛋白或其多肽,或其組合,和藥學上可接受的載體的組合物。 [0013] 本發(fā)明的另一方面涉及在受試者中對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫的方法。這種 方法涉及按在受試者中對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫有效的量施用本發(fā)明的組合物。
[0014] 本發(fā)明的另一方面涉及包含治療有效量的選自由LukE抗體、LukD抗體或其組合 組成的組的抗體和藥學上可接受的載體的組合物。
[0015] 本發(fā)明的另一方面涉及預(yù)防受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌 相關(guān)病狀的方法。這種方法涉及按預(yù)防受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌 相關(guān)病狀有效的量施用包含選自由LukE抗體、LukD抗體或其組合組成的組的抗體的組合 物。
[0016] 本發(fā)明的再一方面涉及治療受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌 相關(guān)病狀的方法。這種方法涉及按治療受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌 相關(guān)病狀有效的量施用包含LukE/D介導的細胞毒性的一種或多種抑制劑的組合物。
[0017] 本發(fā)明的再一方面涉及預(yù)測金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度的方法。這種方法涉 及培養(yǎng)經(jīng)由來自受試者的液體或組織樣品從感染受試者獲得的金黃色葡萄球菌并且量化 培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表達。將來自所述受試者的樣品中LukE和 /或LukD的量化量與生成少量或不可檢測量的LukE和/或LukD的對照樣品中LukE和/ 或LukD的量做比較,并且基于所述比較預(yù)測金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度。
[0018] 本發(fā)明的另一方面涉及治療患有金黃色葡萄球菌感染的受試者的方法。這種方法 涉及培養(yǎng)經(jīng)由來自受試者的液體或組織樣品從感染受試者獲得的金黃色葡萄球菌并且量 化培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表達。將來自所述受試者的樣品中LukE 和/或LukD的量化量與生成少量或不可檢測量的LukE和/或LukD的對照樣品中LukE和 /或LukD的量做比較,并且基于這種比較確定對受試者的適合療法。所述方法進一步涉及 向受試者施用確定的適合療法以治療金黃色葡萄球菌感染。
[0019] 本發(fā)明的另一方面涉及鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑的方法。這種方法涉及提 供細胞群、含有LukE/D的制劑和候選LukE/D抑制劑。在所述候選抑制劑存在和缺乏時使所 述細胞群暴露于含有LukE/D的所述制劑,并且在所述候選抑制劑存在和缺乏時測量LukE/ D介導的細胞毒性。比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時細胞毒性的測得量并且基于這種 比較鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑。
[0020] 本發(fā)明的另一方面涉及鑒定LukE/D介導的孔隙形成的抑制劑的方法。這種方法 涉及提供一群白細胞、含有LukE和LukD的制劑和候選抑制劑。在所述候選抑制劑存在和 缺乏時使所述白細胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制劑,并且在所述候選抑制劑存在 和缺乏時測量白細胞群上的孔隙形成。比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時孔隙形成的測 得量,并且基于這種比較鑒定LukE/D介導的孔隙形成的抑制劑。
[0021] 本發(fā)明的另一方面涉及鑒定LukE和/或LukD白細胞結(jié)合的抑制劑的方法。這種 方法涉及提供一群白細胞、含有經(jīng)可檢測標記的LukE和LukD的制劑和候選抑制劑。在所 述候選抑制劑存在和缺乏時使所述細胞群暴露于含有經(jīng)可檢測標記的LukE和LukD的所述 制劑,并且在所述候選抑制劑存在和缺乏時測量經(jīng)標記LukE和/或LukD與白細胞群的結(jié) 合。比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時LukE和/或LukD白細胞結(jié)合的測得量,并且基 于這種比較鑒定LukE和/或LukD白細胞結(jié)合的抑制劑。
[0022] 金黃色葡萄球菌作為病原體的巨大成功部分是由于其表達大量損害宿主的因子 的能力。在這些因子中有許多分泌到細胞外環(huán)境的細菌蛋白毒素,在那里它們通過殺傷宿 主細胞起作用。殺白細胞素E/D(LukE/D)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的缺乏特征性的毒素。如 本文所證明,這種毒素靶向并殺傷是涉及于保護宿主免受金黃色葡萄球菌感染的關(guān)鍵免疫 細胞的宿主白細胞。LukE/D對體內(nèi)發(fā)病機制至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)突顯了這種毒素在疾病過程中 的重要性。如本文所述,免疫接種LukE和/或LukD對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生中和抗體。因 此,主動和/或被動疫苗策略提供了預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的新型治療策略。另外,對 LukE/D介導的細胞毒性的直接抑制提供了治療患有金黃色葡萄球菌感染的個體的新方式。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1A-1B顯不,缺乏agr基因座(Aagr Arot)的金黃色葡萄球菌中rot基因的缺 失使在小鼠中的毒力恢復(fù)到野生型("WT")水平并且導致LukE/D的過量生成。圖IA為存 活曲線,顯示Aagr A rot雙突變體在小鼠中表現(xiàn)出WT毒力特征。在靜脈注射約IX IO7CFU 的金黃色葡萄球菌WT、A agr或A agr A rot雙突變體后監(jiān)測小鼠的存活率。每組小鼠的總 數(shù)為N = 6。使用對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗測定曲線之間的統(tǒng)計顯著性。***,p < 0. 0005。 圖IB中,在AagrArot雙突變體中,白細胞毒素的生成恢復(fù)。示出了來自下列菌株的 TCA沉淀細菌培養(yǎng)上清液(于RPMI+CAS中生長5h)的蛋白質(zhì)樣品的免疫印跡:WT、Aagr 和AagrArot。陰性對照條帶含有來自各白細胞毒素缺失突變體(AlukE/D、AlukA/B、 Ahla、AhlgC)的TCA沉淀上清液。還探測了所有LukE免疫印跡中AlukE/DAhlgACB雙 突變體胞外蛋白作為LukE抗體交叉反應(yīng)性的對照。
[0025] 圖2A-2C說明,rot單獨缺失導致動物體內(nèi)的超高毒力,去阻遏引起的表現(xiàn)型和作 為結(jié)果發(fā)生的LukE/D過量生成。圖2A的存活曲線示出了與親本W(wǎng)T菌株相比,A r〇t突變體 的超高毒力。在靜脈注射約I X IO7CFU的金黃色葡萄球菌WT和A r〇t菌株后監(jiān)測小鼠的存 活率。每組小鼠的總數(shù):WT,N= 17 ; A r〇t,N= 12。在轉(zhuǎn)錄阻遏因子Rot缺乏時LukE/D的生 成增加,而其它白細胞毒素的生成很大程度上未受影響。圖2B的免疫印跡中示出了來自下 列菌株的扣4沉淀細菌培養(yǎng)上清液(于1?^1+045中生長511)的蛋白質(zhì)樣品 :11'和八1"的。陰 性對照條帶含有來自各毒素-rot雙突變體(Arot A lukE/D、A rot A lukA/B、ArotAhla 和ArotAhlgACB)的TCA沉淀上清液。還探測了所有LukE免疫印跡中ArotAlukE/ D A hlgACB三突變體胞外蛋白作為LukE抗體交叉反應(yīng)性的對照。如圖2C的存活曲線所示, Arot突變體的超高毒力是由于LukE/D的生成增加。靜脈注射約IX IO7CFU的金黃色葡萄 球菌WT、A rot和A rot A lukE/D后監(jiān)測小鼠的存活率。使用對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗測 定存活曲線之間的統(tǒng)計顯著性。#,P彡〇? 005 ;*#,p彡0? 0005。
[0026] 圖3A-3B顯示,Rot與lukE/D啟動子結(jié)合并且阻遏基因表達。如圖3A所示,最 佳lukE/D基因表達依賴于Rot的去阻遏。lukE/D啟動子區(qū)與GFP的轉(zhuǎn)錄融合用于測量在 下列菌株背景(WT、Aagr、Arot和AagrArot)下的肉湯培養(yǎng)中啟動子的活化。隨時間推 移測量GFP熒光并且在標準化為600nm下的細菌光密度后將值表示為相對熒光單位(RFU)。 所示值為一式三份進行的3次實驗的結(jié)果。圖3B中,Rot與lukE/D啟動子結(jié)合。圖3B是 與M280鏈霉親和素(streptavidin)磁珠結(jié)合并用金黃色葡萄球菌全細胞溶解產(chǎn)物培育的 生物素化基因內(nèi)DNA(非特異性)或lukE/D啟動子DNA的啟動子拉下的免疫印跡。經(jīng)由免 疫印跡使用抗Rot抗體檢測Rot。
[0027] 圖4A-4F說明,在系統(tǒng)感染的小鼠模型中AlukE/D單突變體的毒力顯著減弱。 圖4A和4B示出了對金黃色葡萄球菌Newman中l(wèi)ukE/D缺失的驗證。圖4A中,示出了具 有IukE特異性引物的金黃色葡萄球菌基因組DNA的PCR。圖4B中示出了來自下列菌株的 TCA沉淀細菌培養(yǎng)上清液(于RPMI+CAS中生長5h)的蛋白質(zhì)樣品的免疫印跡:WT、A IukE/ D、A lukE/D ::plukE/D、A hlgACB 和 A hlgACB。還探測了 A lukE/D 突變體胞外蛋白作為 LukE抗體交叉反應(yīng)性的對照。圖4C-4F顯示,在小鼠中A lukE/D突變體的毒力嚴重受損。 圖4C和4D中,靜脈注射約IX IO7CFU (圖4C)或約IX IO8CFU (圖4D)的金黃色葡萄球菌 WT、A lukE/D和A lukE/D: :plukE/D菌株后監(jiān)測小鼠的存活率。每組小鼠的總數(shù)為N = 6。使用對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗測定存活曲線之間的統(tǒng)計顯著性。**,p < 0. 005 ;***, p彡0. 0005。圖4E和4F描繪了對感染約I X IO7CFU對圖4C和4D描述的相同菌株96h后, 來自腎臟的細菌CFU(圖4E)和宏觀病理學(圖4F)的列舉。箭頭指出腎膿腫的位置。使 用單因素(I-Way)ANOVA與Tukey的多重比較后續(xù)檢驗測定統(tǒng)計顯著性。**,p < 0. 005 ; #木,P < 0. 0005。
[0028] 圖5A-5E顯示,LukE/D對人免疫細胞有毒并且在人免疫細胞中形成孔隙。圖5A為 細胞活力曲線,顯示純化重組LukE/D對人單核細胞樣細胞系THP-I有毒。用重組LukE、LukD 或LukE+LukD (LukE/D)的混合物使THP-I細胞系中毒。在中毒Ih后使用CellTiter監(jiān)測 細胞活力,其中經(jīng)培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100 %能活。結(jié)果表示三份樣品的平均數(shù)土 S. D.。 如圖5B的細胞活力曲線所示,純化重組LukE/D對人HL60細胞系無毒。如以上使HL60細 胞系中毒并且在中毒Ih后使用CellTiter監(jiān)測細胞活力,其中經(jīng)培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為 100%能活。相反,圖5C的細胞活力曲線顯示,純化重組LukE/D對原代人(左圖)和原代 鼠(右圖)中性粒細胞(也稱為多形核中性粒細胞或PMN)有毒。如以上使PMN中毒并且 在中毒Ih后使用CellTiter監(jiān)測細胞活力,其中經(jīng)培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100%能活。如 圖所示,LukE/D通過在細胞膜上形成孔隙介導對宿主細胞THP-I細胞的細胞毒性。用 純化LukE/D培育THP-I和HL60細胞,并且用溴化乙錠并入測定測量孔隙形成。示出了對 于THP-I和HL60而言,三次實驗的平均熒光。圖5E示出了經(jīng)LukE/D處理(30 ii g/ml)的 和對照(無毒性)THP-I細胞的溴化乙錠攝取的熒光顯微鏡圖像。
[0029] 圖6A-6B說明,LukE/D細胞毒性經(jīng)親和力純化a -LukE多克隆抗體中和。在用 0. I ii g a -LukE多克隆抗體或免疫前血清培育后,用I. 5 ii g的重組LukE/D使THP-I細胞 中毒。分別使用CellTiter和溴化乙錠監(jiān)測細胞活力(圖6A)和孔隙形成(圖6B)。對于 CellTiter測定而言,經(jīng)培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100%活力。結(jié)果表示兩份樣品的平均數(shù)土 標準偏差(S. D.)。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本發(fā)明的第一方面涉及包含治療有效量的分離LukE蛋白或其多肽、分離LukD蛋 白或其多肽或其組合,和藥學上可接受的載體的組合物。
[0032] 在本發(fā)明的一個實施方案中,所述組合物包含分離LukE蛋白或多肽。在本發(fā)明的 另一實施方案中,所述組合物包含分離LukD蛋白或多肽。在本發(fā)明的再一實施方案中,所 述組合物包含LukE和LukD蛋白或多肽。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的這個方面,適合的分離LukE蛋白包括源自任何金黃色葡萄球菌菌 株的LukE蛋白。來自適合本發(fā)明組合物的不同金黃色葡萄球菌菌株的LukE蛋白的氨基酸 序列示于以下表1中(即,SEQ ID No: 1-10)。表1的SEQ ID NO: 11是不同金黃色葡萄球 菌菌株的LukE蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukE共有序列。相應(yīng)地,在本發(fā)明的 一個實施方案中,分離LukE蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實施 方案中,分離LukE蛋白包含與SEQ ID NO: 11具有約70-80%序列相似性,更優(yōu)選與SEQ ID NO: 11具有約80-90%序列相似性,并且更優(yōu)選與SEQ ID NO: 11具有約90-95%序列相似 性,并且最優(yōu)選與SEQ ID NO: 11具有約95-99%序列相似性的氨基酸序列。
[0034] 在本發(fā)明的另一實施方案中,所述組合物包含LukE的分離免疫原性多肽。適合的 LukE多肽長度為約50至約100個氨基酸。更優(yōu)選地,LukE多肽長度介于約100-200個氨 基酸之間,更優(yōu)選長度介于約200-250個氨基酸之間,并且最優(yōu)選長度介于約250-300個氨 基酸之間。全長LukE的N端氨基酸殘基表示天然分泌/信號序列。因此,SEQ ID NO: 1-10 的每一個和SEQ ID NO: 11中的氨基酸殘基29-311表示LukE的"成熟"分泌形式。相應(yīng) 地,SEQ ID NO: 1-10的每一個和SEQ ID NO: 11中的氨基酸殘基1-311稱為LukE的"未成 熟"形式。相應(yīng)地,在本發(fā)明的一個實施方案中,LukE多肽包含SEQ ID N0:11的氨基酸殘 基29-311。可選地,本發(fā)明的LukE多肽包含SEQ ID N0:11的氨基酸殘基48-291、氨基酸 29-301或氨基酸48-301。這些LukE多肽缺乏LukE活性,但是保持了抗原性。在任何一種 情況下,適合的LukE多肽還包括包含與SEQ ID NO:ll的氨基酸殘基29-311、SEQ ID NO:ll 的氨基酸殘基48-291、SEQ ID NO: 11的氨基酸殘基29-301或SEQ ID NO: 11的氨基酸殘基 48-301具有約70-80%序列相似性,優(yōu)選80-90%序列相似性,更優(yōu)選90-95%序列相似性 且最優(yōu)選95-99 %序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的這個方面,適合的分離LukD蛋白包括源自任何金黃色葡萄球菌菌 株的那些蛋白。來自適合本發(fā)明組合物的不同金黃色葡萄球菌菌株的LukD蛋白的氨基酸 序列示于以下表2中(即,SEQ ID No:12-21)。表2的SEQ ID N0:22是不同金黃色葡萄球 菌菌株的LukD蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukD共有序列。相應(yīng)地,在本發(fā)明的 一個實施方案中,分離LukD蛋白包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實施 方案中,分離LukD蛋白包含與SEQ ID NO: 22具有約70-80%序列相似性,更優(yōu)選與SEQ ID NO: 22具有約80-90%序列相似性,并且更優(yōu)選與SEQ ID NO: 22具有約90-95%序列相似 性,并且最優(yōu)選與SEQ ID N0:22具有約95-99%序列相似性的氨基酸序列。
[0036] 在本發(fā)明的另一實施方案中,所述組合物包含LukD的分離免疫原性多肽。適合的 LukD多肽長度為約50至約100個氨基酸。更優(yōu)選地,LukD多肽長度介于約100-200個氨基 酸之間,更優(yōu)選長度介于約200-250個氨基酸之間,并且最優(yōu)選長度介于約250-300個氨基 酸之間。全長LukD的N端氨基酸殘基表示天然分泌/信號序列。因此,SEQ ID NO: 12-21 的每一個和SEQ ID NO:22中的氨基酸殘基27-327表示LukD的成熟分泌形式。相應(yīng)地, SEQ ID NO: 12-21的每一個和SEQ ID NO:22中的氨基酸殘基1-327稱為LukD的"未成熟" 形式。相應(yīng)地,在本發(fā)明的一個實施方案中,LukE多肽包含SEQ ID N0:22的氨基酸殘基 27-327??蛇x地,本發(fā)明的LukE多肽包含SEQ ID N0:22的氨基酸殘基46-307、27-312和 46-312。這些LukD多肽缺乏LukD活性,但是保持了抗原性。在任何一種情況下,適合多肽 還包括包含與SEQ ID NO: 22的氨基酸殘基27-327、SEQ ID NO: 22的氨基酸殘基46-307、 SEQ ID N0:22的氨基酸殘基27-312或SEQ ID N0:22的氨基酸殘基46-312具有約70-80% 序列相似性,優(yōu)選80-90 %序列相似性,更優(yōu)選90-95 %序列相似性且最優(yōu)選95-99%序列 相似性的氨基酸序列的那些多肽。
[0037] 表1-金黃色葡萄球菌LukE序列比對
[0038] 金黃色葡萄球菌菌株
【權(quán)利要求】
1. 一種組合物,包含 治療有效量的分離LukE蛋白或其多肽、分離LukD蛋白或其多肽,或其組合,和 藥學上可接受的載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述分離LukE蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基 酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述分離LukE多肽包含SEQ ID NO: 11的氨基 酸殘基48-291。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述分離LukD蛋白包含SEQ ID NO:22的氨基 酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述分離LukD多肽包含SEQ ID NO:22的氨基 酸殘基46-307。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述組合物的分離蛋白或其多肽與免疫原性載 體分子連接。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物,其中所述免疫原性載體分子與免疫原性蛋白或肽共 價或非共價結(jié)合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物,其中所述免疫原性載體分子選自由牛血清白蛋白、 雞蛋卵白蛋白、鑰孔隙戚血藍蛋白、破傷風類毒素、白喉類毒素、甲狀腺球蛋白、肺炎球菌莢 膜多糖、CRM 197和腦膜炎球菌外膜蛋白組成的組。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,進一步包含一種或多種另外的選自由以下組成的組 的金黃色葡萄球菌抗原:a溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、 凝集因子B、纖連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白、彈性蛋白結(jié)合蛋白、 MHC類似蛋白、多糖細胞內(nèi)粘連蛋白、0溶血素、S溶血素、y溶血素、Panton-Valentine 殺白細胞素、殺白細胞素 A、殺白細胞素 B、殺白細胞素 M、剝脫性毒素 A、剝脫性毒素 B、V8蛋 白酶、透明質(zhì)酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、腸毒素、中毒性休克綜合征毒素-1、聚-N-琥 珀酰0-1 - 6葡萄糖胺、過氧化氫酶、0 -內(nèi)酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素結(jié)合蛋白、趨 化性抑制蛋白、補體抑制劑、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和識別宿主分子的微生物表 面組分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,進一步包含佐劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物,其中所述佐劑選自由鞭毛蛋白、弗氏完全或 不完全佐劑、氫氧化鋁、溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、二硝基苯酚、 iscomatrix和脂質(zhì)體聚陽離子DNA顆粒組成的組。
12. -種在受試者中對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫的方法,包括: 按在受試者中對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫有效的量施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的 組合物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述組合物進一步包含一種或多種另外的選 自由以下組成的組的金黃色葡萄球菌抗原:a溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝 固酶、凝集因子A、凝集因子B、纖連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白、彈 性蛋白結(jié)合蛋白、MHC類似蛋白、多糖細胞內(nèi)粘連蛋白、0溶血素、S溶血素、Y溶血素、 Panton-Valentine殺白細胞素、殺白細胞素 A、殺白細胞素 B、殺白細胞素 M、剝脫性毒素 A、 剝脫性毒素 B、V8蛋白酶、透明質(zhì)酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、腸毒素、中毒性休克綜合 征毒素-1、聚-N-琥珀酰0-1 -6葡萄糖胺、過氧化氫酶、¢-內(nèi)酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、 青霉素結(jié)合蛋白、趨化性抑制蛋白、補體抑制劑、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和識別 宿主分子的微生物表面組分。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述組合物進一步包含佐劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,進一步包括: 在施用包含分離LukE蛋白、分離免疫原性LukE片段、分離LukD蛋白、分離免疫原性 LukD片段或其組合的組合物之前、之后或同時向受試者施用佐劑。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述施用在受試者中誘導對金黃色葡萄球菌的 中和免疫反應(yīng)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述金黃色葡萄球菌感染為耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌(MRSA)感染或甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)感染。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述施用經(jīng)口服、通過吸入、通過鼻內(nèi)滴注、局 部、經(jīng)皮、腸胃夕卜、皮下、靜脈注射、動脈內(nèi)注射、肌肉注射、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過敷用到粘 膜上進行。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,進一步包括重復(fù)所述施用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述受試者為嬰兒、青少年、成人或老人。
21. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述受試者為免疫力低下的青少年、成人或老 人。
22. -種治療或預(yù)防受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀的方 法,包括: 按預(yù)防受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀有效的量施用組 合物,所述組合物包含殺白細胞素 E(LukE)抗體、殺白細胞素 D(LukD)抗體或其組合和藥學 上可接受的載體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,進一步包括 施用選自由抗感染劑、抗生素試劑、抗菌劑組成的組的試劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中所述金黃色葡萄球菌感染為MRSA感染或MSSA 感染。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中所述金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀選自由皮膚損傷 和感染、組織膿腫、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、燙傷樣皮膚綜合征、敗血病、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心肌 炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合征組成的組。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中所述施用經(jīng)口服、通過吸入、通過鼻內(nèi)滴注、局 部、經(jīng)皮、腸胃夕卜、皮下、靜脈注射、動脈內(nèi)注射、肌肉注射、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過敷用到粘 膜上進行。
27. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,進一步包括重復(fù)所述施用。
28. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中所述受試者為嬰兒、青少年、成人或老人。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中所述受試者為免疫力低下的青少年、成人或老 人。
30. -種治療受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀的方法,包 括: 按治療受試者金黃色葡萄球菌感染和/或金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀有效的量施用包 含LukE/D介導的細胞毒性的一種或多種抑制劑的組合物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述抑制劑為蛋白質(zhì)或肽抑制劑、核酸抑制劑 或小分子抑制劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑為LukE 抑制劑。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法,其中所述LukE抑制劑是識別SEQ ID NO: 11的氨基 酸序列中的表位的抗體。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑為LukD 抑制劑。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法,其中所述LukD抑制劑是識別SEQ ID NO: 22的氨基 酸序列中的表位的抗體。
36. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑包含 LukE/D受體拮抗劑。
37. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑抑制 LukE和LukD的相互作用。
38. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑抑制 LukE、LukD或LukE/D與白細胞的質(zhì)膜結(jié)合。
39. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑防止 LukE/D寡聚體復(fù)合物形成。
40. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑抑制 LukE/D介導的細胞孔隙。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑包含環(huán)糊 精化合物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述LukE/D介導的細胞毒性的抑制劑是誘導毒 素阻遏因子(Rot)的試劑。
43. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,進一步包括 施用選自由抗感染劑、抗生素試劑、抗菌劑組成的組的試劑。
44. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述金黃色葡萄球菌感染為MRSA感染或MSSA 感染。
45. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述金黃色葡萄球菌相關(guān)病狀選自由皮膚損傷 和感染、組織膿腫、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、燙傷樣皮膚綜合征、敗血病、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心肌 炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合征組成的組。
46. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述施用經(jīng)口服、通過吸入、通過鼻內(nèi)滴注、局 部、經(jīng)皮、腸胃夕卜、皮下、靜脈注射、動脈內(nèi)注射、肌肉注射、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過敷用到粘 膜上進行。
47. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,進一步包括重復(fù)所述施用。
48. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述受試者為嬰兒、青少年、成人或老人。
49. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中所述受試者為免疫力低下的青少年、成人或老 人。
50. -種預(yù)測受試者金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度的方法,包括: 培養(yǎng)來自于從感染受試者獲得的液體或組織樣品的金黃色葡萄球菌; 量化培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表達或生成; 比較來自所述受試者的樣品中LukE和/或LukD的量化量與生成少量或不可檢測量的 LukE和/或LukD的對照樣品中LukE和/或LukD的量;并且 基于所述比較預(yù)測金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法,其中所述量化包括: 測量培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法,其中所述量化包括: 測量培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中l(wèi)ukE和/或lukD mRNA表達的水平。
53. -種治療患有金黃色葡萄球菌感染的受試者的方法: 培養(yǎng)來自于從感染受試者獲得的液體或組織樣品的金黃色葡萄球菌; 量化培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表達或生成; 比較來自所述受試者的樣品中LukE和/或LukD的量化量與生成少量或不可檢測量的 LukE和/或LukD的對照樣品中LukE和/或LukD的量; 基于所述比較確定對所述受試者的適合療法;并且 向所述受試者施用所述確定療法以治療金黃色葡萄球菌感染。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法,其中所述量化包括: 測量培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法,其中所述量化包括: 測量培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中l(wèi)ukE和/或lukD mRNA表達的水平。
56. -種鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑的方法,包括: 提供細胞群; 提供含有LukE和LukD的制劑; 提供候選抑制劑; 在所述候選抑制劑存在和缺乏時使所述細胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制劑; 測量暴露細胞群中LukE/D介導的細胞毒性水平; 比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時LukE/D細胞毒性的測量水平;并且 基于所述比較鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法,其中在所述候選抑制劑存在下,與其缺乏時相比, LukE/D介導的細胞毒性水平降低鑒定LukE/D細胞毒性的抑制劑。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法,進一步包括: 提供細胞毒性的經(jīng)標記標志物; 在所述暴露之前、同時或之后,使所述細胞群與細胞毒性的經(jīng)標記標志物接觸; 檢測細胞毒性的經(jīng)標記標志物;并且 基于所述檢測測量所述細胞群中LukE/D介導的細胞毒性水平。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法,其中所述細胞毒性的經(jīng)標記標志物為細胞活力染 料、不能透過細胞的染料和/或細胞溶解的標志物。
60. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法,其中所述細胞群包括白細胞群。
61. -種鑒定LukE/D介導的孔隙形成的抑制劑的方法,包括: 提供一群白細胞; 提供含有LukE和LukD的制劑; 提供候選抑制劑; 在所述候選抑制劑存在和缺乏時使所述白細胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制 劑; 測量在所述候選抑制劑存在和缺乏時所述白細胞群中的孔隙形成; 比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時孔隙形成的測得量;并且 基于所述比較鑒定LukE/D介導的孔隙形成的抑制劑。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法,其中在所述候選抑制劑存在下,與其缺乏時相比,孔 隙形成減少鑒定LukE/D介導的孔隙形成的抑制劑。
63. -種鑒定LukE和/或LukD-白細胞結(jié)合的抑制劑的方法,包括: 提供一群白細胞; 提供含有經(jīng)可檢測標記的LukE和LukD的制劑; 提供候選抑制劑; 在所述候選抑制劑存在和缺乏時使所述細胞群暴露于含有經(jīng)可檢測標記的LukE和 LukD的所述制劑; 測量在所述候選抑制劑存在和缺乏時經(jīng)標記LukE和/或LukD與所述白細胞的結(jié)合; 比較在所述候選抑制劑存在和缺乏時LukE和/或LukD-白細胞結(jié)合的測得量;并且 基于所述比較鑒定LukE和/或LukD-白細胞結(jié)合的抑制劑。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法,其中在所述候選抑制劑存在下,與其缺乏時相比, LukE和/或LukD-白細胞結(jié)合減少鑒定LukE和/或LukD-白細胞結(jié)合的抑制劑。
【文檔編號】A61P31/04GK104474531SQ201410532443
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月19日
【發(fā)明者】V·J·托雷斯, F·阿朗佐 申請人:紐約大學