透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑及其制備方法，由丁二酸酐修飾的槲皮素與己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸反應(yīng)得到的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物在蒸餾水中超聲分散而成，透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物為己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩沖液中，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修飾的槲皮素，在N2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)后透析、凍干制得。本發(fā)明膠束制劑在電鏡下呈圓球形，平均粒徑為172.1nm，界面電勢(shì)為-20.3mV，藥物含量為10.2％，且呈現(xiàn)明顯的緩釋特征，具有一定的pH敏感性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示制劑能明顯提高槲皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，且在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，對(duì)CD44過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有良好的靶向性。
【專利說(shuō)明】透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑及其制備方法，屬于膠束制 備【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 槲皮素（Quercetin，QT)是從天然植物中提取的多酚黃酮類化合物，具有廣泛的 藥理作用。研究表明槲皮素對(duì)多種癌癥均具備良好的抑制作用，如乳腺癌，肺癌，卵巢癌等。 然而由于其溶解度低，親水性差，在胃腸道中不穩(wěn)定，以及廣泛的首過(guò)代謝，槲皮素在臨床 上的應(yīng)用受到了很大的限制。為了提高槲皮素的生物利用度，目前的研究主要集中于利用 納米技術(shù)制備槲皮素的各種新型制劑，如包合物、微乳、脂質(zhì)體、聚合物膠束、納米結(jié)晶和膠 束等。其中，制備具有自組裝能力的天然聚合物-藥物結(jié)合物受到了廣泛關(guān)注。
[0003] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid, HA)是一種天然的高分子酸性黏多糖，具有良好的生 物相容性和生物可降解性。將其與疏水性藥物結(jié)合后可明顯提高藥物的水溶性。此外，透 明質(zhì)酸與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的特異性標(biāo)志物，如⑶44具有較高的親合力。因此以透明 質(zhì)酸為靶向分子與藥物結(jié)合后，可增強(qiáng)由受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，使藥物主動(dòng)靶向于病 灶部位，避免對(duì)正常細(xì)胞的毒性，提高藥物的治療指數(shù)。
[0004] 此外，透明質(zhì)酸分子中眾多的羥基和羧基為結(jié)合藥物提供了活性位點(diǎn)，但直接結(jié) 合有低效性，將槲皮素與透明質(zhì)酸有效結(jié)合才有利于廣泛應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服上述不足而提供一種透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束 制劑及其制備方法，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的有效結(jié)合，還可控制透明質(zhì)酸分子中羧基的取代 度，有利于保留其主動(dòng)靶向性。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑，由丁二酸酐修飾的槲皮素與己二酸二 酰肼修飾的透明質(zhì)酸反應(yīng)得到的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物在蒸餾水中超聲分散而成。
[0008] 所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物為己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩 沖液中，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修飾的槲皮素，在N 2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)后透析、凍 干制得。
[0009] 透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，包括步驟如下：
[0010] (1) 丁二酸酐修飾的槲皮素的制備：將槲皮素和丁二酸酐溶于四氫呋喃中，加入 催化劑，N2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?3天，除雜純化處理得到反應(yīng)中間體槲皮素半琥珀酸； 將所得中間體溶于乙腈中，加入N-羥基丁二酰亞胺磷酸二苯酯（SDPP)和催化劑，N 2保護(hù)下 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2?10h，將反應(yīng)液后處理得丁二酸酐修飾的槲皮素，即QT-NHS酯粗品；
[0011] (2)己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸的制備：將透明質(zhì)酸HA溶于H2O中，加入己二酸 二酰肼（ADH)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,再加入催化劑，并保持pH在4. 75時(shí)間0. 1?Ih后 用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0,反應(yīng)液用蒸餾水透析，凍干得HA-ADH ;
[0012] (3)己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩沖液中形成lmg/ml的溶液，加入 用DMSO溶解的丁二酸酐修飾的槲皮素，在N 2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?3天后透析、凍干制 得透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物HA-QT ;
[0013] (4)將HA-QT固體，置于蒸餾水中，室溫下，攪拌后超聲分散，使其在水中分散均 勻，形成膠束制劑。
[0014] 上述制備方法中步驟（1)中槲皮素與丁二酸酐的摩爾比例為1:1?5,槲皮素與四 氫呋喃的用量為1?5: l,mg/mL,槲皮素與催化劑的摩爾比例為1:1?20,所述的催化劑選 自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一種或兩種以上。所述的除雜純化處理為去除溶劑，堿洗，乙 酸乙酯提取，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na 2SO4干燥，過(guò)濾，蒸除溶劑。所述的中間體與SDPP的摩 爾比例為1:1?5,中間體與乙腈的用量為1?5:1，mg/mL，中間體與催化劑的摩爾比例為 1:1?10,所述的催化劑選自吡陡、三乙胺、EDCI中的任一種或兩種以上。所述的后處理為 旋蒸去除溶劑，乙酸乙酯溶解，水洗，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na 2SO4干燥，過(guò)濾，蒸除溶劑。
[0015] 步驟⑵中HA與ADH的摩爾比例為1:0. 5?5，擬與H2O的用量為5?20: l，mg/ mL，HA與催化劑的質(zhì)量比例為3?10:1，所述的催化劑選自吡陡、三乙胺、EDCI中的任一種 或兩種以上。所述的鹽酸的濃度為lmol/L，氫氧化鈉溶液的濃度為lmol/L。所述的蒸餾水 透析兩天，每12h換水一次。
[0016] 步驟⑶中用的pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液，己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸與丁二 酸酐修飾的槲皮素用量的質(zhì)量比例為2?10:1，DMS0與體系中水的體積比為2:1。所述的 透析為先用DMSO透析2天,再用蒸饋水透析3天。
[0017] 步驟⑷中HA-QT與蒸饋水的比例為2?10:1，mg/mL ;所述的超聲分散為攪拌 IOmin 后超聲 lmin。
[0018] 槲皮素水溶性差，在胃腸道中不穩(wěn)定，口服生物利用度在小鼠中小于17%，人體還 不到2%，極大的限制了其臨床應(yīng)用，因而研發(fā)具有良好溶解性能的槲皮素給藥系統(tǒng)備受關(guān) 注。透明質(zhì)酸水溶性強(qiáng)，以其作為載體，在提高藥物水溶性的同時(shí)，還能延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的 滯留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)制劑對(duì)腫瘤的靶向治療作用。本發(fā)明研究首次將槲皮素與透明質(zhì)酸相結(jié)合， 是一種具有較長(zhǎng)的體內(nèi)作用時(shí)間，較好的主動(dòng)靶向功能的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝 膠束制劑。該結(jié)合物膠束與槲皮素原料藥相比，顯示了更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取作用，以 及更長(zhǎng)的動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和抗腫瘤療效。細(xì)胞研究結(jié)果顯示，透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物 自組裝膠束與非槲皮素原料藥相比，可明顯提高槲皮素對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性和攝取。動(dòng)物 研究表明，該結(jié)合物的膠束在大鼠體內(nèi)的平均滯留時(shí)間，半衰期和血藥峰濃度和體內(nèi)抗腫 瘤活性均顯著高于槲皮素原料藥。此外，與表面活性劑膠束相比，此類聚合物膠束具有較高 的載藥量，較低的臨界膠束濃度濃度，且呈現(xiàn)良好的緩釋行為，可有效避免劇烈的突釋。本 發(fā)明膠束制劑在電鏡下呈圓球形，平均粒徑為172. lnm，界面電勢(shì)為-20. 3mV，藥物含量為 10. 2% (w/w)，且呈現(xiàn)明顯的緩釋特征，具有一定的pH敏感性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示制劑能明顯提 高槲皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，且在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，對(duì)CD44過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有 良好的靶向性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該膠束能明顯改善藥物在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，增強(qiáng)藥物 的抗腫瘤效果，且安全無(wú)毒，無(wú)刺激。本發(fā)明的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑將 來(lái)有望成為癌癥治療的新型藥物制劑。
[0019] 此外，本發(fā)明所采用的制備方法，簡(jiǎn)單易行，且條件溫和，有效地避免了劇烈反應(yīng) 條件對(duì)槲皮素藥物活性的破壞。且該方法具有良好的通用性，可普遍用于以透明質(zhì)酸為載 體與其他藥物相結(jié)合的制備工藝之中。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :以pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液（PBS)為釋放介質(zhì)于37°C下制劑及原料藥的釋 放行為。三條曲線分別代表：HA-QT制劑在含有1 %吐溫-80的釋放介質(zhì)，HA-QT制劑在含 有1 %吐溫-80和酯酶的釋放介質(zhì)，及槲皮素的丙二醇溶液的釋放行為。
[0021] 圖2 :以pH = 5. 0的磷酸鹽緩沖液（PBS)為釋放介質(zhì)于37°C下制劑及原料藥的釋 放行為。三條曲線分別代表：HA-QT制劑在含有1 %吐溫-80的釋放介質(zhì)，HA-QT制劑在含 有1 %吐溫-80和酯酶的釋放介質(zhì)，及槲皮素的丙二醇溶液的釋放行為。
[0022] 圖3 :槲皮素及HA-QT膠束制劑在MCF-7細(xì)胞和L929細(xì)胞中的毒性和攝取情況。 A =HA-QT膠束制劑的細(xì)胞攝取圖，B :HA阻斷后HA-QT膠束制劑的細(xì)胞攝取圖。
[0023] 圖4 :靜脈注射槲皮素及HA-QT膠束制劑后血漿濃度對(duì)時(shí)間的曲線圖。大鼠給予 槲皮素8mg/kg，兩條曲線分別代表注射槲皮素原料藥（菱形），HA-QT膠束制劑（方形）的 血藥濃度變化。
[0024] 圖5 :小鼠在體荷瘤實(shí)驗(yàn)中腫瘤體積的變化曲線。小鼠注射H22肝癌細(xì)胞以誘導(dǎo) 其發(fā)生腫瘤。四條曲線分別代表給藥生理鹽水（圓形），透明質(zhì)酸溶液（方形），槲皮素原 料藥（三角形）和HA-QT膠束制劑（菱形）后小鼠腫瘤體積的變化。
[0025] 圖6 :小鼠在體荷瘤實(shí)驗(yàn)中腫瘤組織照片。
[0026] 圖7 :兔耳緣靜脈注射部位病理切片圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0028] 實(shí)施例1 :制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑
[0029] 步驟如下：（1)將槲皮素（30mg)和丁二酸酐（IOmg)溶于四氫呋喃（IOmL)中，力口 入吡啶（20 μ L)，N2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天。去除溶劑，堿洗，乙酸乙酯提取，飽和食鹽 水洗，無(wú)水Na2SO 4干燥。過(guò)濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析純化得到反應(yīng)中間體槲皮素半琥珀酸。 將所得固體（20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(ISmg)和三乙胺（7yL)，N 2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺?應(yīng)6h。去除溶劑，堿洗，乙酸乙酯提取，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na2SO 4干燥。過(guò)濾，蒸除溶劑， 得QT-NHS酯粗品。
[0030] (2)將 HA (50mg)溶于 H2O (IOmL)中，加入 ADH (4. 4mg)，用 lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 4. 75。再加入EDCI (8mg)，并保持pH在4. 75。10分鐘后用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0。反應(yīng)液用蒸餾水透析兩天，每12h換水一次。凍干得HA-ADH。
[0031] (3)將HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，形成lmg/ml的溶 液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(5mg)，以形成澄清均勻的反應(yīng)液（DMSO = H2O = 2:1)。N2保 護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2天。將反應(yīng)液先用DMSO透析2天，再用蒸餾水透析3天。凍干得透 明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物（HA-QT)。
[0032] (4)將所得HA-QT結(jié)合物（IOmg)室溫下溶于5mL蒸餾水中，超聲lmin，以形成自 組裝膠束制劑。
[0033] 實(shí)施例2 :制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑 [0034] 步驟如下：（1)將槲皮素（30mg)和丁二酸酐（20mg)溶于四氫呋喃中，加入三乙胺 (56 μ L)，N2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天。過(guò)濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析純化得到反應(yīng)中間體 槲皮素半琥珀酸。將所得固體（20mg)溶于乙腈中，加入SDPP (36mg)和吡啶（16 μ L)，N2保 護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。去除溶劑，堿洗，乙酸乙酯提取，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na2SO 4干燥。 過(guò)濾，蒸除溶劑，得QT-NHS酯粗品。
[0035] (2)將 HA (50mg)溶于 H2O (5mL)中，加入 ADH (8. 7mg)，用 lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 4. 75。再加入EDCI (IOmg)，，并保持pH在4. 75。20分鐘后用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH至7. 0。反應(yīng)液用蒸饋水透析兩天，每12h換水一次。凍干得HA-ADH。
[0036] (3)將HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，形成lmg/ml的溶液。 加入用DMSO溶解的QT-NHS(IOmg)，以形成澄清均勻的反應(yīng)液（DMSO = H2O = 2:1)。N2保護(hù) 下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2天。將反應(yīng)液先用DMSO透析2天，再用蒸餾水透析3天。凍干得透明 質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物（HA-QT)。
[0037] (4)將所得HA-QT結(jié)合物（15mg)室溫下溶于5mL蒸餾水中，超聲lmin，以形成自 組裝膠束制劑。
[0038] 實(shí)施例3 :制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑
[0039] 步驟如下：（1)將槲皮素（30mg)和丁二酸酐（50mg)溶于四氫呋喃中，加入吡啶 (60 μ L)，N2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天。過(guò)濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析純化得到反應(yīng)中間體 槲皮素半琥珀酸。將所得固體（20mg)溶于乙腈中，加入SDPP (72mg)和三乙胺（70 μ L)，N2 保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。將反應(yīng)液旋蒸去除溶劑，乙酸乙酯溶解，水洗，飽和食鹽水洗，無(wú) 水Na2SO 4干燥。過(guò)濾，蒸除溶劑，得QT-NHS酯粗品。
[0040] (2)將 HA(50mg)溶于 H20(15mL)中，加入 ADH(43. 6mg)，用 lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至4. 75。再加入EDCI (5mg)，并保持pH在4. 75。Ih后用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7. 0。反應(yīng)液用蒸餾水透析兩天，每12h換水一次。凍干得HA-ADH。
[0041] (3)將HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，形成lmg/ml的溶 液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(6mg)，以形成澄清均勻的反應(yīng)液（DMSO = H2O = 2:1)。N2保 護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2天。將反應(yīng)液先用DMSO透析2天，再用蒸餾水透析3天。凍干得透 明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物（HA-QT)。
[0042] (4)將所得HA-QT結(jié)合物（50mg)室溫下溶于5mL蒸餾水中，超聲lmin，以形成自 組裝膠束制劑。
[0043] 實(shí)施例4 :制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑
[0044] 步驟如下：（1)將槲皮素（30mg)和丁二酸酐（30mg)溶于四氫呋喃中，加入吡啶 (40 μ L)，N2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天。過(guò)濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析純化得到反應(yīng)中間體 槲皮素半琥珀酸。將所得固體（20mg)溶于乙腈中，加入SDPP (54mg)和三乙胺（35 μ L)，N2 保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。去除溶劑，堿洗，乙酸乙酯提取，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na2SO4干燥。 過(guò)濾，蒸除溶劑，得QT-NHS酯粗品。
[0045] (2)將 HA(50mg)溶于 H20(12mL)中，加入 ADH(26mg)，用 lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 4. 75。再加入EDCI (15mg)，并保持pH在4. 75。0· 5h后用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0。反應(yīng)液用蒸餾水透析兩天，每12h換水一次。凍干得HA-ADH。
[0046] (3)將HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，形成lmg/ml的溶液。 加入用DMSO溶解的QT-NHS(15mg)，以形成澄清均勻的反應(yīng)液（DMSO = H2O = 2:1)。N2保護(hù) 下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2天。將反應(yīng)液先用DMSO透析2天，再用蒸餾水透析3天。凍干得透明 質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物（HA-QT)。
[0047] (4)將所得HA-QT結(jié)合物（35mg)室溫下溶于5mL蒸餾水中，超聲lmin，以形成自 組裝膠束制劑。
[0048] 實(shí)施例5 :制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑
[0049] 步驟如下：（1)將槲皮素（30mg)和丁二酸酐（15mg)溶于四氫呋喃中，加入吡啶 (40 μ L)，N2保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天。過(guò)濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析純化得到反應(yīng)中間體 槲皮素半琥珀酸。將所得固體（20mg)溶于乙腈中，加入SDPP (27mg)和三乙胺（28 μ L)，N2 保護(hù)下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。去除溶劑，堿洗，乙酸乙酯提取，飽和食鹽水洗，無(wú)水Na2SO4干燥。 過(guò)濾，蒸除溶劑，得QT-NHS酯粗品。
[0050] (2)將 HA (50mg)溶于 H2O (20mL)中，加入 ADH (19mg)，用 lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 4. 75。再加入EDCI (20mg)，并保持pH在4. 75。15分鐘后用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH至7. 0。反應(yīng)液用蒸饋水透析兩天，每12h換水一次。凍干得HA-ADH。
[0051] (3)將HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，形成lmg/ml的溶液。 加入用DMSO溶解的QT-NHS(20mg)，以形成澄清均勻的反應(yīng)液（DMSO = H2O = 2:1)。N2保護(hù) 下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2天。將反應(yīng)液先用DMSO透析2天，再用蒸餾水透析3天。凍干得透明 質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物（HA-QT)。
[0052] (4)將所得HA-QT結(jié)合物（25mg)室溫下溶于5mL蒸餾水中，超聲lmin，以形成自 組裝膠束制劑。
[0053] 取上述制備的膠束制劑適量，用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其粒度分布，界面電位分析儀 測(cè)定脂質(zhì)體樣品的界面電位。室溫下測(cè)得平均粒徑為172. lnm，界面電勢(shì)為-20. 3mV。透射 電鏡下呈圓球形，大小均一，表面光滑，無(wú)粘連。紫外分光光度計(jì)測(cè)得載藥量為10.2% (w/ w)。
[0054] 試驗(yàn)例1 :
[0055] 按照實(shí)施例5制備透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束，取2mL HA-QT膠束溶液 置于透析袋中，排出氣泡，密封，放入30ml釋放介質(zhì)中，37°C水浴振蕩（IOOr^mirT1)。在預(yù) 設(shè)的時(shí)間點(diǎn)取樣2mL，同時(shí)補(bǔ)加2mL的釋放介質(zhì)。用HPLC法測(cè)定釋放介質(zhì)中藥物濃度，計(jì)算 累積釋放率Q n。同法以槲皮素的丙二醇溶液作為對(duì)照進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。此外，為了更好 模擬槲皮素進(jìn)入機(jī)體后的釋放行為，我們又增設(shè)了兩組釋放實(shí)驗(yàn)，即將結(jié)合物膠束置于透 析袋中的同時(shí)加入一定量的酯酶（16U/mL)，并分別以pH = 5. 5或pH = 7. 4含有1 % Tween 80的PBS溶液為釋放介質(zhì)。
[0056] 結(jié)果：如圖1和2所示，HA-QT結(jié)合物的膠束在pH = 7. 0的PBS中的釋放明顯高于 pH = 5. 0的PBS，顯示出良好的pH敏感性釋放特征。同時(shí)，與不含酯酶的釋放介質(zhì)相比，制 劑在含有酯酶的釋放介質(zhì)中明顯釋放較快，表明結(jié)合物通過(guò)酯鍵的斷裂以釋放槲皮素。無(wú) 論在何種釋放介質(zhì)中，與槲皮素溶液相比，HA-QT膠束均顯示了較好的緩釋特性。
[0057] 試驗(yàn)例2 :
[0058] 采用MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和L929細(xì)胞，以I X IO4個(gè)/孔的密度接種到 96孔培養(yǎng)板中，用含有10% (v/v)胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基在37°C下孵育24h。待細(xì)胞貼壁 后，加入不同濃度的HA-QT膠束制劑或槲皮素溶液，且每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。孵育72h后， 每孔加入20 μ L MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。最后，吸棄含有MTT的培養(yǎng)基，滴加100 μ L DMSO 以充分溶解甲瓚結(jié)晶，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（測(cè)定波長(zhǎng)570nm)檢測(cè)。
[0059] 結(jié)果：如表1所示，HA-QT膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞（CD44高表達(dá)）和L929細(xì)胞（CD44 低表達(dá)）的毒性分別是槲皮素原料藥的3. 93和1.63倍。對(duì)比制劑在這兩種細(xì)胞中的毒性 增強(qiáng)程度，可以發(fā)現(xiàn)HA-QT膠束對(duì)透明質(zhì)酸受體高度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有較好的選擇性和 細(xì)胞毒性。
[0060] 表IMTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試槲皮素及其制劑在對(duì)MCF-7和L929細(xì)胞的毒性
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑，由丁二酸酐修飾的槲皮素與己二酸二酰 肼修飾的透明質(zhì)酸反應(yīng)得到的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物在蒸餾水中超聲分散而成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑，其特征是，所述 的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物為己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩沖液中，加入用 DMSO溶解的丁二酸酐修飾的槲皮素，在N2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)后透析、凍干制得。
3. 透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特征是，包括步驟如下： (1) 丁二酸酐修飾的槲皮素的制備：將槲皮素和丁二酸酐溶于四氫呋喃中，加入催化 齊U，N2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?3天，除雜純化處理得到反應(yīng)中間體槲皮素半琥珀酸；將所 得中間體溶于乙腈中，加入N-羥基丁二酰亞胺磷酸二苯酯SDPP和催化劑，N2保護(hù)下室溫?cái)?拌反應(yīng)2?10h，將反應(yīng)液后處理得丁二酸酐修飾的槲皮素，即QT-NHS酯粗品； (2) 己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸的制備：將透明質(zhì)酸HA溶于H2O中，加入己二酸二酰 肼ADH，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,再加入催化劑，并保持pH在4. 75時(shí)間0? 1?Ih后用氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0,反應(yīng)液用蒸餾水透析，凍干得HA-ADH ; (3) 己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩沖液中形成lmg/ml的溶液，加入用 DMSO溶解的丁二酸酐修飾的槲皮素，在N2保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?3天后透析、凍干制得 透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物HA-QT ; (4) 將HA-QT固體，置于蒸餾水中，室溫下，攪拌后超聲分散，使其在水中分散均勻，形 成膠束制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其 特征是，（1)中槲皮素與丁二酸酐的摩爾比例為1:1?5,槲皮素與四氫呋喃的用量為1? 5: l，mg/mL，槲皮素與催化劑的摩爾比例為1:1?20,所述的催化劑選自吡陡、三乙胺、EDCI 中的任一種或兩種以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特 征是，步驟（1)中所述的中間體與SDPP的摩爾比例為1:1?5,中間體與乙腈的用量為1? 5:1，mg/mL，中間體與催化劑的摩爾比例為1:1?10,所述的催化劑也選自吡啶、三乙胺、 EDCI中的任一種或兩種以上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特 征是，步驟（2)中HA與ADH的摩爾比例為1:0. 5?5，擬與H2O的用量為5?20: l，mg/mL， HA與催化劑的質(zhì)量比例為3?10:1，所述的催化劑選自吡陡、三乙胺、EDCI中的任一種或 兩種以上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特 征是，步驟（3)中用的pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖液，己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸與丁二酸 酐修飾的槲皮素用量的質(zhì)量比例為2?10:1，DMSO與體系中水的體積比為2:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特 征是，步驟（4)中HA-QT與蒸餾水的比例為2?10:1，mg/mL。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸-槲皮素結(jié)合物自組裝膠束制劑的制備方法，其特 征是，步驟（4)中所述的超聲分散為攪拌IOmin后超聲lmin。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104324384SQ201410579828
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】翟光喜, 龐鑫, 楊小葉 申請(qǐng)人:山東大學(xué)