一種具有腫瘤細(xì)胞靶向性的抑制劑多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有腫瘤細(xì)胞靶向性的抑制劑多肽。本發(fā)明設(shè)計了具有腫瘤細(xì)胞靶向的腫瘤抑制劑TA-2.TA-2含有胸腺肽a1的全部氨基酸序列，且在其羧基端含有腫瘤細(xì)胞靶向性多肽片段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸序列。本發(fā)明的TA-2是在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程產(chǎn)品，其純化過程包括蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析，凝膠層析。該產(chǎn)物在體內(nèi)外實驗中體現(xiàn)顯著提高原有胸腺肽a1的抗腫瘤細(xì)胞生長的效果，其有顯著作用的腫瘤包括肺癌，黑色素瘤，乳腺癌在內(nèi)的實體瘤。
【專利說明】一種具有腫瘤細(xì)胞靶向性的抑制劑多肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有腫瘤細(xì)胞靶向性的抑制劑 多肽。

【背景技術(shù)】
[0002] 研究表明，胸腺肽α? (以下簡稱Tal)是一種免疫調(diào)節(jié)因子，已被證明具有提高 免疫功能及抗病毒和抗癌作用。Τα 1可以作為免疫增強劑，已應(yīng)用于臨床治療與肝癌關(guān)系 密切的乙肝，丙肝。此外，對其他癌癥也有顯著的治療效果，如乳腺癌，胃癌，白血病等。對 嚴(yán)重敗血癥等疾病，急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)，胃腸道及全身感染性疾病，肝硬化自發(fā)性 腹膜炎也有較好的治療效果（Yumin L等· J Intensive Care Med, 2009, 24(1) :47-53和 Tuthill C等.Ann N Y Acad Sci.2010,1194:130-5)。
[0003] 整合素是一類廣泛存在于細(xì)胞表面的細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體家族，也是細(xì)胞表面 受體的主要家族，屬于一類細(xì)胞粘附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與 病原體之間相互作用。
[0004] 整合素在體內(nèi)表達(dá)廣泛，大多數(shù)細(xì)胞表面都可表達(dá)一種以上的整合素，在多種生 命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。整合素是由α (120?185kD)和β (90?IlOkD)兩個亞單位 形成的異二聚體。迄今已發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和8種β亞單位。它們按不同的組合構(gòu) 成24種整合素。在腫瘤細(xì)胞中，整合素的組成與正常細(xì)胞不同，通常與細(xì)胞遷移有關(guān)的 整合素的數(shù)量會增加，而其他的整合素數(shù)量下降。與細(xì)胞遷移有關(guān)的整合素通常都含有 α V亞基。也就是說整合素含α V的整合素在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，在正常組織不表 達(dá)（Desgrosellier JS 等· Nat Rev Cancer. 2010,10 (1) : 9-22.)。而一類含有精氨酸-甘 氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的小分子多肽，與含有α V亞基的整合素有高度的選 擇性和親和力（Pasqualini R 等 Nat Biotechnol. 1997,15(6) :542-6. )。RGD 膚與 α V 類整合素的特異性結(jié)合可介導(dǎo)多種病理生理過程的發(fā)生，尤其在腫瘤細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移 和腫瘤新生血管生成中起重要作用。因此，利用RGD肽與α V類整合素的特異結(jié)合，將 具有腫瘤細(xì)胞靶向性效果，可以有效地減少腫瘤治療中對正常組織或器官的損害，同時 RGD肽能夠直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，可以增強效應(yīng)分子的抗腫瘤效果。本發(fā)明利用的 Arg-Gly-Asp-Arg序列既兼具了與α V類整合素的特異結(jié)合的特性，也可以被神經(jīng)菌毛素 (Neuropilin-1, Nrp-Ι)所識別而介導(dǎo)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部（Teesalu T等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2009,106(38):16157-62.)，故兼具腫瘤靶向并介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤內(nèi)部的優(yōu)勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是將胸腺肽al和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸在C端進(jìn)行連接，構(gòu) 建一個具有與α V類整合素的特異結(jié)合的特性的新型的抗腫瘤藥物，具有腫瘤細(xì)胞靶向 性。其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。它是一種腫瘤細(xì)胞靶向的高效的腫瘤抑制劑，其 既可以在真核細(xì)胞也可以在原核細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明用重組DNA技術(shù)制備了含有目的基因的 原核載體，并在大腸桿菌中表達(dá)和分離純化，所獲產(chǎn)物與原型胸腺肽al相比，具有高效抗 腫瘤效果。
[0006] 本發(fā)明多肽的制備方法如下：
[0007] (1)基因的獲取
[0008] 利用基因合成的方法獲得下列序列：
[0009] GGTACCGACGACGACGACAAAAGCGATGCGGCCGTGGATACCAGCAGCGAGATCACGACCAAAGACCTG AAGGAGAAAAAGGAAGTGGTGGAAGAAGCGGAAAACGGCGGTGGCGGCCGTGGCGATCGTTAAAAGCTT 及其互補 序列。
[0010] (2)將合成的基因與原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0011] (3)將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離，金屬螯合親和層析，凝膠層析分離純化產(chǎn)物，收集并凍 干，即得。
[0012] 藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的多肽具有較強的抗腫瘤作用，下面是部分藥效學(xué)試驗和 結(jié)果：
[0013] 為了比較本發(fā)明多肽（以下簡稱TA-2)的實際效果，本發(fā)明同時克隆表達(dá)了胸腺 肽al及TA-3, TA-3含有胸腺肽al的全部氨基酸序列，且在其羧基端含有腫瘤細(xì)胞靶向性 多肽片段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。TA-3的序列如下：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Iys-Asp-Ieu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-A Ia-GLu-Gln-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Arg〇
[0014] 小鼠體內(nèi)抗腫瘤實驗：
[0015] 將培養(yǎng)的黑色素瘤B16F10細(xì)胞在C57BL/6(6-8周）小鼠體側(cè)皮下接種，當(dāng)腫瘤 平均體積達(dá)到200-300mm 3,隨機將小鼠分組，包括陽性及陰性對照組外，一組給藥本發(fā)明多 肽TA-2, 一組給藥TA-3, 一組給藥胸腺肽al。隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長與寬，并計算腫瘤 體積，腫瘤體積=長X寬2XO. 50。最終治療效果經(jīng)由腫瘤抑制率表示：（1-治療組腫瘤體 積/陰性對照組腫瘤體積）X 100%。結(jié)果表明，本發(fā)明多肽TA-2與原型胸腺肽al相比，具 有高效抗腫瘤效果；本發(fā)明多肽TA-2與TA-3相比，也具有高效抗腫瘤效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是SDS-PAGE分析純化重組的TA-2 (其中1 :分子量標(biāo)記，2 :誘導(dǎo)表達(dá)的重組 TA-2, 3 :被洗脫的雜蛋白，4 :純化的重組TA-2)
[0017] 圖2是TA-2體內(nèi)抑制黑色素瘤效果
[0018] 圖3是多肽體內(nèi)抑制黑色素瘤效果

【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 1、TA-2基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0021] 合成基因序列及其互補序列：
[0022] GGTACCGACGACGACGACAAAAGCGATGCGGCCGTGGATACCAGCAGCGAGATCACGACCAAAGACCTG AAGGAGAAAAAGGAAGTGGTGGAAGAAGCGGAAAACGGCGGTGGCGGCCGTGGCGATCGTTAAAAGCTT。
[0023] 進(jìn)行KpnI和HindIII酶切，克隆到原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，PCR法 篩選陽性轉(zhuǎn)化子，核苷酸序列測定分析。
[0024] 2、重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0025] 將重組菌接種，過夜搖育，以1 %的接種量接種至信箱培養(yǎng)基，待0D600達(dá)到0. 6 時，加入ImMIPTG誘導(dǎo)4小時。收集細(xì)胞，加入1/20菌體體積的緩沖液（20mmol/L pH 7. 4 的磷酸鈉，0. 5mol/L NaCl)懸浮細(xì)胞，冰浴超聲破碎菌體，4度13000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘， 取上清，保存于-20度冰箱。
[0026] 3、重組蛋白的分離純化
[0027] 將蛋白粗品上樣于金屬螯合層析柱，用10倍柱體積的緩沖液（20mmol/L pH 7. 4 的磷酸鈉，0. 5mol/L NaCl)洗滌層析柱，用5倍柱體積的洗脫緩沖液（20mmol/L pH 7. 4的 磷酸鈉，〇.5mol/L NaCl，0.1mol/L Imidazole)進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，用 Sephadex G-25 脫鹽，流動相為0. OlmmoVLNH4HCO3 (pH8. 6)溶液，紫外280nm檢測，收集第一個峰，所得蛋 白溶液凍干。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。取凍干樣品，在23度下，用腸激酶進(jìn)行切割 16小時,酶切混合液經(jīng)過金屬螯合層析柱,收集前流份,用用Sephadex G-25脫鹽,流動相 為0. Olmmol/L NH4HCO3 (pH8. 6)溶液，紫外檢測280nm檢測，凍干后保存于4度冰箱。
[0028] 4.動物體內(nèi)抗黑色素瘤實驗
[0029] 將培養(yǎng)的鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞用0.05 %的胰蛋白酶消化，IOOOrpm離心5分 鐘，重懸于PBS，在C57BL/6 (6-8周）小鼠體側(cè)皮下接種50000個細(xì)胞（0. lml)。當(dāng)腫瘤 平均體積達(dá)到200-300mm3,隨機將小鼠分4組，每組8只，一組給藥TA-2, 一組給藥胸腺 肽al (Tal)，一組以PBS做陰性對照，一組以紫杉醇做陽性對照。除了陰性對照，劑量都是 0. 25mg/kg/d，每天在接種腫瘤對側(cè)皮下注射。隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長與寬，并計算腫 瘤體積，腫瘤體積=長X寬2X0. 50。最終治療效果經(jīng)由腫瘤抑制率表示：（1-治療組腫瘤 體積/陰性對照組腫瘤體積）X 100%。
[0030] 結(jié)果如圖2所示，當(dāng)治療至第15天時，TA-2的腫瘤抑制率為41 %，而胸腺肽al的 腫瘤抑制率為24% (p〈0. 05)。實驗結(jié)果說明本發(fā)明設(shè)計的TA-2確實能夠顯著抑制小鼠體 內(nèi)的腫瘤生長，而且比原型胸腺肽al具有更好的抗腫瘤生長的效果。
[0031] 將培養(yǎng)的鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞用0.05%的胰蛋白酶消化，IOOOrpm離心5分 鐘，重懸于PBS，在C57BL/6 (6-8周）小鼠體側(cè)皮下接種50000個細(xì)胞（0. Iml)。當(dāng)腫瘤平 均體積達(dá)到200-300mm3,隨機將小鼠分4組，每組8只，一組給藥TA-2, 一組給藥TA-3, 一組 給藥胸腺肽al (Tal)，一組以PBS做陰性對照，一組以紫杉醇做陽性對照。除了陰性對照，劑 量都是0. 25mg/kg/d，每天在接種腫瘤對側(cè)皮下注射。隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長與寬，并 計算腫瘤體積，腫瘤體積=長X寬2X0. 50。最終治療效果經(jīng)由腫瘤抑制率表示：（1-治療 組腫瘤體積/陰性對照組腫瘤體積）X 100%。
[0032] 結(jié)果如圖3所示，當(dāng)治療至第13天時，TA-2的腫瘤抑制率為55%，TA_3的腫瘤抑 制率為49%，而胸腺肽al的腫瘤抑制率為36%。實驗結(jié)果說明本發(fā)明設(shè)計的TA-2確實能 夠顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長，并具有比TA-3和原型胸腺肽al具有更好的抗腫瘤生長 的效果。
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗腫瘤的多肽，其特征是：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的多肽的制備方法，包括：設(shè)計得到權(quán)利要求1多肽的對應(yīng)核苷酸序列， 構(gòu)建羧基端含有如權(quán)利要求1的氨基酸序列所對應(yīng)基因的載體，進(jìn)行基因工程表達(dá)和分離 純化。
3. -種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的多肽及藥學(xué)上可接受的載體。
4. 權(quán)利要求1的多肽用于制備治療腫瘤的藥物的用途。
【文檔編號】A61K38/22GK104311672SQ201410564240
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】勞興珍, 李斌, 于婷婷, 鄭珩 申請人:中國藥科大學(xué)