羥基紅花黃色素在防治流感藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】羥基紅花黃色素在制備流感病毒藥物中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)施的：首先用取自不同亞型的流感病毒神經(jīng)氨酸酶液和羥基紅花黃色素在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入熒光底物緩沖溶液進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素對H1N1、H3N2及B型流感病毒均有作用，然后我們檢測了羥基紅花黃色素在細(xì)胞水平上的抗流感作用，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素也能對感染H1N1和H3N2的細(xì)胞起到治療作用，最后，我們檢測了羥基紅花黃色素對小鼠流感模型的影響，我們發(fā)現(xiàn)加入羥基紅花黃色素后，可以明顯抑制流感感染小鼠體重的減輕程度，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平，并且能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
【專利說明】羥基紅花黃色素在防治流感藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及羥基紅花黃色素在制備抑制流感病毒藥物中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（以下簡稱流感）是由流感病毒引起的急性病毒性呼吸道傳染病，它 傳染性強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高，全球每年大約有5 %?15 %感染。甲型流感病毒RNA由8個(gè) 節(jié)段組成，編碼10個(gè)蛋白；其中第六節(jié)段編碼神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,NA)蛋白。NA是 存在于流感病毒被膜上的兩種蛋白之一，主要作用為催化水解寡糖、糖蛋白、糖脂中a-2、 3,a_2、6糖苷鍵，釋放末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸酶殘基。病毒侵染細(xì)胞時(shí)，首先通過血凝素 (hemagglutinin,HA)與細(xì)胞表面SA(唾液酸）受體結(jié)合形成糖苷鍵，再經(jīng)NA催化，切斷糖 苷鍵，以利于流感病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；子代病毒完成復(fù)制后，以出芽的方式突出宿主細(xì)胞，再 通過NA的催化作用而釋放，從而感染新的宿主細(xì)胞。
[0003] 中醫(yī)中藥抗病毒已有數(shù)千年的歷史，我國在利用中藥防治流感方面積累了大量寶 貴的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。在我國，中藥資源非常豐富，從古至今用中醫(yī)藥治療流感療效顯著。 但在國外，由于中藥中有效成分不明，作用原理不清，所以使中藥的發(fā)展在國外受阻。現(xiàn)在 單味中藥抗流感的研究已經(jīng)有數(shù)十年了，已經(jīng)篩選出很多具有抗流感病毒的中草藥。所以， 我們從天然產(chǎn)物中獲得了新穎的具有NA抑制活性的化合物--輕基紅花黃色素，以此來尋 找抑制流感NA，從而抑制流感病毒的新藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供羥基紅花黃色素在制備流感病毒藥物中的應(yīng)用。羥基紅 花黃色素能夠有效的抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，從而抑制流感病毒在體內(nèi)的繁殖，進(jìn)而減輕 或治愈流感患者。本發(fā)明對化合物羥基紅花黃色素對HlNl(代表group-1)和H3N2(代 表group-2)兩類NA進(jìn)行了體外酶學(xué)抑制性的檢測，發(fā)現(xiàn)其對HlNl和H3N2的IC5tl分別為 90. 40±9. 13iimol/L，155. 33± 17. 37iimol/L，我們又對這兩種病毒感染MDCK細(xì)胞并加以 此種化合物進(jìn)行了細(xì)胞存活率的測定，發(fā)現(xiàn)此化合物均能提高病毒感染后的細(xì)胞存活率。 本發(fā)明為開發(fā)以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的新藥提供基礎(chǔ)，為羥基紅花黃色素應(yīng)用于人類流感的 治療提供了參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0005] 圖1是不同濃度羥基紅花黃色素對HlNl，H3N2和B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制 作用。
[0006] 圖2是不同濃度羥基紅花黃色素與HlNl或H3N2共同作用后，混合液對MDCK細(xì)胞 的損傷作用。
[0007] 圖3是不同濃度羥基紅花黃色素對感染了HlNl或H3N2的MDCK細(xì)胞的治療作用。
[0008] 圖4是不用濃度羥基紅花黃色素對感染了流感病毒的小鼠體重的影響。
[0009] 圖5是不用濃度羥基紅花黃色素對感染流感病毒的小鼠肺中病毒載量的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下通過實(shí)例形式的【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0011] 實(shí)施例1
[0012] 我們用含有流感病毒NA的尿囊液（經(jīng)雞胚傳代，收尿囊液，-80°C保存）在 pH6. 5MES緩沖液（32. 5mM)中進(jìn)行配制，我們將49iiL的NA液及其與不同濃度的41iiL 羥基紅花黃色素的混合物加入到反應(yīng)緩沖液中，在37 °C孵箱中放置30min，然后加入 50iiL20iiMMU-NANA底物緩沖液，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長 為450nm，檢測時(shí)長8min。檢測結(jié)果為，羥基紅花黃色素對H1N1，H3N2和B型流感病 毒NA的半數(shù)一直濃度（IC5tl)分別為 90. 40±9. 13iimol/L，155. 33±17. 37iimol/L和 104.72±8.91iimol/L。
[0013] 實(shí)施例2
[0014] 為了檢測羥基紅花黃色素在細(xì)胞水平的抗流感作用，我們用兩種不同的處理對其 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：首先將羥基紅花黃色素按濃度梯度稀釋成不同濃度，I將上述溶液與IOOTCIDki 的不同亞型流感病毒（HlNl和H3N2)等體積孵育2小時(shí)，總體積為200iiL。然后將混合液 加入到MDCK細(xì)胞中孵育2h;II將IOOTCID5q的不同亞型流感病毒（HlNl和H3N2)在MDCK 細(xì)胞中孵育2小時(shí)，在加入不用濃度的羥基紅花黃色素孵育2小時(shí)。2種不同處理稀釋液都 用維持液（10Ug/ml胰酶的DMEM)。2小時(shí)后，換一次上述的維持液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。24 小時(shí)后換含有2%血清的維持液，連續(xù)觀察2?3天，用MTT法檢測細(xì)胞病變效果。上述實(shí) 驗(yàn)均在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)。
[0015] 結(jié)果如圖2和圖3所示，在不同處理?xiàng)l件下，加入羥基紅花黃色素與流感病毒時(shí)， 隨著羥基紅花黃色素濃度的增加，細(xì)胞存活率也隨著增加。說明羥基紅花黃色素可以抑制 流感病毒，保護(hù)MDCK細(xì)胞免受病毒破壞，而且保護(hù)效應(yīng)也隨著羥基紅花黃色素濃度的增加 呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0016] 實(shí)施例3
[0017]為了檢測羥基紅花黃色素在小鼠流感模型中的保護(hù)作用，我們采用SOilLlOLD5tl 的FMl病毒滴鼻感染小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，分別為NC組；IOLD5tl組；10LD5Q+50mg/ kgTamiflu組；輕基紅花黃色素低、中、高劑量組：10LD5(i+50, 100, 200mg/kgSafflominA。 每組10只，病毒攻擊前1天開始給藥，均采用灌胃給藥的方式，每天2次，連續(xù)7天，每只小 鼠灌胃0.2ml。每天記錄小鼠生存狀態(tài),體重變化。然后在15天時(shí),處死小鼠,記錄肺重,對 肺組織研磨加入PBS，后測定其NA活性。
[0018] 結(jié)果如圖4和圖5所示，說明羥基紅花黃色素可以抑制流感感染小鼠體重的減輕 程度，改善小鼠的生存狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0019] 結(jié)果如下表所示，說明不同濃度的羥基紅花黃色素能顯著降低流感小鼠的肺指 數(shù)。
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 化合物羥基紅花黃色素在防治流感藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1中羥基紅花黃色素以作為單一成分在防治流感藥物的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1中羥基紅花黃色素以作為復(fù)方藥物中的一種成分在防治流感藥物的 應(yīng)用
4. 如權(quán)利要求1中羥基紅花黃色素以口服給藥方式的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1中羥基紅花黃色素以注射給藥方式的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1中羥基紅花黃色素以噴霧吸入方式的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK104306366SQ201410572638
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】房學(xué)迅, 于淼, 麻彤輝, 于大海, 王溪竹, 王燁, 田莉, 梁偉國, 楊吉雨 申請人:吉林大學(xué)