蜂膠總黃酮在治療急性放射性腸損傷中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及蜂膠總黃酮在治療急性放射性腸損傷中的應(yīng)用。用于腹部腫瘤放射治療后，放射線對腹腔腸管的損傷。采用放射治療的同時口服蜂膠總黃酮，可以有效抑制小腸放射損傷后DAO和NO的表達(dá)，從而在微觀上證明其可明顯抑制腸道上皮細(xì)胞損傷，降低腸黏膜通透性，從而有效保護(hù)腸黏膜屏障功能，防止腸道細(xì)菌移位感染，明顯減輕小腸黏膜的病理損傷，同時對腸黏膜的放射性損傷具有修復(fù)和保護(hù)作用。
【專利說明】蜂膠總黃酮在治療急性放射性腸損傷中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了蜂膠總黃酮治療急性放射性腸損傷的一種方法，屬生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]臨床治療腹部腫瘤時，所采用的放射治療，不僅將殺死殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常組織細(xì)胞也具有一定的損傷性，特別是對腸管的損傷更為明顯。盡管我們采取了各種防護(hù)措施，如縮小照射野的范圍，降低照射劑量等等，然而放射性腸損傷發(fā)生率仍然越發(fā)增多，嚴(yán)重影響惡性腫瘤患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，目前主要以對癥和支持治療為主，如處理不當(dāng)，甚至造成嚴(yán)重的遷延不愈的腸損傷。因此積極防治輻射所致急性腸黏膜損傷具有非常重要的臨床意義。
[0003]蜂膠是蜜蜂代謝合成的一種膠狀固體物，含有黃酮類，萜烯類，酚類以及酯類等300多種生物活性物質(zhì)，具有抗炎，抗氧化，抗輻射，抗腫瘤，提高免疫力的功效，而總黃酮是蜂膠中的主要效應(yīng)物質(zhì)。有研究表明蜂膠總黃酮對心肌細(xì)胞缺血再灌注和氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)作用。近年發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)能夠抑制惡性腫瘤細(xì)胞增生并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類物質(zhì)可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞和粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明公開蜂膠總黃酮治療急性放射性腸損傷的一種方法，用于腹部腫瘤放療而造成的腸管損傷的治療方法。
[0005]本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)證明蜂膠總黃酮應(yīng)用于在腹部腫瘤放療而造成的腸管損傷的治療方法:通過建立放射性大鼠腸損傷模型，蜂膠總黃酮在防護(hù)射線引起的腸黏膜損傷的保護(hù)作用，可明顯減輕大鼠照射后腸損傷癥狀，提高大鼠放射損傷后存活率。將大鼠隨機(jī)分配入組，排除非研究因素的干擾，盡可能保證實(shí)驗(yàn)大鼠的同質(zhì)性。照射后腸黏膜上皮細(xì)胞即有變性壞死，3天損傷達(dá)高峰，上皮細(xì)胞廣泛壞死脫落，3天以后小腸黏膜進(jìn)行漸進(jìn)性損傷修復(fù)，所以我們選取3天時間點(diǎn)處死大鼠取材。采用9Gy高能X線單次腹部照射，光鏡下和電鏡下觀察照射組小腸組織形態(tài)較正常組明顯損傷，達(dá)到病理損傷標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)大鼠放射性腸損傷模型建立成功。
[0006]健康清潔級大鼠，在清潔動物房內(nèi)溫度18?22 °C，濕度50 %，普通光照，用標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。將大鼠隨機(jī)分為5組:C組正常對照組；R組單純照射組；Tl組高劑量總黃酮；T2組總黃酮低劑量組；Ν組陽性對照。放射性腸損傷模型的建立:給藥第7天(除正常對照組)，稱重后麻醉，固定，用直線加速器單次腹部照射，照射范圍為劍突至恥骨聯(lián)合。照射完畢待大鼠蘇醒后將其放回籠內(nèi)，自由活動及飲水。

【具體實(shí)施方式】
[0007]下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
[0008]健康清潔級8周齡SD雄性大鼠64只，體重200?250g，在清潔動物房內(nèi)用標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，溫度18?22°C，濕度50%，普通光照，自由飲水，觀察大鼠有無不良反應(yīng)，進(jìn)食飲水活動正常。將大鼠隨機(jī)分為5組:C組正常對照組；R組單純照射組；T1組高劑量總黃酮；T2組總黃酮低劑量組；Ν組NAC組設(shè)為陽性對照。
[0009]放射性腸損傷模型的建立:給藥第7天(除正常對照組)，大鼠禁食12h，不禁水，將實(shí)驗(yàn)大鼠(除正常對照組)逐一稱重后麻醉，固定，予6MV醫(yī)用直線加速器單次腹部照射，照射范圍為劍突至恥骨聯(lián)合。照射完畢待大鼠蘇醒后將其放回籠內(nèi)，自由活動及飲水。所有大鼠照射后第3天禁食12h后處死取材。
[0010]檢測指標(biāo):一般情況觀察:飲食及精神狀態(tài)，有無腹瀉(糞便性狀及頻率)及血便，體重變化。
[0011]I腸黏膜病理組織形態(tài)觀察:麻醉后在無菌狀態(tài)下迅速打開腹腔，在回盲部近端1cm處取一段小腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，預(yù)冷無菌生理鹽水沖洗，取回盲腸近端腸組織固定，制成超薄切片，透射電鏡下觀察腸黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(線粒體改變，微絨毛高度及其損傷改變)。另取回腸末端組織固定24h，脫水、包埋、切片、HE染色，置于光鏡下觀察腸黏膜及絨毛組織形態(tài)學(xué)變化。
[0012]2原位末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡觀察:取回腸組織固定，包埋，切片，脫蠟，脫水，PBS緩沖液漂洗、2%的蛋白酶K工作液37°C反應(yīng)20?25分鐘，PBS緩沖液漂洗封閉反應(yīng)10?12分鐘，PBS緩沖液漂洗，滴加反應(yīng)液，37°C避光濕潤反應(yīng)60?70分鐘，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞:照射后第I天，各組均未見明顯異常，較照射前無明顯改變；照射后第2天，R組大鼠均出現(xiàn)稀水樣便，未見粘液樣便和血便，精神較前萎靡，行動較遲緩，飲食差，Tl和N組各有3只大鼠出現(xiàn)稀水樣便，無血便，精神和飲食尚可；T2組5只大鼠出現(xiàn)稀水樣便，精神和飲食一般；第三天R組6只大鼠出現(xiàn)粘液樣便，無血便，有3只大鼠死亡；Τ2組大鼠7只出現(xiàn)稀水樣便，2只大鼠出現(xiàn)粘液樣便，未見明顯血便，精神和飲食欠佳，未見大鼠死亡。Tl組4只大鼠出現(xiàn)稀水樣便，N組6只大鼠出現(xiàn)稀水樣便，二組皆未出現(xiàn)粘液樣便和血便，未出現(xiàn)大鼠死亡。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠體重變化情況:與C組相比，R組大鼠體重明顯增長緩慢(Ρ〈0.05);與R組相比，各藥物組大鼠體重增長較快，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差別。正常組的細(xì)胞凋亡指數(shù)約為(3.50±1.38)%，而照射組的細(xì)胞凋亡指數(shù)達(dá)(17.98±2.54)%，主要發(fā)生在腸黏膜上皮細(xì)胞，固有層細(xì)胞及黏膜下層細(xì)胞，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.000) ；Τ1, Τ2，NAC組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(9.15 + 1.70) %,(10.83±1.63) %, (8.79±1.77) %，與照射組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =
0.000)。其中Tl組和Τ2組差異較明顯(P = 0.045)，說明蜂膠總黃酮在抑制腸黏膜細(xì)胞凋亡方面有一定的劑量依賴性。
[0013]3病理組織形態(tài)學(xué)改變:光鏡下觀察C組腸黏膜厚度均勻，絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，隱窩與腺體結(jié)構(gòu)清晰，粘膜下無血管擴(kuò)張淤血；R組腸黏膜絨毛大量脫落，黏膜和腺體明顯損傷，空泡樣改變，腸隱窩失去正常結(jié)構(gòu)，黏膜下層可見明顯血管擴(kuò)張淤血；總黃酮組和NAC組病理損傷明顯減輕，腸黏膜絨毛輕度水腫，上皮細(xì)胞稍脫落，腺體和隱窩結(jié)構(gòu)基本正常，黏膜下輕度血管擴(kuò)張。與C組(0.55±0.20)相比，R組(3.89±0.53)病理損傷明顯加重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);與R組相比，Tl組(2.11±0.57)，T2組(2.34±0.32)，NAC組(2.06±0.64)腸黏膜病理損傷明顯減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。電鏡下觀察正常組線粒體無腫脹，無空泡，無嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)未見異常，細(xì)胞核正常，核膜，染色質(zhì)無異常；照射組腸微絨毛明顯變短，排列紊亂，線粒體腫脹，空泡，嵴斷裂；總黃酮組和NAC組微絨毛損傷較照射組明顯減輕，結(jié)構(gòu)較完整，排列較整齊，線粒體稍腫脹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)蜂膠總黃酮可明顯減輕小腸黏膜病理損傷，絨毛上皮細(xì)胞脫落明顯減少，隱窩及腺體結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體及微絨毛損壞亦明顯減輕。說明蜂膠總黃酮可明顯減輕大鼠照射后腸損傷癥狀，提聞大鼠放射損傷后存活率。
[0014]4血漿二胺氧化酶(DAO)測定:無菌狀態(tài)下心臟穿刺取血5ml，加入肝素抗凝，40C 2500r/min離心8?12min，取上層血漿2ml置與一80°C冰箱保存待用，測定血漿DAO活性。測定結(jié)果:與正常對照組相比，照射組的DAO含量明顯升高(P〈0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)照射后腸黏膜屏障較正常對照組明顯破壞；與照射組相比，總黃酮組和NAC組DAO含量明顯降低(P〈0.01)，其中總黃酮高低劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。與正常組相比，照射組小腸組織中的NO，SOD及MDA的活性或含量均有明顯改變，照射后NO及MDA含量顯著升高(P〈0.01)，SOD活性顯著降低(P〈0.01)。與照射組相比，總黃酮組和NAC組NO含量，MDA含量有明顯降低(P〈0.05)，SOD活性明顯升高(P〈0.01)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中總黃酮Tl組在提高SOD活性，清除MDA方面明顯強(qiáng)于T2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。血漿二胺氧化酶(DAO)是腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞質(zhì)酶，輻射導(dǎo)致腸黏膜損傷時，絨毛上皮細(xì)胞破壞并釋放DAO入血，血漿二胺氧化酶活性增高，是早期腸黏膜損傷及修復(fù)程度的較敏感的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，總黃酮對腸黏膜的放射性損傷具有修復(fù)和保護(hù)作用。
[0015]5小腸組織勻漿一氧化氮(NO)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)的測定:取末端回腸組織用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，勻衆(zhòng)，4000r/min離心12 — 15min,取上清液2ml在4°C冰箱中保存待用，分別測定NO，SOD及MDA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明蜂膠總黃酮可以有效抑制小腸放射損傷后DAO和NO的表達(dá)，從而從微觀上證明其可明顯抑制腸道上皮細(xì)胞損傷，降低腸黏膜通透性，從而有效保護(hù)腸黏膜屏障功能，防止腸道細(xì)菌移位感染。蜂膠總黃酮可提高SOD活性，減少氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制MDA含量表達(dá)，降低輻射損傷所致的腸黏膜細(xì)胞凋亡，明顯減輕腸道組織輻射損傷，從而可在一定程度保護(hù)射線引起的腸黏膜損傷和屏障功能破壞，減輕放療副作用，提高盆腹腔放療耐受性。
[0016]實(shí)例一
[0017]蜂膠總黃酮可保護(hù)射線引起的腸黏膜損傷和屏障功能破壞，減輕放療副作用，提高盆腹腔放療耐受性。
【權(quán)利要求】
1.蜂膠總黃酮在治療急性放射性腸損傷中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂膠總黃酮在治療急性放射性腸損傷中的應(yīng)用，其特征在于:為防止腹部腫瘤放射治療時所造成的腸管損傷，可同時應(yīng)用蜂膠總黃酮；用量為200mg/kg/d ;給藥方式為口服。
【文檔編號】A61K35/644GK104288183SQ201410594085
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】范紅斌, 龐慶豐, 杜斌, 陳俊良, 劉靖, 李承強(qiáng), 楊欣穎, 許迪 申請人:江南大學(xué)