Pcv2免疫原性組合物用于減輕豬臨床癥狀的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及關(guān)于包含豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)抗原的免疫原性組合物在治療若干臨床表現(xiàn)(疾病)方面的用途。優(yōu)選地，這些臨床表現(xiàn)與PCV2感染相關(guān)。優(yōu)選地，它們包括淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞/巨組織細胞。此外，這些臨床癥狀包括淋巴結(jié)病與豬的一種或多種以下癥狀的組合：(1)具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，(2)皮膚蒼白或黃疸，(3)斑點狀萎縮性肝，(4)胃潰瘍，(5)腎炎及(6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等。再者，這些臨床癥狀包括通常已知與勞索尼亞氏菌(Lawsonia)細胞內(nèi)感染相關(guān)的Pia樣損害。
【專利說明】PCV2免疫原性組合物用于減輕豬臨床癥狀的用途
[0001] 本申請是基于申請日為2006年12月28日，申請?zhí)枮?00680053578. 7 (PCT/ US2006/062662)，發(fā)明名稱為："PCV2免疫原性組合物用于減輕豬臨床癥狀的用途"的專利 申請的分案申請。
[0002] 序列表
[0003] 本發(fā)明包括紙質(zhì)和計算機可讀的序列表，在此以提述方式并入其教導和內(nèi)容。
[0004] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及包含豬2型圓環(huán)病毒（PCV2)抗原的免疫原性組合物于治療若干臨床 表達（疾?。┑挠猛尽?yōu)選地，那些臨床表達與PCV2感染相關(guān)。更具體地說，本發(fā)明涉及 一種可有效地用于產(chǎn)生減緩或減輕與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀的嚴重性的免疫反應的免 疫學組合物。優(yōu)選地，免疫學組合物包含重組產(chǎn)生的PCV2的抗原。更優(yōu)選地，PCV2抗原為 由PCV2基因組中的開放閱讀框架（ORF)之一所編碼的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，該抗 原為PCV2 ORF2蛋白質(zhì)。最具體地說，本發(fā)明涉及一種免疫學組合物，它可有效地用于治療 接受該免疫學組合物的豬體內(nèi)與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀，且其中該組合物包含由PCV2 的ORF2表達的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面為由此提供的任何組合物作為藥物，優(yōu)選作為獸 醫(yī)學藥物，更優(yōu)選作為疫苗的用途。此外，本發(fā)明還涉及本文中描述的任一組合物用于制備 供減緩或減輕與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀之嚴重性的藥物的用途。優(yōu)選地，該藥物系用于 預防PCV2感染，甚至更優(yōu)選用于預防豬的PCV2感染。本發(fā)明的另一方面涉及一種制造藥 物的方法，包括用于治療若干臨床表現(xiàn)的PCV2免疫原性組合物。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)描述
[0007] 豬2型圓環(huán)病毒（PCV2)為小型（直徑為17nm-22nm)二十面體無包膜DNA病毒， 其含有單鏈環(huán)狀基因組。PCV2與豬1型圓環(huán)病毒（PCVl)共享大約80%的序列同一性。然 而，與通常無毒力的PCVl相比，感染有PCV2的豬表現(xiàn)一種綜合征，通常稱為斷乳后多系統(tǒng) 消耗性綜合征（PMWS)。PMWS具有消耗性、皮膚蒼白、生長遲滯（unthriftiness)、呼吸窘迫、 腹瀉、黃疸（icterus和jaundice)的臨床特征。在一些受感染的豬中將呈現(xiàn)所有癥狀的組 合，而其它受感染的豬將僅僅具有這些癥狀中的一或兩者。在尸體剖檢中，微觀及肉眼可見 的損害亦出現(xiàn)于多數(shù)組織及器官上，淋巴器官為最常見的損害部位。已觀測到PCV2核酸或 抗原的量與微觀淋巴損害嚴重性之間的強相關(guān)性。感染有PCV2的豬的死亡率可達80%。 除PMWS外，PCV2還與包括下列各項的若干其它感染相關(guān)：偽狂犬病、豬生殖及呼吸綜合征 (PRRS)、格拉塞氏?。℅lasser' s disease)、鏈球菌性腦膜炎、沙門氏菌病、斷乳后大腸桿菌 病、飲食性肝功能障礙（dietetic hepatosis)及化膿性支氣管肺炎。然而，迄今的研宄未 曾證實這些臨床癥狀中的任何一種是否事實上為PCV2感染的直接結(jié)果。此外，尚未知道這 些臨床癥狀中的任何一種是否可藉由針對PCV2的活性劑得以有效減輕或治愈。
[0008] 治療PCV2感染的現(xiàn)有手段包括諸如在美國專利第6, 703, 023號中描述的那些基 于DNA的疫苗。然而，這些疫苗在給與抗PCV2感染的保護性免疫力方面，或者在降低、減輕 任何與此相關(guān)的臨床癥狀的嚴重性或治愈任何與此相關(guān)的臨床癥狀方面，均不起作用。此 夕卜，在現(xiàn)有技術(shù)中描述的疫苗僅僅關(guān)注于預防豬PCV2感染，而不考慮任何其它醫(yī)學用途。
[0009] 因此，在本領(lǐng)域中需要一種用于治療若干臨床表現(xiàn)的免疫原性組合物。另外，在本 領(lǐng)域中需要一種給與抗PCV2感染的保護性免疫力，但亦可用于治療與PCV2感染相關(guān)的現(xiàn) 有臨床癥狀的免疫學組合物。
[0010] 本發(fā)明的公開
[0011] 本發(fā)明解決先前技術(shù)中固有的問題且提供明顯區(qū)別于技術(shù)現(xiàn)狀的進步。本發(fā)明提 供一種包含PCV2抗原的免疫原性組合物的藥物用途。
[0012] 一般而言，對于本文中使用的任何PCV2抗原免疫原性組合物來說，沒有不良事件 或注射部位反應的記錄。由此，當施用于仔豬，優(yōu)選施用于不大于15周齡，更優(yōu)選不大于6 周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周，最優(yōu)選不大于2周的仔豬時，本文所用的免疫原性組合物表 觀上是安全的?；蛘?，優(yōu)選在暴露于毒力型PCV至少2周內(nèi)（within at least two weeks of exposure to virulent PCV)，優(yōu)選至少3周內(nèi)進行本發(fā)明免疫原性組合物的施用。根 據(jù)另一實施方式，在本文中用于本文所述任何藥物用途的免疫原性組合物被施用于3周齡 或更大，優(yōu)選2周齡或更大，最優(yōu)選但不大于15周齡的豬。
[0013] 意外發(fā)現(xiàn)在治療中應用下文描述的免疫原性組合物可有效地減輕豬的各種臨床 癥狀的嚴重性。具體地，發(fā)現(xiàn)在治療中應用本發(fā)明的免疫原性組合物，尤其是包含PCV2 0RF2抗原的組合物，可有效地減緩或減輕感染有PCV2的豬的淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減 (lymphoid depletion)和/或多核組織細胞/巨組織細胞。此外，在治療中使用本文提供的 包含PCV2抗原（優(yōu)選0RF2抗原）的抗原組合物，可減少總圓環(huán)病毒負荷量及其免疫抑制性 影響（immunosuppressive impact)，藉此實現(xiàn)較高水平的一般疾病抗性（general disease resistance)及與PCV-2相關(guān)的疾病及癥狀發(fā)生率的降低。
[0014] 因此，本發(fā)明一個方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更優(yōu) 選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物用于制備供預防、減輕和/或減緩豬淋巴結(jié)病、淋巴細 胞消減和/或多核組織細胞/巨組織細胞的藥物的用途。優(yōu)選地，該藥物可有效用于預防、 減輕和/或減緩豬與PCV2感染相關(guān)的淋巴結(jié)?。↖ymphadenophathy)、淋巴細胞消減和/或 多核組織細胞/巨組織細胞（multinucleated/giant histocytes)。更優(yōu)選地，當施用于不 大于15周齡，更優(yōu)選不大于6周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周，最優(yōu)選不大于2周的豬時，該 藥物可有效用于預防、減輕和/或減緩與豬的PCV2感染相關(guān)的淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和 /或多核/巨組織細胞?；蛘?，優(yōu)選在暴露于毒力型PCV的至少2周內(nèi)，優(yōu)選至少3周內(nèi)進 行本發(fā)明的免疫原性組合物的施用。
[0015] 本發(fā)明的另一方面涉及一種治療豬淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞 /巨組織細胞的方法，其包括對豬施用本文提供的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原且更優(yōu)選PCV20RF2蛋白。在另一方面中，本發(fā)明提供一種治 療豬的與PCV2感染相關(guān)的淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞/巨組織細胞的方 法，其包含對豬施用本文提供的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含PCV2抗原，優(yōu)選 重組PCV2抗原，更優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白。優(yōu)選地，該治療使得減輕、減緩、預防和/或治愈 接受該免疫原性組合物的豬的淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞/巨組織細胞。 根據(jù)另一方面，所述治療方法進一步包含對不大于15周齡，更優(yōu)選不大于6周齡，甚至更優(yōu) 選不大于3周，且最優(yōu)選不大于2周的豬施用所述免疫原性組合物。或者，優(yōu)選在暴露于毒 力PCV至少2周內(nèi)，優(yōu)選至少3周內(nèi)進行本發(fā)明的免疫原性組合物的施用。
[0016] 另外發(fā)現(xiàn)使用由此提供的包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，最優(yōu)選PCV2 ORF2 蛋白的免疫原性組合物的治療可減緩或減輕受感染豬的與一或多種以下癥狀組合的淋 巴結(jié)?。海?)具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝 (mottled atrophic livers)，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸 (mummy)等。
[0017] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原， 更優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物用于制備供預防、減輕和/或減緩豬的與一或 多種以下癥狀組合的淋巴結(jié)病的藥物的用途：豬的（1)具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎 (interstitial pneumonia with interlobular edema)，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀 萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等。優(yōu)選地，該藥物 有效用于預防、減輕和/或減緩豬的與一或多種以下與PCV2感染相關(guān)的癥狀組合的淋巴結(jié) ?。海?)具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃 潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等。根據(jù)另一方面，當施用于不大于 15周齡，更優(yōu)選不大于6周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周且最優(yōu)選不大于2周的豬時，該藥物 有效用于預防、減輕和/或減緩豬的與一或多種以下癥狀組合的淋巴結(jié)?。贺i的（1)具有小 葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎 及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等?；蛘撸瑑?yōu)選在暴露于毒力PCV至少2周內(nèi)，優(yōu)選 至少3周內(nèi)進行本發(fā)明的免疫原性組合物的施用。
[0018] 此外，本發(fā)明還涉及一種治療豬的與一或多種以下癥狀組合的淋巴結(jié)病的方法： ⑴具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，⑵皮膚蒼白或黃疸，⑶斑點狀萎縮性肝，⑷胃潰瘍， (5) 腎炎及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等，該方法包含施用本文提供的包含PCV2抗 原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明亦涉及 一種治療豬的與一或多種與PCV2感染相關(guān)的以下癥狀組合的淋巴結(jié)病的方法：（1)具有小 葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及 (6) 生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸等，該方法包含對豬施用本文提供的包含PCV2抗原，優(yōu) 選重組PCV2抗原，且更優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物。優(yōu)選地，該治療導致豬的 淋巴結(jié)病及一或多種與PCV2感染相關(guān)的以下癥狀：（1)具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎，（2) 皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病癥，例如流產(chǎn)、死 產(chǎn)、干尸等的減輕或減緩。根據(jù)另一方面，所述治療方法進一步包含對不大于15周齡，更優(yōu) 選不大于6周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周，且最優(yōu)選不大于2周的豬施用所述包含PCV2抗 原，優(yōu)選重組PCV2抗原且更優(yōu)選PCV20RF2蛋白的免疫原性組合物?；蛘?，優(yōu)選在暴露于毒 力PCV至少2周內(nèi)，優(yōu)選至少3周內(nèi)進行本發(fā)明的免疫原性組合物的施用。
[0019] 還意外地發(fā)現(xiàn)，在治療中使用本文提供的包含PCV抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更 優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物，也可減緩或減輕通常已知與胞內(nèi)勞索尼亞氏菌 (Lawsonia intracellularis)感染（回腸炎）相關(guān)的 Pia 樣損害（Pia like lesion)。 [0020] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更 優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物用于制備供預防、減輕通常認為與豬細胞內(nèi)勞索尼 亞氏菌感染相關(guān)的Pia樣損害的嚴重性和/或減緩Pia樣損害的藥物的用途。根據(jù)另一方 面，當施用于不大于15周齡，更優(yōu)選不大于6周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周，且最優(yōu)選不大 于2周的豬時，該藥物可有效用于預防、減輕通常認為與細胞內(nèi)勞索尼亞氏菌感染相關(guān)的 Pia樣損害的嚴重性和/或減緩Pia樣損害?；蛘?，優(yōu)選在暴露于毒力PCV至少2周內(nèi)，優(yōu) 選至少3周內(nèi)進行本發(fā)明的免疫原性組合物的施用。
[0021] 此外，本發(fā)明亦涉及一種治療通常認為與細胞內(nèi)勞索尼亞氏菌感染相關(guān)的Pia樣 損害的方法，該方法包括對豬施用如本文中提供的包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更 優(yōu)選PCV2 ORF2蛋白的免疫原性組合物。優(yōu)選地，該治療使得減輕或減緩通常認為與細胞 內(nèi)勞索尼亞氏菌感染相關(guān)的Pia樣損害。根據(jù)另一方面，以上所描述的治療方法進一步包 括對不大于15周齡，更優(yōu)選不大于6周齡，甚至更優(yōu)選不大于3周，且最優(yōu)選不大于2周的 豬施用包含PCV2抗原，優(yōu)選重組PCV2抗原，更優(yōu)選PCV2 ORF2蛋白的免疫原性組合物?；?者，優(yōu)選在暴露于毒力PCV至少2周內(nèi)，優(yōu)選至少3周內(nèi)進行本發(fā)明的免疫原性組合物的施 用。
[0022] 免疫原性組合物
[0023] 用于本文中的免疫原性組合物可有效用于誘發(fā)針對PCV2的免疫反應和預防、減 緩和/或減輕與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀的嚴重性。該組合物通常包含至少一種PCV2抗 原。
[0024] 除非另外定義，否則在本文中使用的所有技術(shù)及科學術(shù)語具有如通常由本發(fā)明所 屬的【技術(shù)領(lǐng)域】普通技術(shù)人員了解的相同含義。本文中使用的術(shù)語"免疫原性組合物"指含 有PCV2抗原的任何藥物組合物，該組合物可用以預防或治療受試者中與PCV2感染相關(guān)的 疾病或病癥。優(yōu)選的免疫原性組合物能夠誘發(fā)、刺激或增強針對PCV2的免疫反應。因此， 術(shù)語既涵蓋如下所述的亞單位免疫原性組合物，又涵蓋含有全滅活（whole killed)或減毒 (attenuated)和 / 或失活化（inactivated) PCV2 的組合物。
[0025] 本文中使用的術(shù)語〃亞單位免疫原性組合物〃是指這樣的組合物，其含有從來自 PCV2的抗原衍生的或者與來自PCV2的抗原同源的至少一種免疫原性多肽或抗原，但并非 所有抗原。此組合物基本上不含完整的PCV2。因此，〃亞單位免疫原性組合物〃是從至少 部分純化或分級（優(yōu)選基本上純化）的來自PCV2的免疫原性多肽或其重組類似物制備的。 亞單位免疫原性組合物所包含的感興趣的亞單位抗原可以是基本上不含來自PCV2的其它 抗原或多肽的，或者是經(jīng)分級的形式的。優(yōu)選免疫原性亞單位組合物包含如下所述的PCV2 0RF2蛋白。
[0026] 對組合物或疫苗的〃免疫學反應或免疫反應〃為宿主對所欲組合物或疫苗產(chǎn)生 的細胞免疫反應和/或抗體介導的免疫反應。通常，"免疫反應"包括（但不限于）一種 或多種以下效應：產(chǎn)生或活化針對在感興趣的組合物或疫苗中包括的抗原的特異性抗體、B 細胞、輔助T細胞、抑制T細胞和/或細胞毒力T細胞和/或yd T細胞。優(yōu)選地，宿主將顯 示治療性免疫學反應或保護性免疫學反應，使得對新感染的抗性增強和/或疾病的臨床嚴 重性降低。這樣的保護作用將表現(xiàn)為：與如上所述的PCV2感染相關(guān)的一或多種癥狀的數(shù)量 或嚴重性降低，或者與如上所述的PCV2感染相關(guān)的一或多種癥狀的缺失。
[0027] 本文中使用的術(shù)語"免疫原性"蛋白質(zhì)或多肽或"抗原"是指引起如上所述的免 疫學反應的氨基酸序列。本文中使用的"免疫原性"蛋白質(zhì)或多肽包括任何PCV2蛋白質(zhì)的 全長序列、其類似物或其免疫原性片段。術(shù)語"免疫原性片段"是指包括一或多種表位且由 此引起以上所描述的免疫學反應的蛋白質(zhì)片段。這些片段可使用在本領(lǐng)域中熟知的任何數(shù) 目的表位定位技術(shù)鑒定。例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第 66 卷，（Glenn E. Morris, Ed.，1996)Humana Press，Totowa, New Jersey。例如， 線性表位可藉由，例如，同時在固態(tài)載體上合成大量肽（所述肽對應于蛋白質(zhì)分子的部分） 且使所述肽與抗體反應（同時，所述肽仍連接于載體）而測定。這些技術(shù)在本領(lǐng)域中已知 且描述于，例如美國專利第 4, 708, 871 號；Geysen 等人，（1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ;Geysen 等人，（1986)Molec. Immunol. 23:709-715。同樣，構(gòu)象表位易于藉由 諸如藉由X射線晶體分析儀及2維核磁共振測定氨基酸的空間構(gòu)形而鑒定。例如參見上文 Epitope Mapping Protocols。
[0028] 該定義中還包括合成抗原，例如多表位（polyepitopes)、側(cè)翼表位（flanking epitopes)，及其它重組抗原或合成得來的抗原。例如參見Bergmann等人，（1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781 ;Bergmann 等人，（1996)，J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997)，Immunol.and Cell Biol. 75:402-408 ;Gardner 等人，（1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3,1998〇
[0029] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，提供一種免疫原性組合物，其能誘發(fā)免疫反應， 并且，更優(yōu)選地，給與針對PCV2感染臨床征象的保護性免疫力。組合物最優(yōu)選包含由PCV2 的0RF2表達的多肽或其片段作為該組合物的抗原組份。在本文中用于制備組合物且在本 文提供的方法中使用的PCV20RF2 DNA及蛋白質(zhì)，是PCV2分離株中的一個高度保守的結(jié)構(gòu) 域；由此，任何PCV2 0RF2都能夠有效地充當如本文中使用的PCV 0RF2 DNA和/或多肽的 來源。優(yōu)選PCV2 0RF2蛋白是SEQ ID NO. 11的該PCV2 0RF2蛋白。在本文中提供的優(yōu)選 PCV 0RF2多肽為SEQ ID NO. 5,但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解此序列在序列同源性方面的變化可 達到6% -10%而仍保持使其適用于免疫原性組合物中的抗原特征。免疫學組合物的抗原 特征可例如通過如實施例4提供的攻毒實驗加以估計。此外，當與由SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4的多核苷酸序列編碼的PCV2 ORF 2蛋白質(zhì)相比，經(jīng)修飾抗原給與至少70%，優(yōu)選 80%，更優(yōu)選90%的保護性免疫力時，仍保持經(jīng)修飾抗原的抗原特征。本文中使用的"免 疫原性組合物〃意謂這樣的PCV2 0RF2蛋白，其引起宿主對PCV2 0RF2蛋白的〃免疫學反 應"，即細胞免疫反應和/或抗體介導的免疫反應。優(yōu)選地，此免疫原性組合物能夠引起或 增強抗PCV2的免疫反應，藉此給與抗PCV2感染的保護性免疫力，并降低一種或多種，優(yōu)選 所有與此相關(guān)的臨床征象的發(fā)生率、嚴重性或預防一或多種且優(yōu)選所有與此相關(guān)的臨床征 象。
[0030] 在有些形式中，PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分用作組合物中的抗原組份。本文 中使用的術(shù)語"免疫原性部分"分別是指PCV2 0RF2蛋白和/或聚核苷酸的截短形式和/ 或經(jīng)取代形式，或片段。優(yōu)選地，這些截短形式和/或經(jīng)取代形式或片段將包含全長0RF2 多肽的至少6個相鄰氨基酸。更優(yōu)選地，截短形式或經(jīng)取代形式或片段應具有全長0RF2多 肽的至少10個，更優(yōu)選至少15個且更優(yōu)選至少19個相鄰氨基酸。在本文中提供的在這方 面的兩個優(yōu)選序列為SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10。另外應了解這些序列可為較大片段或 截短形式的一部分。
[0031] 在本文中提供的另一優(yōu)選PCV2 0RF2多肽系由SEQIDN0:3或SEQIDN0:4 的核苷酸序列編碼。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應了解此序列在序列同源性方面可變化達到 6 % -20 %且仍保持使其適用于免疫原性組合物中的抗原特征。在有些形式中，此PVC2 0RF2 多肽的截短形式或經(jīng)取代形式或片段系用作組合物的抗原組份。優(yōu)選地，這些截短形式或 經(jīng)取代形式或片段將包含例如，SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的全長ORF2核苷酸序列的至 少18個相鄰核苷酸。更優(yōu)選地，截短形式或經(jīng)取代形式或片段將具有例如SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO:4的全長0RF2核苷酸序列的至少30個，更優(yōu)選至少45個，更優(yōu)選至少57個相 鄰核苷酸。
[0032] 如在本領(lǐng)域中已知的〃序列同一性〃是指兩種或兩種以上多肽序列之間或兩 種或兩種以上聚核苷酸序列之間，即參考序列及待與參考序列比較的給定序列之間的關(guān) 系。序列同一性是在將給定序列與參考序列進行最優(yōu)比對以產(chǎn)生最高序列相似度后，比 較所述序列而確定的，由所述序列段之間的匹配度所決定。在進行這樣的比對時，在位置 對位置（P〇sition-by-position)的基礎(chǔ)上確定序列同一性，例如，若在某一特定位置處 核苷酸或氨基酸殘基是同一的，則所述序列在該位置處是同一的。隨后，這些位置同一性 的總數(shù)除以參考序列中核苷酸或殘基的總數(shù)以產(chǎn)生百分比序列同一性。可憑借已知方 法容易地計算序列同一 ,性，包括但不限于那些在以下文獻中描述的方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編，Oxford University Press, New York (1988)，Bioc omputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.編，Academic Press, New York(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin, A. M?及Griffin, H. G?編，Humana Press, New Jersey(1994) ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge,G. , Academic Press(1987) ；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及 06￥6代11叉，]\編，1\131：〇。1^1：〇11?代88，他￥￥〇^(1991);及〇&1'；[110，11.及1^卩1]1&11，0.，31八]\1 J. Applied Math. ,48:1073 (1988)，將它們的教導以提述的方式并入本文中。測定序列同一 性的優(yōu)選方法經(jīng)設(shè)計以產(chǎn)生測試序列間的最大匹配。測定序列同一性的方法被編碼成公 開可用的計算機程序用于測定給定序列間的序列同一性。這些程序的實例包括（但不限 于）GCG program package (Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research, 12 (1):387 (1984 ))，BLASTP，BLASTN and FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec. Biol. ,215:403-410 (1990) 〇 BLASTX程序公開地得自 NCBI 及其它來源（BLAST Manual, Altschul，S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol.，215:403-410 (1990)，將其教導以 引用的方式并入本文中）。這些程序使用缺省空隙權(quán)重（default gap weight)對序列進行 最優(yōu)比對，以產(chǎn)生給定序列與參考序列之間的最高程度的序列同一性。例如，具有與參考核 苷酸序列有至少（例如）85 %，優(yōu)選90 %，甚至更優(yōu)選95 %的〃序列同一性〃的核苷酸序 列的多核苷酸，意在表示除了相對于參考核苷酸序列每100個核苷酸，給定多核苷酸序列 可能包括至多15個，優(yōu)選至多10個，甚至更優(yōu)選至多5個點突變之外，給定多核苷酸的核 苷酸序列與參考序列是同一的。換言之，在具有相對于參考核苷酸序列的至少85%，優(yōu)選 90%，甚至更優(yōu)選95%的同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，參考序列中的至多15%，優(yōu) 選10%，甚至更優(yōu)選5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸取代，或參考序列中可以插入 數(shù)目占參考序列核苷酸總數(shù)的至多15%，優(yōu)選10%，甚至更優(yōu)選5%的核苷酸。參考序列的 這些突變可能發(fā)生在參考核苷酸序列的5'末端位置或3'末端位置處或這些末端位置之間 的任何地方，或者個別地散布于參考序列中的核苷酸間，或者散布成參考序列內(nèi)的一個或 多個相鄰群體（continguous group)。類似地，具有與參考氨基酸序列有至少（例如）85%， 優(yōu)選90%，甚至更優(yōu)選95%的序列同一性的給定氨基酸序列的多肽意在表示除了相對于 參考氨基酸序列的每100個氨基酸，給定多肽序列可能包括至多15個，優(yōu)選至多10個，甚 至更優(yōu)選至多5個氨基酸改變之外，給定多肽的氨基酸序列與參考序列是同一的。換言之， 為獲得具有與參考氨基酸序列的至少85 %，優(yōu)選90 %，甚至更優(yōu)選95 %的序列同一性的給 定多肽序列，可將參考序列中的至多15%，優(yōu)選至多10%，甚至更優(yōu)選至多5 %的氨基酸殘 基刪除或用另一氨基酸取代，或者可以向參考序列中插入數(shù)目占參考序列氨基酸殘基總數(shù) 的至多15%，優(yōu)選至多10%，甚至更優(yōu)選至多5 %的氨基酸。參考序列的這些改變可發(fā)生于 參考氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位置處或這些末端位置之間的任何地方，或者個別 地散布于參考序列的殘基間，或者散布成參考序列內(nèi)一個或多個相鄰群體。優(yōu)選地，不一致 的殘基位置是通過保守氨基酸取代而相異的。然而，當測定序列同一性時，保守取代不算作 匹配。
[0033] 本文中使用的〃序列同源性〃是指一種測定兩個序列的相關(guān)性的方法。為測定 序列同源性，將兩個或兩個以上序列最優(yōu)比對，必要時引入空隙。然而，與〃序列同一性〃 相比，當測定序列同源性時，將保守氨基酸取代視為匹配。換言之，為獲得與參考序列具有 95 %序列同源性的多肽或多核苷酸，參考序列中的85%，優(yōu)選90%，甚至更優(yōu)選95 %的氨 基酸殘基或核苷酸必須與另一氨基酸或核苷酸匹配或與另一氨基酸或核苷酸構(gòu)成保守取 代，或可向參考序列中插入數(shù)目占參考序列氨基酸殘基或核苷酸總數(shù)（不包括保守取代） 的至多15%，優(yōu)選至多10%，甚至更優(yōu)選至多5%的氨基酸或核苷酸。優(yōu)選地，同源序列包 含至少一段50個，甚至更優(yōu)選至少100個，甚至更優(yōu)選至少250個，甚至更優(yōu)選至少500個 核苷酸。
[0034] "保守取代"是指氨基酸殘基或核苷酸被具有類似特征或性質(zhì)（包括大小、疏水性 等）的另一氨基酸殘基或核苷酸取代，使得總體功能性不發(fā)生顯著變化。
[0035] 〃分離〃意謂〃憑借人的手〃而從其天然狀態(tài)發(fā)生改變，也即若其出現(xiàn)于自然界， 則其自其原始環(huán)境變化和/或移出。例如，當術(shù)語用于本文中時，天然存在于活有機體中的 多核苷酸或多肽不是"分離"的，但相同的多核苷酸或多肽與其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開 后，則是"分離"的。
[0036] 由此，本文中使用的免疫原性組合物還指包含PCV2 0RF2蛋白的組合物，其中該 PCV2 0RF2蛋白為上文所述的那些PCV2 0RF2蛋白中的任何一種。優(yōu)選地，該PCV2 0RF2蛋 白為
[0037] i)包含以下的序列的多肽：SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO:11，
[0038] ii)與i)的多肽至少80%同源的任何多肽，
[0039] iii) i)和/或ii)的多肽的任何免疫原性部分，
[0040] iv) iii)的免疫原性部分，其包含在以下的序列中包括的至少10個相鄰氨基酸：
[0041] V)由包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4的序列的DNA編碼的多肽，
[0042] vi)由與V)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸編碼的任何多肽，
[0043] vii)由V)和/或vi)的多核苷酸所編碼的多肽的任何免疫原性部分，
[0044] viii)vii)的免疫原性部分，其中編碼該免疫原性部分的多核苷酸包含在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列中所包括的至少30個相鄰核苷酸。
[0045] 優(yōu)選地，那些免疫原性部分中的任一個都具有由SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的 序列編碼的PCV2 0RF2蛋白的免疫原性特征。
[0046] 根據(jù)另一方面，在免疫學組合物中提供PCV2 0RF2蛋白，其中PCV20RF2蛋白的抗 原包含水平（antigen inclusion level)可有效用于誘發(fā)所需的免疫反應，即降低由PCV2 感染的發(fā)生率，減輕PCV2感染的嚴重性，或預防由PCV2感染所致的一或多種臨床征象。 優(yōu)選地，PCV2 0RF2蛋白包含水平為每毫升最終免疫原性組合物至少0. 2 y g抗原（y g/ ml)，更優(yōu)選為約0. 2 y g/ml至約400 y g/ml，更優(yōu)選為約0. 3 y g/ml至約200 y g/ml，甚至 更優(yōu)選為約〇. 35 y g/ml至約100 y g/ml，更優(yōu)選為約0. 4 y g/ml至約50 y g/ml，更優(yōu)選 為約0. 45 y g/ml至約30 y g/ml，更優(yōu)選為約0. 6 y g/ml至約15 y g/ml，甚至更優(yōu)選為約 0? 75 y g/ml至約8 y g/ml，甚至更優(yōu)選為約L 0 y g/ml至約6 y g/ml，更優(yōu)選為約L 3 y g/ ml至約3. 0 y g/ml，甚至更優(yōu)選為約I. 4 y g/ml至約2. 5 y g/ml，甚至更優(yōu)選為約I. 5 y g/ ml至約2. 0 y g/ml，且最優(yōu)選為約I. 6 y g/ml。
[0047] 根據(jù)另一方面，0RF2抗原包含水平為每個劑量最終抗原組合物至少0. 2/ y g如 上所描述的PCV2 0RF2蛋白（y g/劑），更優(yōu)選為約0. 2 y g/劑至約400 y g/劑，更優(yōu)選為 約0. 3 y g/劑至約200 y g/劑，甚至更優(yōu)選為約0. 35 y g/劑至約100 y g/劑，更優(yōu)選為約 〇. 4 y g/劑至約50 y g/劑，更優(yōu)選為約0. 45 y g/劑至約30 y g/劑，更優(yōu)選為約0. 6 y g/ 劑至約15 y g/劑，甚至更優(yōu)選為約0. 75 y g/劑至約8 y g/劑，甚至更優(yōu)選為約I. 0 y g/劑 至約6 y g/齊I」，更優(yōu)選為約I. 3 y g/劑至約3. 0 y g/齊I」，甚至更優(yōu)選為約I. 4 y g/劑至約 2. 5 y g/劑，甚至更優(yōu)選為約I. 5 y g/劑至約2. 0 y g/劑且最優(yōu)選為約I. 6 y g/劑。
[0048] 用于根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中的PCV2 0RF2多肽可以用任何方式獲得，包 括PCV2 0RF2的分離及純化、標準蛋白質(zhì)合成及重組方法。用于獲得PCV2 0RF2多肽的優(yōu)選 方法在美國專利申請第11/034, 797號中提供，其教導及內(nèi)容以提述的方式并入本文中。簡 言之，用含有PCV2 0RF2 DNA編碼序列的重組病毒載體感染易感細胞，由重組病毒表達PCV2 0RF2多肽，通過過濾從上清液回收所表達的PCV2 0RF2多肽，并用任何已知的方法，優(yōu)選使 用二元乙撐亞胺，使其失活化，隨后將其中和以終止失活化過程。
[0049] 用于本文中的免疫原性組合物還指這樣的組合物，其包括i)上文所述的任一種 PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；及ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體（優(yōu) 選重組桿狀病毒）的至少一部分。此外，免疫原性組合物可包含i)上文所述的任一種PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體（優(yōu)選重組桿 狀病毒）的至少一部分，及iii)一部分細胞培養(yǎng)物上清液。
[0050] 本文中使用的免疫原性組合物還指這樣的組合物，其包括i)上文所述的任一種 PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體（優(yōu)選重 組桿狀病毒）的至少一部分，及iii) 一部分細胞培養(yǎng)物；其中約90%的組份具有小于Iym 的尺寸。
[0051] 本文中使用的免疫原性組合物還指這樣的組合物，其包括i)上文所述的任一種 PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體的至少 一部分，iii) 一部分細胞培養(yǎng)物，iv)和使重組病毒載體失活化的失活化劑，優(yōu)選為BEI，其 中約90%的組份i)至組份iii)具有小于I ym的尺寸。優(yōu)選地，BEI以有效使桿狀病毒失 活化的濃度存在。有效濃度為上文所述。
[0052] 本文中使用的免疫原性組合物還指這樣的組合物，其包括i)上文所述的任一種 PCV2 ORF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 ORF2蛋白的病毒載體的至少 一部分，iii) 一部分細胞培養(yǎng)物，iv)使重組病毒載體失活化的失活化劑，優(yōu)選為BEI，及V) 用于終止由失活化劑所介導的失活化的中和劑，其中約90%的組份i)至組份iii)具有小 于I ym的尺寸。優(yōu)選地，若失活化劑為BEI，則該組合物包含與BEI等量的硫代硫酸鈉。
[0053] 將多肽摻入可施用于對PCV2感染敏感的動物的組合物中。組合物的優(yōu)選形 式亦可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的額外組份（亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)。第18版，Mack Publ.，Easton)。另外，該組合物可包括一或多種獸醫(yī)學 上可接受的載體。本文中使用的"獸醫(yī)學上可接受的載體"包括以下載體中的任一項及 全部：溶劑、分散介質(zhì)、包衣（coatings)、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌 劑、等張劑、吸附延遲劑等。在一個優(yōu)選實施方式中，免疫原性組合物包含本文提供的PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度，其與佐劑[優(yōu)選卡巴普（Carbopol)]及生理鹽水混 合。
[0054] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應了解用于本文中的組合物可包括已知的可注射生理學可接受 無菌溶液。為了制備非經(jīng)腸注射或灌注的即用溶液，可以容易地獲得含水等張溶液諸如鹽 水或相應的血漿蛋白質(zhì)溶液。另外，本發(fā)明的免疫原性組合物及疫苗組合物可包括稀釋劑、 等張劑、穩(wěn)定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等張劑典型地可包 括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩(wěn)定劑典型地包括白蛋白及乙二胺四乙酸 的堿金屬鹽。
[0055] 本文中使用的〃佐劑〃可包括氫氧化鋁及磷酸鋁，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc. , Cambridge MA) > GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc. , Birmingham, AL)的皂苷、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液尤其可基于輕液體石賭油（歐 洲藥典類型）；由烯烴，尤其是異丁烯或癸烯的寡聚而產(chǎn)生的類異戊二烯油，諸如角鯊烷油 或角鯊烯油；含有直鏈烷基的酸或醇的酯，更具體地說為植物油、油酸乙酯、丙二醇二（辛 酸酯/癸酸酯）、甘油三（辛酸酯/癸酸酯）或丙二醇二油酸脂；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其 是異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選為非離子型表面活性劑，尤其 為脫水山梨糖醇（sorbitan)的酯、二縮甘露醇的酯（例如，無水甘露糖醇油酸酯）、乙二醇 的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x是 乙氧基化的，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段體，尤其是普羅尼克（Pluronic)產(chǎn)品，特別 是 L121。參見 Hunter 等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull，D.E.S.). JohnWiley and Sons, NY，第 51-94 頁，（1995)及 Todd 等人， Vaccine 15:564-570(1997)。
[0056]例如，有可能使用由 M. Powell 及M. Newman編寫的〃Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", Plenum Press, 1995 的第 147 頁中描述的 SPT 乳液，及在同一本 書的第183頁中描述的乳液MF59。
[0057] 佐劑的另一例子是這樣的化合物，其選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及馬來酸 酐與烯基衍生物的共聚物。有利的佐劑化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的交聯(lián)的聚合物，尤 其與糖類或多元醇的聚鏈稀基醚交聯(lián)的聚合物。以術(shù)語卡波姆（carbomer) (Phameuropa， 第8卷，第2號，June 1996)來稱呼這些化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可參見美國專利第 2, 909, 462號，其描述與具有至少3個羥基、優(yōu)選不超過8個羥基的多羥基化合物交聯(lián)的 丙烯酸聚合物，其中至少三個羥基的氫原子被替換為具有至少2個碳原子的不飽和脂族 基團。優(yōu)選的基團為含有2至4個碳原子的那些基團，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不 飽和基團。不飽和基本身可含有其它取代基，諸如甲基。商品名為卡巴普（Carbapol) (BF Goodrich, Ohio, USA)的產(chǎn)品尤其適用。其與稀丙基鹿糖或與稀丙基季戊四醇交聯(lián)。其中包 括卡巴普974P、934P及971P。最優(yōu)選使用卡巴普，尤其是使用卡巴普971P，優(yōu)選用量為每 個劑量約500 y g至約5mg，甚至更優(yōu)選用量為每個劑量約750 y g至約2. 5mg，最優(yōu)選用量 為每劑量約Img。
[0058] 其它適當佐劑包括（但不限于）RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Inc. )、Block共聚 物（CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、單磷?；|(zhì) A、阿夫立定 (Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑、來自大腸桿菌（E. coli)的熱不穩(wěn)定腸毒素（重組或其它）、霍 亂毒素、IMS 1314或胞壁?；模捌渌喾N佐劑。
[0059] 優(yōu)選地，佐劑以每劑量約100 y g至約IOmg的量添加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑 量約100 y g至約IOmg的量添加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑量約500 y g至約5mg的量添 加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑量約750 y g至約2. 5mg的量添加。最優(yōu)選地，佐劑以每劑 量約Img的量添加。
[0060] 另外，該組合物可包括一或多種可藥用的載體。本文中使用的"可藥用的載體 〃包括以下載體的任一項及所有：溶劑、分散介質(zhì)、包衣（coatings)、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐 劑、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑等等。最優(yōu)選地，由此提供的組合物含有自活體 外培養(yǎng)的細胞的上清液所回收的PCV2 0RF2蛋白，其中用含有PCV2 0RF2 DNA且表達PCV2 0RF2蛋白的重組病毒載體感染所述細胞，且其中用約2mM至約8mM BEI，優(yōu)選用約5mM BEI 處理以使病毒載體失活化，并用相等濃度的中和劑，優(yōu)選硫代硫酸鈉溶液處理該細胞培養(yǎng) 物至約2mM至約8mM，優(yōu)選約5mM的最終濃度。
[0061] 本發(fā)明還涉及包含以下各項的免疫原性組合物：i)上文所述的任一種PCV2 0RF2 蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體的至少一部分， iii) 一部分細胞培養(yǎng)物，iv)使重組病毒載體失活化的失活化劑，優(yōu)選為BEI ;v)用于終止 由失活化劑所介導的失活化的中和劑，優(yōu)選為與BEI等量的硫代硫酸鈉；及vi)適當佐劑， 優(yōu)選為具有上述量的卡巴普971 ;其中約90%的組份i)至組份iii)具有小于Iym的尺 寸。根據(jù)另一方面，此免疫原性組合物進一步包含生理學可接受濃度的可藥用鹽，優(yōu)選磷酸 鹽。優(yōu)選地，將該免疫原性組合物的pH值調(diào)節(jié)至生理pH值，即介于約6. 5與7. 5之間。
[0062] 本文中使用的免疫原性組合物還指這樣一種組合物，其每一毫升包含i)至少 1.6 1^上述卩(^2 01^2蛋白，^)至少一部分表達該？(^2 01^2蛋白的桿狀病毒，1^)一 部分細胞培養(yǎng)物，iv)約2mM至8mM BEI，V)與BEI等量的硫代硫酸鈉；及vi)約Img卡巴 普971，及vii)生理學可接受濃度的磷酸鹽，其中約90%的組份i)至組份iii)具有小于 I U m的尺寸且將該免疫原性組合物的pH值調(diào)節(jié)至約6. 5至7. 5。
[0063] 免疫原性組合物可進一步包括一或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，諸如白介素、干 擾素或其它細胞因子。免疫原性組合物亦可包括艮他霉素（Gentamicin)及硫柳采 (Merthiolate)。盡管適用于本發(fā)明的語境下的佐劑及添加劑的量及濃度可容易地由本 領(lǐng)域技術(shù)人員決定，但本發(fā)明涵蓋這樣的組合物，其包含約50 y g至約2000 y g，優(yōu)選約 250 y g/ml劑量疫苗組合物的佐劑。因此，本文中使用的免疫原性組合物還指包含約I y g/ ml至約60 y g/ml的抗生素，更優(yōu)選少于約30 y g/ml抗生素的組合物。
[0064] 本發(fā)明還涉及包含以下各項的免疫原性組合物：i)上文所述的任一種PCV2 0RF2 蛋白，優(yōu)選具有上文所述的濃度；ii)表達該PCV2 0RF2蛋白的病毒載體的至少一部分， iii) 一部分細胞培養(yǎng)物，iv)使重組病毒載體失活化的失活化劑，優(yōu)選為BEI ;v)用于終止 由失活化劑所介導的失活化的中和劑，優(yōu)選為與BEI等量的硫代硫酸鈉；vi)適當佐劑，優(yōu) 選為具有上述量的卡巴普971 ;vii)可藥用濃度的鹽水緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽，及viii)抗微 生物活性劑；其中約90%的組份i)至組份iii)具有小于I ym的尺寸。
[0065] 意外地發(fā)現(xiàn)，包含PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物在24個月期間內(nèi)高度穩(wěn)定。 亦發(fā)現(xiàn)免疫原性組合物在減緩與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀方面極為有效。亦發(fā)現(xiàn)，包含上 述由重組桿狀病毒表達的PCV2 0RF2蛋白的免疫原性組合物意外地比包含失活化形式的完 整PCV2病毒或分離的病毒PCV2 0RF2抗原的免疫原性組合物有效。尤其，意外地發(fā)現(xiàn)重組 桿狀病毒表達的PCV2 0RF2蛋白在極低濃度（意謂至多0. 25 y g/劑量的濃度）時有效。 PCV2 0RF2蛋白的這種意料之外的高免疫原性潛能被卡巴普所增強。實施例1至實施例3 詳細公開了包含PCV2 0RF2的免疫原性組合物的制備。
[0066] 本文中使用的免疫原性組合物亦指CircoFLEX?(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA)、Circ〇Vac?l(Merial SAS, Lyon, France)> CircoVent (Intervet Inc.，Millsboro，DE，USA)或 Suvaxyn PCV-2 OneDose?(Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, USA)〇
[0067] 免疫原性組合物的施用
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的組合物可皮內(nèi)（interdermally)、氣管內(nèi)或陰道內(nèi)施用。該組合物 優(yōu)選可肌肉內(nèi)或鼻內(nèi)施用，最優(yōu)選肌肉內(nèi)施用。在動物體內(nèi)，可證實經(jīng)由靜脈內(nèi)或憑借直 接注射于靶組織中施用上述藥物組合物為有利的。就全身性施用而言，靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、 肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或鞘內(nèi)途徑是優(yōu)選的。更局部的施用可在皮下、皮內(nèi) (intradermalIy)、皮內(nèi)（intracutaneously)、心臟內(nèi)、小葉內(nèi)、髓內(nèi)、肺內(nèi)或直接在待治療 的組織（結(jié)締組織、骨組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、上皮組織）中或其附近實施。視治療期望 的持續(xù)時間及有效性而定，本發(fā)明的組合物可以施用一次或若干次，亦可間歇地施用，例如 每天一次歷時若干天、數(shù)周或數(shù)月，且以不同的劑量施用。
[0069] 優(yōu)選地，對有需要的受試者肌肉內(nèi)施用至少一個劑量的上述免疫原性組合物。根 據(jù)另一方面，PCV-2抗原或包含上述任何此PCV-2抗原的免疫原性組合物配制成每個劑量 一（1)毫升且以每個劑量一（1)毫升施用。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及包含如本文 中描述的PCV-2抗原的Iml免疫原性組合物，其用于減緩或減輕感染有PCV2的豬的淋巴結(jié) 病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞/巨組織細胞。
[0070] 根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦涉及一種包含如本文中所描述的PCV-2抗原的Iml免疫 原性組合物，用于減緩或減輕豬的與一或多種以下癥狀組合的淋巴結(jié)?。海?)具有小葉間 水腫的間質(zhì)性肺炎，⑵皮膚蒼白或黃疸，⑶斑點狀萎縮性肝，⑷胃潰瘍，（5)腎炎及（6) 生殖病癥，例如流產(chǎn)、死產(chǎn)、干尸。
[0071] 根據(jù)另一方面，向有需要的受試者額外施用至少一次至少一個劑量的上述免疫原 性組合物，其中該第二次或任何更多次的施用是在初始或任何先前施用后至少14天時進 行的。優(yōu)選地，免疫原性組合物與免疫刺激物一起施用。優(yōu)選地，施用該免疫刺激物至少兩 次。優(yōu)選地，在免疫刺激物的第一次施用與第二次或任何其它次施用之間相隔至少3天，更 優(yōu)選至少5天，甚至更優(yōu)選至少7天。優(yōu)選地，在初始施用本文中提供的免疫原性組合物后 至少10天，優(yōu)選15天，甚至更優(yōu)選20天，甚至更優(yōu)選至少22天施用免疫刺激物。優(yōu)選免 疫刺激物為，例如鑰孔血藍蛋白（KLH)，優(yōu)選用弗氏不完全佐劑乳化（KLH/ICFA)。然而，由 此應了解亦可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它免疫刺激物。本文中使用的術(shù)語"免疫 刺激物"意謂能夠觸發(fā)免疫反應，優(yōu)選同時不引發(fā)或增強特異性免疫反應（例如抗特定病 原體的免疫反應）的任何藥劑或組合物。進一步指示以適當劑量施用免疫刺激物。
[0072] 此外，還意外地發(fā)現(xiàn)，本文中所用的免疫原性組合物一優(yōu)選包含表達PCV2 ORF2蛋 白的重組桿狀病毒，甚至更優(yōu)選與卡巴普組合的那些免疫原性組合物一的免疫原性潛力可 進一步通過施用IngelVac PRRS MLV疫苗加以證實（參見實施例5)。當存在PRRS感染時， PCV2臨床征象及疾病表現(xiàn)大大增強。然而，本文提供的免疫原性組合物及疫苗接種策略大 大地，而且超乎預料地減輕了此效應。換言之，當用本文提供的任何PCV2 ORF2免疫原性組 合物及Ingelvac PRRS MLV疫苗（Boehringer Ingelheim)處理動物，優(yōu)選仔豬時，觀測到 意外的協(xié)同效應。
[0073] 附圖簡要說明
[0074] 圖1是一種PCV2 0RF2重組桿狀病毒的優(yōu)選構(gòu)建過程的示意流程圖。
[0075] 圖2a和2b分別是說明如何制備一種根據(jù)本發(fā)明使用的組合物的示意流程圖。
[0076] 優(yōu)選實施方式詳述
[0077] 以下實施例闡述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選材料及程序。下面描述的是優(yōu)選的方法、裝置 及材料，但類似或等效于本文中描述的那些方法及材料的任何方法及材料均可用于實行或 測試本發(fā)明。然而，應了解這些實施例僅僅是為了說明而提供的，任何內(nèi)容均不應被認為是 對本發(fā)明的總體范圍的限制。
[0078] 實施例1
[0079] 此實施例比較使用本發(fā)明的方法與在現(xiàn)有技術(shù)中已知方法的0RF2的相對產(chǎn) 率。將四個IOOOmL轉(zhuǎn)瓶各自以大約LOX IO6個Sf+細胞/毫升，于300mL昆蟲無血 清培養(yǎng)基Excell 420 (JRH Biosciences, Inc. ,Lenexa, KS)中接種。將母細胞培養(yǎng)物 標為 SF+(草地夜蛾（Spodoptera frugiperda))母細胞儲備物（Master Cell Stock)， 第19代，批號N112-095W。用以產(chǎn)生SF+母細胞儲備物的細胞得自Protein Sciences Corporation, Inc.，Meriden, CT。將用于此實施例的SF+細胞株限制在第19代與第59代 之間。其它代也可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，但為了將過程放大以用于大規(guī)模生產(chǎn)，或許將需要至 少19次傳代，且超過59的代可能對表達有影響（盡管未研宄此情況）。更詳細地，在恒定 攪動下，使來自液氮IC槽的初始SF+細胞培養(yǎng)物懸浮生長于的無菌轉(zhuǎn)瓶（spinner flask) 中的Excell 420培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物生長于裝有25mL至150mL Excell 420無血清培養(yǎng) 基的IOOmL至250mL轉(zhuǎn)瓶中。當細胞繁殖至1. 0-8. 0 X IO6個細胞/毫升的細胞密度時，將 其以0. 5-1. 5 X IO6細胞/毫升的種植密度分至新容器中。隨后，在25 °C -29 °C下，使擴大 培養(yǎng)物生長于尺寸最多達36升的轉(zhuǎn)瓶中或多達300升的不銹鋼生物反應器中，歷時2-7天 的時間。
[0080] 接種后，將燒瓶在27°C下培養(yǎng)四小時。隨后，將每一燒瓶用含有PCV20RF2基 因（SEQ ID N0:4)的重組桿狀病毒接種。如下產(chǎn)生含有PCV2 ORF2基因的重組桿狀 病毒：將來自PCV2的北美病毒株的PCV2 ORF2基因進行PCR擴增，使其含有5'Kozak 序列（SEQ ID NO: 1)及 3' EcoRl 位點（SEQ ID NO: 2)，然后克隆于 pGEM-T-Easy 載體 (Promega, Madison, WI)中。隨后，將其切下并亞克隆于轉(zhuǎn)移載體pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen，San Diego, CA)中。將亞克隆部分在本文中表示為SEQ ID NO:7。將含有 PCV20RF2 基因的 pVL1392 質(zhì)粒命名為 N47-064Y，隨后與BacuIoGo丨d?(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒 DNA 共轉(zhuǎn)染于 Sf+ 昆蟲細胞（Protein Sciences，Meriden, CT) 中以產(chǎn)生含有PCV2 0RF2基因的重組桿狀病毒。本文中提供為SEQ ID N0:8的新構(gòu)建 體。將含有PCV2 0RF2基因的重組桿狀病毒進行噬斑純化且使母病毒種株（Master Seed Virus，MSV)在SF+細胞株中增殖、分成等份試樣且儲存于-70°C。使用桿狀病毒特異性引 物的PCR-RFLP，將MSV肯定地鑒定為PCV2 0RF2桿狀病毒。在間接熒光抗體測定中利用 多克隆血清或單克隆抗體檢測到感染了 PCV2 0RF2桿狀病毒而產(chǎn)生MSV或工作病毒種株 (Working Seed Virus)的昆蟲細胞表達PCV2 0RF2抗原。另外，憑借N-末端氨基酸測序 確認了 PCV2 0RF2桿狀病毒的身份。還根據(jù)9C. F. R. 113. 27(c)、113. 28及113. 55測試了 PCV2 0RF2桿狀病毒MSV的純度。接種于轉(zhuǎn)瓶中的每一重組桿狀病毒具有不同的病毒感染 復數(shù)（MOI)。將瓶1用7. 52mL的.088M0I的種株接種；瓶2用3. OlmL的0. 36M0I的種株 接種；瓶3用I. 5mL的0. 18M0I的種株接種；將瓶4用0. 75mL的0. 09M0I的種株接種。本 文提供構(gòu)建PCV2 0RF2重組桿狀病毒的基本步驟的示意性流程圖作為圖1。
[0081] 用桿狀病毒接種后，隨后將轉(zhuǎn)瓶在27°C ±2°C下培養(yǎng)7天，其間還在IOOrpm下攪 動。所述轉(zhuǎn)瓶使用通風蓋以允許空氣流動。對于接下來的7天，每24小時自每一轉(zhuǎn)瓶取 樣品。提取（extraction)后，將每一樣品離心且將離心沉淀及上清液兩者分離，隨后經(jīng)由 0. 45 y m-1. 0 y m孔徑的膜微過濾。
[0082] 隨后，通過ELISA測定定量所得樣品中存在的0RF2的量。用蛋白G純化的豬抗 PCV2Pab IgG (在PBS中1:250稀釋）作為捕捉抗體，在0. 05M碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6)中稀 釋至1:6000進行ELISA測定。隨后，將100 y L抗體置于微量滴定板的孔中，密封，并在37°C 下溫育過夜。隨后，用包含 〇.5mL Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO)、100mL 10X D-PBS (Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)及899. 5mL蒸餾水的洗滌溶液將板洗滌三次。隨后，將250 y L封 閉溶液（5g Carnation脫脂奶粉（Nestle, Glendale, CA)加于IOmL D-PBS中，用蒸餾水補至 IOOmL)添加至每個孔中。下一步為洗滌測試板，然后添加預稀釋的抗原。預稀釋抗原的制 備是通過將200 y L稀釋劑溶液（999. 5mL D-PBS中加0. 5mL Tween 20)添加到稀釋板上的 每個孔中。隨后，將樣品以1:240的比率及1:480的比率稀釋，且隨后將這些稀釋樣品中的 每一個取lOOyL，添加至稀釋板上的一個頂部孔中（即，一個頂部孔容納100 yL的1:240 的稀釋物，另一個頂部孔容納100 U L的1:480的稀釋物）。隨后在板的剩余部分上進行連 續(xù)稀釋，即連續(xù)地從一個孔移出100 UL轉(zhuǎn)移至板上相鄰的下一個孔中。每個孔在進行下一 次轉(zhuǎn)移之前先混合。測試板的洗滌包括用洗滌緩沖液洗滌該板三次。隨后，將該板密封并 在37°C溫育一小時，然后用洗滌緩沖液再洗滌三次。所使用的檢測抗體為PCV 0RF2的單克 隆抗體。將檢測抗體以稀釋劑溶液稀釋至1:300,然后將100 y L經(jīng)稀釋的檢測抗體添加至 孔中。隨后，將板密封并在37°C溫育一小時，然后用洗滌緩沖液洗滌三次。隨后，將正常兔 血清（Jackson Immunoresearch，West Grove, PA)添加至稀釋劑溶液中至1%濃度而制備偶 聯(lián)稀釋劑。將山羊抗小鼠的偶聯(lián)抗體（H+l)-HRP(Jackson Immunoresearch)用偶聯(lián)稀釋劑 稀釋至1:10, 000。隨后，將100 UL經(jīng)稀釋的偶聯(lián)抗體添加至每個孔中。隨后，將該板密封 并在37°C溫育45分鐘，然后用洗滌緩沖液洗滌三次。將與等體積過氧化物酶底物B (KPL) 混合的 IOOu L 底物（TMB 過氧化物酶底物，Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL)， Gaithersberg，MD)添加至每個孔中。將板在室溫下溫育15分鐘。隨后，將IOOyL的IN HCl添加至所有孔中以終止反應。隨后，使該板通過ELISA讀取器。此測定的結(jié)果提供于以 下表1中：
[0083]表 1
【權(quán)利要求】
1. 一種用于減少與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀或減輕與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀的嚴 重性、減輕動物的總豬圓環(huán)病毒負荷量和/或降低豬中豬圓環(huán)病毒感染的免疫抑制效應的 方法，該方法包括對豬施用豬2型圓環(huán)病毒抗原。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該抗原包含由與豬2型圓環(huán)病毒之0RF2具有至少 80%序列同一性的DNA序列編碼的蛋白質(zhì)。
3. 如權(quán)利要求1和2中任一項所述的方法，其中該豬2型圓環(huán)病毒抗原是重組桿狀病 毒表達的ORF2抗原。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中該豬2型圓環(huán)病毒抗原以每個劑量一（1) 毫升配制并施用。
5. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述臨床癥狀選自由淋巴結(jié)病、淋巴細胞 消減和多核組織細胞或巨組織細胞組成之群組。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞 或巨組織細胞與選自由下列癥狀組成之群組的另一癥狀組合：具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺 炎、皮膚蒼白或黃疸、斑點狀萎縮性肝、胃潰瘍、腎炎、pia樣損害及生殖病癥。
7. 如權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中所述施用是對小于15周齡的豬進行的。
8. 如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其中所述施用是對不大于3周齡，優(yōu)選不大于2 周齡的豬進行的。
9. 如權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其中所述施用在暴露于毒力型豬2型圓環(huán)病毒 抗原的約3周內(nèi)進行。
10. 如權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其中該組合物進一步包含至少一種選自由獸 醫(yī)學上可接受的載體、可藥用的載體及免疫調(diào)節(jié)劑組成的群組的額外組份。
11. 如權(quán)利要求1-10任一項所述的方法，其中所述施用選自：皮內(nèi)（intradermal)、 氣管內(nèi)、陰道內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi) (intracutaneous)、心臟內(nèi)、小葉內(nèi)、髓內(nèi)或肺內(nèi)。
12. 如權(quán)利要求1-11任一項所述的方法，其中所述豬2型圓環(huán)病毒抗原的施用不顯示 不良事件或注射部位反應。
13. -種用于改善豬的一般疾病抗性水平的方法，所述方法包括對豬施用有效量的豬 2型圓環(huán)病毒抗原。
14. 一種制造藥物的方法，所述藥物用于減少與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀或減輕與 PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀的嚴重性、減輕動物的總豬圓環(huán)病毒負荷量或降低豬圓環(huán)病毒 感染的免疫抑制效應，該方法包括獲得豬圓環(huán)病毒抗原和將該抗原與獸醫(yī)學上可接受的載 體、可藥用的載體或免疫調(diào)節(jié)劑組合的步驟。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中該抗原包含由豬2型圓環(huán)病毒之0RF2編碼的多 肽。
16. 豬2型圓環(huán)病毒抗原在制備用于減少與PCV2感染相關(guān)的臨床癥狀或減輕與PCV2 感染相關(guān)的臨床癥狀的嚴重性、減輕動物的總豬圓環(huán)病毒負荷量和/或降低豬的豬圓環(huán)病 毒感染的免疫抑制效應的藥物中的用途，其中該藥物施用于豬。
17. 如權(quán)利要求16所述的用途，其中該抗原包含由與豬2型圓環(huán)病毒之0RF2具有至少 80%序列同一性之DNA序列編碼的蛋白質(zhì)。
18. 如權(quán)利要求16和17中任一項所述的用途，其中該豬2型圓環(huán)病毒抗原為重組桿狀 病毒表達的0RF2抗原。
19. 如權(quán)利要求16-18中任一項的用途，其中該豬2型圓環(huán)病毒抗原是以每個劑量一 (1)毫升配制并施用的。
20. 如權(quán)利要求16-19中任一項的用途，其中所述臨床癥狀選自由淋巴結(jié)病、淋巴細胞 消減及多核組織細胞或巨組織細胞組成的群組。
21. 如權(quán)利要求20之用途，其中所述淋巴結(jié)病、淋巴細胞消減和/或多核組織細胞或巨 組織細胞與選自由下列癥狀組成之群組的另一癥狀組合：具有小葉間水腫的間質(zhì)性肺炎、 皮膚蒼白或黃疸、斑點狀萎縮性肝、胃潰瘍、腎炎、pia樣損害及生殖病癥。
22. 如權(quán)利要求16-21中任一項的用途，其中該施用在小于15周齡的豬中進行。
23. 如權(quán)利要求16-22中任一項的用途，其中該施用在不大于3周齡，優(yōu)選不大于2周 齡的豬中進行。
24. 如權(quán)利要求16-23任一項的用途，其中該施用在暴露于毒力型豬2型圓環(huán)病毒抗原 的約3周內(nèi)進行。
25. 如權(quán)利要求16-24任一項的用途，其中該組合物進一步包含至少一種選自由獸醫(yī) 學上可接受的載體、可藥用的載體及免疫調(diào)節(jié)劑組成的群組的額外組份。
26. 如權(quán)利要求16-25任一項的用途，其中所述施用為皮內(nèi)（intradermal)、氣 管內(nèi)、陰道內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi) (intracutaneous)、心臟內(nèi)、小葉內(nèi)、髓內(nèi)或肺內(nèi)施用。
27. 如權(quán)利要求16-26任一項的用途，其中所述豬2型圓環(huán)病毒抗原的施用不顯示不良 事件或注射部位反應。
28. 豬2型圓環(huán)病毒抗原在制備用于改善豬的一般疾病抗性水平的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K39/12GK104474541SQ201410534901
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月29日
【發(fā)明者】邁克爾.B.魯夫, 菲利普.韋恩.海斯, 馬克.艾科邁耶, 格雷格.尼采爾, 梅里爾.謝弗 申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司