小牛脾提取物及在原發(fā)免疫性血小板減少癥治療中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種小牛脾提取物在原發(fā)免疫性血小板減少癥治療中的用途。所述小牛脾提取物的制備工藝為包括勻漿液的制備，凍融，組合酶協(xié)同作用，pH調(diào)節(jié)和膜過濾，以及無菌過濾和灌裝。該校牛脾提取物中多肽和核糖提取率大大增加并且糖肽比固定在80-87之間。小牛脾提取物能夠治療ITP的活性經(jīng)過血小板計(jì)數(shù)以及各個(gè)免疫器官中CD4+CD25+T比例進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示本發(fā)明能夠顯著提高血小板水平達(dá)到原工藝的50%，并改善造血功能，無毒副作用。
【專利說明】小牛脾提取物及在原發(fā)免疫性血小板減少癥治療中的用途
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明涉及一種新工藝提取的小牛脾提取物，同時(shí)還提供了其在原發(fā)免疫性血小板減 少癥（ITP)治療中的用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0002] 技術(shù)背景： 目前小牛脾提取物已廣泛應(yīng)用于腫瘤的輔助治療以及免疫系統(tǒng)紊亂所引起的相關(guān)疾 病如白癜風(fēng)、蕁麻疹和過敏反應(yīng)等。除此之外，臨床上小牛脾提取物還作為原發(fā)免疫性血小 板減少癥（ITP)治療及輔助治療劑。
[0003] 從生物組織中提取多肽、核糖和轉(zhuǎn)移因子等一般采用物理提取法即凍融法、勻漿 法和膜過濾法等，如中國發(fā)明專利（CN201010257796. 0)所公開的方法。現(xiàn)有小牛脾提取物 生產(chǎn)工藝提取率低，直接影響產(chǎn)品的收率，而且產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。
[0004] 本發(fā)明采用物理方法結(jié)合組合酶協(xié)同酶解法提取小牛脾中小分子量的核糖及多 肽，并將核糖和多肽比值固定在80-87( μ g/mg)，在該糖肽比下產(chǎn)品治療ITP的活性較原工 藝提升了近50%，能夠在減少病患負(fù)擔(dān)的同時(shí)減輕其痛苦。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種新工藝提取的小牛脾提取物，提取物的多肽及核糖含量大大提高。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述小牛脾提取物在制備治療原發(fā)免疫性血小板減少癥方 面藥物中的用途。
[0007] 本發(fā)明所述的一種小牛脾提取物，是由如下方法制備的； 取乳牛的脾臟，用〇. 9%氯化鈉溶液清洗，加入1-1. 2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1~5 次，膠體磨粒度為2?8 μ m ;將勻漿液深度冷凍后40°C解凍，反復(fù)5-10次；按物料重量的 0. 3-1. 4%加入組合酶，攪拌均勻；將勻漿液取出放入90°C以下水浴中升溫至75°C ~80°C;將 勻漿液在75°C?80°C保溫2-2. 5h后迅速降溫至KTC?20°C ;將上述溶液離心，離心速度 為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?KTC以下，離心15-30分鐘，收集上清液；調(diào)節(jié)提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道爾頓的膜超濾，即得小牛脾提取物； 其中，所述的組合蛋白酶為木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B和5'-磷酸二酯酶混合物，所述 組合酶的質(zhì)量比為：木瓜蛋白酶〇. 5?1. 2份，組織蛋白酶BI. 5?2. 5份，5' -磷酸二酯酶 2. 5?4份。
[0008] 所述的小牛脾提取物在制備升高血小板的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 所述的小牛脾提取物在制備改善造血功能的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明：小牛脾提取物可以治療原發(fā)免疫性血小板減少癥并且其 活性較專利（CN201010257796. 0)所公開的方法增加了近50%，并且進(jìn)過小牛脾提取物治 療，各個(gè)淋巴器官中⑶4+⑶25+T細(xì)胞所占比例與正常組相近。
[0011] 血小板計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定（⑶4，⑶8，⑶4/⑶8)是評(píng)價(jià)原發(fā)免疫性血小 板減少癥（ITP)的常規(guī)手段，因此發(fā)明采用血小板計(jì)數(shù)以及T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定來評(píng)價(jià) 小牛脾提取物對(duì)ITP的療效。
[0012] 發(fā)明的有益效果在于： 利用復(fù)合酶的協(xié)同作用對(duì)小牛脾提取物中間品處理，能夠大大增加小牛脾提取物中多 肽和核糖的收率，提取物中多肽占有10-20重量份、核糖占有0. 8-1. 7重量份；與此同時(shí)在 本發(fā)明提供的工藝參數(shù)下得到的提取物其糖肽比固定在80-87 ( μ g/mg)，在該糖肽比下小 牛脾提取物治療原發(fā)性血小板減少癥的活性增加了近50%。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。其中對(duì)照例1再現(xiàn)專利CN201010257796. 0 的制備方法。
[0014] 實(shí)施例1 : 取乳牛的脾臟（出生24小時(shí)以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小 時(shí)以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1次，膠體磨粒度 為2?8μπι ;將勻漿液深度冷凍后40°C解凍，反復(fù)5次；加入0. 17g木瓜蛋白酶，0. 5g 組織蛋白酶B，0. 83g 5'-磷酸二酯酶，攪拌均勻；將勻漿液取出放入90°C以下水浴中升溫 至75°C °C ;將勻漿液在75°C保溫2. 5h后迅速降溫至20°C ;將上述溶液離心，離心速度為 3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?KTC以下，離心15分鐘，收集上清液；調(diào)節(jié)提取物pH至 7. 0-7. 2 ;用5000道爾頓的膜超濾；0. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0015] 實(shí)施例2: 取乳牛的脾臟（出生24小時(shí)以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時(shí) 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1.2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿5次，膠體磨粒 度為2?8μπι ;將勻漿液深度冷凍后40°C解凍，反復(fù)10次；I. 17g木瓜蛋白酶，2.43g 組織蛋白酶B，3. Sg 5'-磷酸二酯酶，攪拌均勻；將勻漿液取出放入90°C以下水浴中升 溫至75°C ;將勻漿液在75°C保溫2h后迅速降溫至20°C ;將上述溶液離心，離心速度為 3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?KTC以下，離心15-30分鐘，收集上清液；調(diào)節(jié)提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道爾頓的膜超濾；0. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0016] 實(shí)施例3: 取乳牛的脾臟（出生24小時(shí)以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時(shí) 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1-1.2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿3次，膠體磨粒 度為2?8μπι ;將勻漿液深度冷凍后40°C解凍，反復(fù)10次；0. 78g木瓜蛋白酶，2. 34g 組織蛋白酶B，3. 9g 5'-磷酸二酯酶，攪拌均勻；將勻漿液取出放入90°C以下水浴中升溫 至80°C ;將勻漿液在80°C保溫2. 5h后迅速降溫至HTC ;將上述溶液離心，離心速度為 3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?KTC以下，離心15-30分鐘，收集上清液；調(diào)節(jié)提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道爾頓的膜超濾；0. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0017] 對(duì)照例1 : 領(lǐng)取乳牛的脾臟（出生24小時(shí)以內(nèi)）500g，除去掉結(jié)締組織和脂肪，用0.9%氯化 鈉溶液清洗，加入3倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，一般進(jìn)行3次，膠體磨粒度為4μπι ;將 勻漿液放入冰庫-20°C深凍，達(dá)到完全凍結(jié)后，取出放入30°C以下水浴中解凍，完全融化 后繼續(xù)放入冰庫，如此反復(fù)進(jìn)行三次；將凍融后的藥液70°C保溫35分鐘，速降溫至15°C ; 將上述溶液離心，離心速度為3500轉(zhuǎn)/分，溫度5°C以下，離心20分鐘，收集上清液； 分別用80000道爾頓、10000道爾頓、7000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過濾分 裝，即得注射液。
[0018] 對(duì)照例2 : 領(lǐng)取乳牛的脾臟（出生24小時(shí)以內(nèi)）500g，除去掉結(jié)締組織和脂肪，用0.9%氯化 鈉溶液清洗，加入4倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，一般進(jìn)行5次，膠體磨粒度為3μπι ;將勻 漿液放入冰庫30°C深凍，達(dá)到完全凍結(jié)后，取出放入40°C以下水浴中解凍，完全融化后繼 續(xù)放入冰庫，如此反復(fù)進(jìn)行三次；將凍融后的藥液80°C保溫40分鐘，速降溫至20°C ;將上 述溶液離心，離心速度為3000轉(zhuǎn)/分，溫度4°C以下，離心30分鐘，收集上清液；分別 用60000道爾頓、9000道爾頓、6000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即 得提取物。以上實(shí)施例得到的提取物中各成分含量以及核酸純度(核酸純度由OD26tZOD 28tl表 示)由表5體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B和5' -磷酸二酯酶組合酶較優(yōu)的 條件占勻漿液的質(zhì)量比為：木瓜蛋白酶0.5?1.2份，組織蛋白酶BI. 5?2. 5份，5'-磷 酸二酯酶2. 5?4份。
[0019] 表5不同解法各種提取方法的提取結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種小牛脾提取物，是由如下方法制備的； 取乳牛的脾臟，用0.9%氯化鈉溶液清洗，加入1-1. 2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1~5 次，膠體磨粒度為2?8 y m ;將勻漿液深度冷凍后40°C解凍，反復(fù)5-10次；按物料重量的 0. 3-1. 4%加入組合酶，攪拌均勻；將勻漿液取出放入90°C以下水浴中升溫至75°C ~80°C;將 勻漿液在75°C?80°C保溫2-2. 5h后迅速降溫至10°C?20°C ;將上述溶液離心，離心速度 為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?10°C以下，離心15-30分鐘，收集上清液；調(diào)節(jié)提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道爾頓的膜超濾，即得小牛脾提取物； 其中所述的組合蛋白酶為木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B和5'-磷酸二酯酶混合物，所述 組合酶的質(zhì)量比為：木瓜蛋白酶〇. 5?1. 2份，組織蛋白酶B1. 5?2. 5份，5'-磷酸二酯酶 2. 5?4份。
2. 如權(quán)利要求1所述的小牛脾提取物在制備升高血小板的藥物中的用途。
3. 如權(quán)利要求1所述的小牛脾提取物在制備改善造血功能的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P7/06GK104352520SQ201410614630
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】滕利榮, 王迪, 賈東旭, 孟慶繁, 逯家輝, 周毓麟, 滕樂生, 謝晶, 程瑛琨, 王貞佐, 蔡廣勝, 盧文倩 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)