一種表面具有l(wèi)-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面具有L-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法。通過多巴胺自聚合在基底材料上形成牢固的連接層，然后采用多巴胺與具有催化內(nèi)源性一氧化氮供體釋放一氧化氮的末端含氨基或巰基的化合物形成催化活性交聯(lián)層，并通過聚多巴胺層和催化活性層的交替沉積，在基底表面獲得牢固結合的“夾心”形式的催化活性涂層，再利用表面聚多巴胺層中的氨基與促細胞粘附多肽(L-手征性)的羧基結合，并通過涂層表面醌基固定L-氨基酸或L-二肽獲得具有L-手征性的涂層表面。本發(fā)明制備方法簡單，條件溫和，制備的涂層具有與基底材料結合牢固的優(yōu)點，通過在涂層表面引入促細胞粘附多肽獲得多功能的生物活性表面，并通過在表面構建L-手征性同時增強催化活性層催化釋放一氧化氮和促細胞生長的能力。
【專利說明】一種表面具有[-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程功能材料，尤其是具有優(yōu)異抗凝血和促內(nèi)皮細胞粘附、生長功能的材料制備【技術領域】。

【背景技術】
[0002]心血管器械植入體內(nèi)后出現(xiàn)的抗凝血性能不足和內(nèi)皮化延遲所導致的臨床失效問題，已成為制約其應用和發(fā)展的難題。兼具抗凝血和促內(nèi)皮細胞粘附、生長的多功能生物活性材料已成為血液接觸材料發(fā)展的趨勢。現(xiàn)有的方法是將抗凝血和促內(nèi)皮兩類生物活性分子分別固定在材料表面，而選用的抗凝血活性分子，通常是肝素、水蛭素、血栓改性蛋白等生物單分子，類似的方法需要材料表面具有較多的反應性位點，但由于固體材料表面的接枝位點有限、生物大分子的空間位阻大等原因往往難以同時在材料表面實現(xiàn)這兩種功倉泛。
[0003]一氧化氮是內(nèi)皮細胞分泌的信號分子，具有抗血小板激活和聚集、舒張血管等抗凝血功能，已有通過在材料表面固定胱胺、硒代胱胺等催化內(nèi)源性供體釋放一氧化氮的報道。材料表面或內(nèi)部固定催化活性分子，類似于酶固定化技術，催化反應要在固體上的催化活性位點發(fā)生，而血漿中的蛋白，包括內(nèi)源性供體，從血漿中吸附到催化活性位點的傳質(zhì)過程由于受到固體材料的阻礙，實際催化活性往往不高?，F(xiàn)有研究表明由氨基酸形成的1-手征性表面(如固定卜半胱氨酸的表面)可以促進蛋白質(zhì)的表面吸附，因而構建的卜手征性表面能夠加快內(nèi)源性供體(蛋白質(zhì))從液體環(huán)境到達催化位點，加速勵的釋放。并且1-手征性表面能夠吸附更多的蛋白，將為粘附的細胞提供更多的營養(yǎng)，從而促進細胞的生長。通過“夾心式”的涂層設計，除了使催化活性層不占用表面接枝位點而外，涂層的最底層和最外層均為聚多巴胺層。聚多巴胺層單獨作為接枝生物分子的連接層，已經(jīng)有較多的報道，由于其卓越的粘附性能，幾乎能牢固地粘附在所有材料表面，因而這種“夾心式”的涂層設計能夠增加涂層的穩(wěn)定性和牢固性。聚多巴胺表面主要具有兩類反應性位點，即氨基和醌基。研究顯示材料表面固定促細胞粘附肽往往只需較少的量(約細“/⑽2級別)即可，通過最外層聚多巴胺表面的氨基與促細胞粘附多肽(匕手征性)中的羧基反應而將其固定在表面，以促進內(nèi)皮細胞的表面粘附。另外，通過聚多巴胺表面醌基固定分子量較小的1-氨基酸或二肽，使材料表面具有較多的手征性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法。以“夾心式”涂層中的聚多巴胺層作為中間連接層，增強涂層粘附的牢固性；以多巴胺與催化活性分子交聯(lián)形成催化釋放一氧化氮層；以在涂層表面固定促細胞粘附多肽促進內(nèi)皮細胞粘附；以在表面接枝小分子匕氨基酸、二肽和促細胞粘附多肽獲得具有[-手征性的表面。
[0005]本發(fā)明涉及的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，包括如下步驟:
[0006]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0007]8、將樣品放置于邱=6-9的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為 0.01^/1111-101118/1111,? 10-30。〇下，反應 1-2411 ；
[0008]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0009]0、將步驟所得樣品置于邱=6-9的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和具有催化內(nèi)源性一氧化氮供體釋放一氧化氮的末端含氨基或巰基的化合物，使兩者分別的終濃度為
0.0111^/1111-1011^/1111，在 10-301^下，反應 1-2411 ；
[0010]2、重復步驟；
[0011]？、重復步驟1次或多次，然后重復8、步驟；
[0012]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0013]在濃度為50禮的123溶液中依次加入含有羧基的促細胞粘附多肽、順3和￡0(:,使多肽中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:1-5，在10-301下，反應1-2處，用蒸餾水清洗3次，每次5111111 ；
[0014]1將6步驟所得樣品置于邱=6-9的11*18緩沖溶液中，加入[-型氨基酸或卜型二肽，使溶液的終濃度為0.01呢加1-10呢加1，在10-301下，反應1-2處，蒸餾水清洗3次，每次5111111，得到目標材料。
[0015]采用本發(fā)明方法制備的一種表面具有[-手征性的催化活性多功能生物活性涂層，具有優(yōu)異的催化人體內(nèi)源性供體釋放顯的能力，有效地抑制血小板在材料表面的激活和聚集，同時具有較好地促進內(nèi)皮細胞粘附和生長功能。本發(fā)明制備的催化活性層處于涂層內(nèi)部，而涂層表面接枝的是空間位阻相對較小的氨基酸、二肽或多肽，能夠克服固體表面反應性位點有限的缺陷。
[0016]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益之處在于:
[0017]1)目前報道的兼具抗凝血和促內(nèi)皮功能化表面的制備通常采用在材料表面同時固定抗凝血和促內(nèi)皮的兩種生物分子，由于材料表面反應性官能團相對較少和空間位阻的存在，類似方法很難實現(xiàn)。本發(fā)明將具有催化內(nèi)源性供體釋放顯的交聯(lián)層負載在涂層內(nèi)部，不占據(jù)表面反應性位點；
[0018]2)催化活性層中的催化活性二硫或二硒位點在催化反應過程中會涉及二硫或二硒鍵的斷裂和復原，如果僅僅通過催化活性分子與多巴胺交聯(lián)構建催化活性層，可能會存在穩(wěn)定性不好的缺陷，本發(fā)明并將具有較好粘附性的聚多巴胺層引入并形成“夾心”式，大大提高了涂層與基底材料以及涂層內(nèi)部的穩(wěn)定性；
[0019]3)已有在材料表面固定無手性催化活性分子，如胱胺和硒代胱胺構建催化活性層的報道，由于催化反應需要在固體上的催化活性位點處進行，內(nèi)源性供體從液相到固相的傳質(zhì)受阻，催化效率低。本發(fā)明在表面固定小分子的匕氨基酸或匕二肽制備匕手征性表面，加快傳質(zhì)過程，催化效率高；
[0020]4)已有在材料表面固定促細胞粘附多肽，如或即―的報道。然而細胞粘附多肽只促進細胞粘附，細胞在材料表面的生長需要蛋白質(zhì)的支持，研究表明[手征性表面有利于蛋白質(zhì)的表面吸附，細胞生長狀態(tài)更好。
[0021]下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為膠原激活劑存在條件下，按實施例1方法制備的表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層表面血小板粘附的熒光照片；
[0023]圖2為膠原激活劑存在條件下，按實施例1方法“步制備的催化活性多層膜表面血小板粘附的熒光照片。

【具體實施方式】
[0024]以下實施例中的試劑，除特別注明的外，生化試劑均為生物純，化學試劑均為分析純。
[0025]實施例1
[0026]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0027]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0028]8、將樣品放置于邱=8的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.5呢加1，在301下，反應811 ；
[0029]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0030]0、將步驟所得樣品置于邱=8的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和胱胺，使兩者分別的終濃度為2呢加1和1呢加1，在301^下，反應811 ；
[0031]2、重復步驟；
[0032][、重復^工…工步驟^次’然后重復^工步驟；
[0033]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0034]在濃度為50禮的123溶液中依次加入順3和￡0(:,使中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:3，在301下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5-11 ；
[0035]1將步驟所得樣品置于邱=8的11*18緩沖溶液中，加入卜半胱氨酸，使溶液的終濃度為0.51118/1111，在10-30。(^下，反應1-2411，蒸懼水清洗3次，每次5111111，得到目標材料。
[0036]實施例2
[0037]—種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0038]4、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0039]8、將樣品放置于邱=7的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.3呢加1，在251下，反應1211 ；
[0040]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用吧干燥；
[0041〕 0、將步驟所得樣品置于邱=7的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和硒代胱胺，使兩者分別的終濃度為0.5呢加1和0.1呢加1，在251下，反應12匕；
[0042]2、重復步驟；
[0043]？、重復步驟1次，然后重復8、?:步驟；
[0044]I通過￡0(:/順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0045]在濃度為50禮的123溶液中依次加入即―、順3和20?:，使卿八中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:4，在251下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5-11 ；
[0046]1將步驟所得樣品置于邱=7的11*18緩沖溶液中，加入卜甘氨酸，使溶液的終濃度為0.5呢加1，在251下，反應12匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0047]實施例3
[0048]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0049]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0050]8、將樣品放置于邱=7.5的作匕緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為11118/1111，在25。〇下，反應1811 ；
[0051]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0052]0、將步驟所得樣品置于邱=7.5的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和硒代胱胺，使兩者分別的終濃度為1呢加1和0.3呢加1，在251下，反應18匕；
[0053]2、重復 ?:步驟；
[0054][、重復^工…工步驟^次’然后重復^工步驟；
[0055]I通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0056]在濃度為50禮的123溶液中依次加入即―、順3和20?:，使卿八中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:5，在251下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5-11 ；
[0057]1將步驟所得樣品置于邱=7.5的11*18緩沖溶液中，加入卜蘇氨酸，使溶液的終濃度為0.2！^加1，在251下，反應12匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0058]實施例4
[0059]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0060]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0061]8、將樣品放置于邱=8.5的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為2呢加1，在301下，反應81！；
[0062]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0063]0、將步驟所得樣品置于邱=8.5的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和胱胺，使兩者分別的終濃度為1.5呢加1和0.5呢加1，在301下，反應8匕；
[0064]2、重復 ?:步驟；
[0065][、重復^工…工步驟^次’然后重復^工步驟；
[0066]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0067]在濃度為50禮的123溶液中依次加入多肽適配子職17^^、順3和￡0(:,使多肽適配子中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:5，在251下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5111111 ；
[0068]??！、將步驟所得樣品置于邱=8.5的11*18緩沖溶液中，加入卜絲氨酸，使溶液的終濃度為0.15！^加1，在251下，反應18匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0069]實施例5
[0070]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0071]I將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0072]8、將樣品放置于邱=9的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為1.2呢加1，在301下，反應2411 ；
[0073]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0074]0、將步驟所得樣品置于邱=9的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和胱胺，使兩者分別的終濃度為1.2呢加1和0.3呢加1，在301下，反應2處；
[0075]2、重復〇步驟；
[0076]？、重復步驟5次，然后重復8、步驟；
[0077]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0078]在濃度為50禮的123溶液中依次加入即―、順3和20?:，使卿八中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:4，在301下，反應2處，用蒸餾水清洗3次，每次5-11 ；
[0079]！！、將步驟所得樣品置于邱=9的11*18緩沖溶液中，加入卜賴氨酸，使溶液的終濃度為0.1呢加1，在251下，反應12匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0080]實施例6
[0081]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0082]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0083]8、將樣品放置于邱=6.5的1^18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.1呢加1，在301下，反應1011 ；
[0084]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0085]0、將步驟所得樣品置于邱=6.5的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和胱胺，使兩者分別的終濃度為0.5呢加1和0.05呢加1，在301下，反應10匕；
[0086]2、重復 ?:步驟；
[0087][、重復^工…工步驟了次’然后重復^工步驟；
[0088]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0089]在濃度為50禮的123溶液中依次加入I？⑶、順3和￡0(:,使1--中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:5，在251下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5111111；
[0090]！！、將步驟所得樣品置于邱=8.5的作匕緩沖溶液中，加入卜酪氨酸，使溶液的終濃度為0.15！^加1，在251下，反應18匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0091]實施例7
[0092]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0093]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0094]8、將樣品放置于邱=8的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.2呢加1，在201下，反應1211 ；
[0095]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0096]0、將步驟所得樣品置于邱=8的11*18緩沖溶液中，加入多巴胺和胱胺，使兩者分別的終濃度為1呢加1和0.3呢加1，在201下，反應12匕；
[0097]2、重復〇步驟；
[0098]？、重復8、步驟1次，然后重復8、0步驟；
[0099]匕通過￡0(:/順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0100]在濃度為50禮的123溶液中依次加入多肽適配子3風10?見?扣、順3和￡0(:,使多肽適配子中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:3.5，在301下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5111111 ；
[0101]??！、將步驟所得樣品置于邱=8的11*18緩沖溶液中，加入卜胱氨酸鈉，使溶液的終濃度為0.1呢加1，在251下，反應18匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
[0102]實施例8
[0103]一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得:
[0104]八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；
[0105]8、將樣品放置于邱=8.5的作匕緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為1呢加1，在201下，反應101！；
[0106]?:、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥；
[0107]0、將步驟所得樣品置于邱=8.5的作18緩沖溶液中，加入多巴胺和硒代胱胺，使兩者分別的終濃度為0.5呢加1和0.03呢加1，在201下，反應12匕；
[0108]2、重復 ?:步驟；
[0109]？、重復步驟2次，然后重復8、?:步驟；
[0110]匕通過20以順3將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上:
[0111]在濃度為50禮的123溶液中依次加入％03、順3和￡0(:,使中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:2，在301下，反應12匕用蒸餾水清洗3次，每次5-11 ；
[0112]將步驟所得樣品置于邱=8.5的11*18緩沖溶液中，加入卜硒代胱氨酸鈉，使溶液的終濃度為0.2！^加1，在301下，反應16匕蒸餾水清洗3次，每次得到目標材料。
【權利要求】
1.一種表面具有手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，由如下步驟獲得: 八、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥； 8、將樣品放置于邱=6-9的11*18緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.0111^/1111-1011^/1111，在 10-301^下，反應 1-2411 ； 0、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5111111，然后用隊干燥； 0、將(:步驟所得樣品置于邱=6-9的11*18緩沖溶液中，加入多巴胺和具有催化內(nèi)源性一氧化氮供體釋放一氧化氮的末端含氨基或巰基的化合物，使兩者分別的終濃度為0.0111^/1111-1011^/1111，在 10-301^下，反應 1-2411 ； 2、重復步驟； ？、重復日、!:、!)、!:步驟1次或多次，然后重復8、步驟； 6、通過20以冊13將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟？制備的樣品上: 在濃度為50禮的123溶液中依次加入含有羧基的促細胞粘附多肽、順3和￡0(:,使多肽中羧基量、順3和￡0(:三種物質(zhì)的量的比為1:1:1-5，在10-301下，反應1-2處，用蒸餾水清洗3次，每次5111111 ； 、將步驟所得樣品置于邱=6-9的11*18緩沖溶液中，加入卜型氨基酸或卜型二肽，使溶液的終濃度為0.011118/1111-101118/1111，在10-301下，反應1-241！，蒸餾水清洗3次，每次5111111，得到目標材料。
2.如權利要求1所述的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，其特征在于，所述基底材料可為金屬生物材料、陶瓷生物材料、天然和合成的高分子生物材料、雜化生物材料。
3.如權利要求1所述的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，其特征在于，所述具有催化內(nèi)源性一氧化氮供體釋放一氧化氮的末端含氨基或巰基的化合物為胱胺、硒代胱胺、硒代胱氨酸、胱氨酸的一種；
4.如權利要求1所述的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，其特征在于，所述？步驟中重復多次的次數(shù)為2到9次。
5.如權利要求1所述的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，其特征在于，所述步驟6中的促細胞粘附多肽為含如0的多肽、含的多肽、多肽適配子中的一種。
6.如權利要求1所述的一種表面具有匕手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，其特征在于，所述步驟6中加入的匕型氨基酸可為匕甘氨酸、1-丙氨酸、1-蘇氨酸、1-半胱氨酸、1-賴氨酸，1-胱氨酸或硒代胱氨酸、1-酪氨酸或含上述氨基酸的二肽。
【文檔編號】A61L31/10GK104307053SQ201410532983
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權日:2014年10月11日
【發(fā)明者】翁亞軍, 范永鴻, 王宏, 潘夏鑫, 黃楠, 陳俊英, 王進, 楊蘋, 冷永祥, 趙安莎, 景鳳娟, 趙元聰 申請人:西南交通大學