抗程序性死亡配體1(pd-l1)的人單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供以高親和力特異性結(jié)合PD-L1的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子，用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和方法。還提供了包含本發(fā)明的抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)PD-L1的方法，以及使用抗-PD-L1抗體治療包括癌癥和傳染病在內(nèi)的各種疾病的方法。
【專利說(shuō)明】抗程序性死亡配體1 (PD-L1)的人單克隆抗體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年06月30日和發(fā)明名稱為"抗程序性死亡配體I(H)-Ll) 的人單克隆抗體"的200680028238. 9號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉參考
[0003] 本申請(qǐng)要求2005年7月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/696, 426的權(quán)利；該 申請(qǐng)全文引入本文作為參考。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 程序性死亡I (PD-I)是CD28受體家族的成員，包括CD28、CTLA-4、ICOS、ro-1和 BTLA。該家族的最初成員CD28和ICOS通過(guò)對(duì)添加單克隆抗體后增強(qiáng)的T細(xì)胞增殖的功能 效果而發(fā)現(xiàn)（Hutloff 等（1999) Nature 397 :263-266 ;Hansen 等（1980) ImmunogenicslO : 247-260)。已經(jīng)鑒定了 H)-l的兩種細(xì)胞表面糖蛋白配體，PD-Ll和TO-L2,已經(jīng)表明它們 在與I3D-I結(jié)合后下調(diào)T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌（Freeman等（2000) J Exp Med 192: 1027-34 ;Latchman 等（2001)Nat Immunol 2:261-8 ;Carter 等（2002)Eur J Immunol 32 :634-43 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。 PD-L1(B7-H1)和 H)-L2(B7-DC)都是可與H)-l結(jié)合、但是不與其他⑶28家族成員結(jié)合的B7同源物（Blank 等（2004))。也已經(jīng)顯示通過(guò)IFN-Y刺激上調(diào)細(xì)胞表面上H)-L1的表達(dá)。
[0006] PD-Ll的表達(dá)已經(jīng)在幾種鼠和人類癌癥中發(fā)現(xiàn)，包括人肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌和 各種骨髓瘤（Iwai 等（2002)PNAS 99 :12293-7 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11 : 2947-53)。已經(jīng)提示H)-L1通過(guò)提高抗原特異性T細(xì)胞克隆的細(xì)胞凋亡而在腫瘤免疫中 起作用（Dong等（2002)Nat Med 8:793-800)。也已經(jīng)提示I3D-Ll可能與腸粘膜炎癥有關(guān)， 并且F1D-Ll的抑制防止了與結(jié)腸炎有關(guān)的萎縮病（wasting disease) (Kanai等（2003) J Tmmun〇1 171 :4156-63)〇
[0007] 發(fā)明概沭
[0008] 本發(fā)明提供與ro-Ll結(jié)合并且表現(xiàn)出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是 人單克隆抗體。這些特性包括與人ro-Li高親和力結(jié)合。另外，已經(jīng)顯示本發(fā)明的抗體在 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中提高T細(xì)胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體 表現(xiàn)出至少一種以下性質(zhì)：
[0010] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0011] (b)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0012] (c)在MLR試驗(yàn)中提高干擾素-Y產(chǎn)生；
[0013] (d)在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌；
[0014] (e)刺激抗體應(yīng)答；或
[0015] (f)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞的作用。
[0016] 優(yōu)選地，該抗體為人抗體，但是在替代實(shí)施方案中，該抗體也可以是，例如，鼠抗 體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0017] 在特定實(shí)施方案中，該抗體以5X KT8M或更低的Kd與人ro-Ll結(jié)合，以IXKT8M 或更低的Kd與人ro-Ll結(jié)合，以5X KT9M或更低的Kd與人ro-Ll結(jié)合，以5X KT9M或更低 的Kd與人PD-Ll結(jié)合，或以I X KT8M至I X KTkiM之間的Kd與人PD-Ll結(jié)合。
[0018] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中 該抗體與參比抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合F 1D-Ll,所述參比抗體包括：
[0019] (a)包含選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變 區(qū)；和
[0020] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人 輕鏈可變區(qū)。
[0021] 在各種實(shí)施方案中，所述參比抗體包括：
[0022] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0023] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0024] 或所述參比抗體包括：
[0025] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0026] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0027] 或所述參比抗體包括：
[0028] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0029] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0030] 或所述參比抗體包括：
[0031] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0032] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0033] 或所述參比抗體包括：
[0034] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0035] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0036] 或所述參比抗體包括：
[0037] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0038] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0039] 或所述參比抗體包括：
[0040] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0041] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0042] 或所述參比抗體包括：
[0043] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0044] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0045] 或所述參比抗體包括：
[0046] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0047] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
[0048] 或所述參比抗體包括：
[0049] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0050] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0051] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自 或源自人％ 1-18基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供 一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人Vh 1-69基因的重鏈可變 區(qū)，其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原 結(jié)合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人V h 1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Ll特 異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源 自人V h 3-9基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Ll特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種 分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人V k L6基因的輕鏈可變區(qū)，其中 該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含產(chǎn)自或源自人V k L15基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。 本發(fā)明甚至進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源 自人V k A27基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。本發(fā)明甚至進(jìn)一步提供 一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人V k L18基因的輕鏈 可變區(qū)，其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0052] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合 部分或片段，其包含：
[0053] (a)人Vh 1-18基因的重鏈可變區(qū)；和
[0054] (b)人Vk L6的輕鏈可變區(qū)；
[0055] 其中該抗體與ro-Ll特異性結(jié)合。
[0056] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含：
[0057] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區(qū)；和
[0058] (b)人Vk L6的輕鏈可變區(qū)；
[0059] 其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0060] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含：
[0061] (a)人Vh 1-3基因的重鏈可變區(qū)；和
[0062] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區(qū)；
[0063] 其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0064] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含：
[0065] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區(qū)；和
[0066] (b)人Vk A27的輕鏈可變區(qū)；
[0067] 其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0068] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含：
[0069] (a)人Vh 3-9基因的重鏈可變區(qū)；和
[0070] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區(qū)；
[0071] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0072] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分 或片段，其包含：
[0073] (a)人Vh 3-9基因的重鏈可變區(qū)；和
[0074] (b)人Vk L18的輕鏈可變區(qū)；
[0075] 其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0076] 在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或片段，其包 括：
[0077] 包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)；和包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的輕 鏈可變區(qū)，其中：
[0078] (a)重鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0079] (b)輕鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0080] (C)該抗體與人PD-Ll特異性結(jié)合。
[0081] 優(yōu)選地，重鏈可變區(qū) CDR2 序列包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、 39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優(yōu) 選地，重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的 氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
[0082] 在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈 可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中：
[0083] (a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0084] (b)輕鏈可變區(qū)包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0085] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合。
[0086] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體還包括至少一種以下的性質(zhì)：
[0087] (a)該抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0088] (b)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高干擾素-Y產(chǎn)生；或
[0089] (c)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌。
[0090] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包 括：
[0091] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0092] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0093] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0094] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0095] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0096] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0097] 其中該抗體特異性結(jié)合ro-Ll。
[0098] 一種優(yōu)選的組合包括：
[0099] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0100] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0101] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0102] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0103] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0104] (f)包含SEQ ID NO :71的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0105] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0106] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0107] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0108] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0109] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0110] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0111] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0112] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0113] (a)包含SEQ ID NO :23的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0114] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0115] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0116] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0117] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0118] (f)包含SEQ ID NO :73的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0119] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0120] (a)包含SEQ ID NO :24的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0121] (b)包含SEQ ID NO :34的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0122] (c)包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0123] (d)包含SEQ ID NO :54的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0124] (e)包含SEQ ID NO :64的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0125] (f)包含SEQ ID NO :74的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0126] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0127] (a)包含SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0128] (b)包含SEQ ID NO :35的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0129] (c)包含SEQ ID NO :45的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0130] (d)包含SEQ ID NO :55的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0131] (e)包含SEQ ID NO :65的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0132] (f)包含SEQ ID NO :75的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0133] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0134] (a)包含SEQ ID NO :26的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0135] (b)包含SEQ ID NO :36的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0136] (c)包含SEQ ID NO :46的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0137] (d)包含SEQ ID NO :56的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0138] (e)包含SEQ ID NO :66的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0139] (f)包含SEQ ID NO :76的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0140] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0141] (a)包含SEQ ID NO :27的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0142] (b)包含SEQ ID NO :37的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0143] (c)包含SEQ ID NO :47的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0144] (d)包含SEQ ID NO :57的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0145] (e)包含SEQ ID NO :67的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0146] (f)包含SEQ ID NO :77的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0147] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0148] (a)包含SEQ ID NO :28的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0149] (b)包含SEQ ID NO :38的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0150] (c)包含SEQ ID NO :48的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0151] (d)包含SEQ ID NO :58的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0152] (e)包含SEQ ID NO :68的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0153] (f)包含SEQ ID NO :78的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0154] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0155] (a)包含SEQ ID NO :29的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0156] (b)包含SEQ ID NO :39的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0157] (c)包含SEQ ID NO :49的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0158] (d)包含SEQ ID NO :59的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0159] (e)包含SEQ ID NO :69的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0160] (f)包含SEQ ID NO :79的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0161] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0162] (a)包含SEQ ID NO :30的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0163] (b)包含SEQ ID NO :40的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0164] (c)包含SEQ ID NO :50的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0165] (d)包含SEQ ID NO :60的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0166] (e)包含SEQ ID NO :70的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0167] (f)包含SEQ ID NO :80的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0168] 其他本發(fā)明優(yōu)選的抗體或其抗原結(jié)合部分包括：
[0169] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； 和
[0170] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)；
[0171] 其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0172] -種優(yōu)選的組合包括：
[0173] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0174] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0175] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0176] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0177] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0178] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0179] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0180] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0181] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0182] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0183] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0184] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0185] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0186] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0187] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0188] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0189] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0190] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0191] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0192] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0193] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0194] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0195] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0196] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0197] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0198] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0199] 另一種優(yōu)選的組合包括：
[0200] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0201] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0202] 在本發(fā)明的另一方面，提供了與上述任意抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ro-Ll的抗體或其抗原結(jié) 合部分。
[0203] 本發(fā)明的抗體可以是，例如，如IgGl或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體?；蛘撸@些抗體 可以是抗體片段，如Fab或Fab' 2片段，或單鏈抗體。
[0204] 本發(fā)明也提供一種免疫偶聯(lián)物，其包含與諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素等治療劑 連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也提供一種雙特異性分子，其包含與第二 功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原 結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
[0205] 還提供包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子和藥 學(xué)上可接受的載體的組合物。
[0206] 本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，以及包含這些核 酸的表達(dá)載體，和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白 重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的 雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
[0207] 在另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給該受試者 施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中的免疫應(yīng)答得到調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，本發(fā)明 的抗體增強(qiáng)、刺激或提高受試者中的免疫應(yīng)答。
[0208] 在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括給該受 試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方 法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體組合）。例 如，在抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。
[0209] 在另一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施 用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。本 發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與本發(fā)明 的抗-PD-Ll抗體組合）。例如，在治療傳染病的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類 抗-PD-Ll抗體。
[0210] 另外，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括給該受試者 施用：（i)抗原；和（ii)抗-PD-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分，使得所述受試者中對(duì)抗原的免 疫應(yīng)答得到加強(qiáng)。所述抗原可以是，例如，腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或來(lái)自病原體的抗 原。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與 本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體組合）。例如，在增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法中可以使 用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。
[0211] 本發(fā)明也提供基于本文提供的抗-PD-Ll抗體的序列制備"第二代"抗-PD-Ll抗 體的方法。例如，本發(fā)明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0212] (a)提供：（i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和選自3￡010勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列 ；或（^)輕鏈可 變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、 選自5￡010勵(lì)：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和選自5￡010勵(lì) ：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0213] (b)改變至少一種可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈 可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和
[0214] (C)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
[0215] 特別地，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng)：
[0216] 1. 一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體特異性結(jié)合人 ro-Li，并且其中該抗體表現(xiàn)出至少一種以下性質(zhì)：
[0217] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0218] (b)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0219] (c)在MLR試驗(yàn)中提高干擾素1產(chǎn)生；或
[0220] (d)在MLR試驗(yàn)中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
[0221] 2.如第1項(xiàng)的抗體，其為IgGl、IgG2或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體。
[0222] 3.如第1項(xiàng)的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。
[0223] 4.如第1項(xiàng)的抗體，其中所述抗體以5X KT9M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合。
[0224] 5.如第1項(xiàng)的抗體，其中所述抗體以2X KT9M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合。
[0225] 6. -種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合F1D-Ll,所述參比抗體包括：
[0226] (a)包含選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變 區(qū)；和
[0227] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人 輕鏈可變區(qū)。
[0228] 7.如第6項(xiàng)的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列，人 輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
[0229] 8.如第6項(xiàng)的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列，人 輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列。
[0230] 9.如第6項(xiàng)的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，人 輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
[0231] 10. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或源自AVh 1-18基因 的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。
[0232] 11. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或源自AVh 1-69基因 的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0233] 12. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或源自AVh 1-3基因 的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0234] 13. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或源自人Vk L6基因的 輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0235] 14. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或源自AVk L15基因 的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0236] 15. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括：
[0237] (a)人Vh 1-18基因的重鏈可變區(qū)；和
[0238] (b)人Vk L6的輕鏈可變區(qū)；
[0239] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0240] 16. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括：
[0241] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區(qū)；和
[0242] (b)人Vk L6的輕鏈可變區(qū)；
[0243] 其中該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。
[0244] 17. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括：
[0245] (a)人Vh 1-3基因的重鏈可變區(qū)；和
[0246] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區(qū)；
[0247] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0248] 18. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括包含⑶R1XDR2和⑶R3序 列的重鏈可變區(qū)；和包含⑶RU⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)；其中：
[0249] (a)重鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0250] (b)輕鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0251] (c)該抗體與人PD-Ll特異性結(jié)合。
[0252] 19.如第18項(xiàng)的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO :31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶R2 序列包含選自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾 的氨基酸序列。
[0253] 20.如第19項(xiàng)的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、 24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶Rl 序列包含選自SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾 的氨基酸序列。
[0254] 21. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)， 其中：
[0255] (a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0256] (b)輕鏈可變區(qū)包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0257] 該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合。
[0258] 22.如第21項(xiàng)的抗體，其中該抗體進(jìn)一步包括一種或多種選自以下的性質(zhì)：
[0259] (a)該抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0260] (b)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高干擾素1產(chǎn)生；和
[0261] (c)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌。
[0262] 23. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括：
[0263] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0264] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0265] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0266] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0267] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0268] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0269] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0270] 24.如第23項(xiàng)的抗體，其包括：
[0271] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0272] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0273] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0274] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0275] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0276] (f)包含SEQ ID NO :71的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0277] 25.如第23項(xiàng)的抗體，其包括：
[0278] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0279] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0280] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0281] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0282] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0283] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0284] 26.如第23項(xiàng)的抗體，其包括：
[0285] (a)包含SEQ ID NO :23的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0286] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0287] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0288] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0289] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0290] (f)包含SEQ ID NO :73的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0291] 27. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括：
[0292] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； 和
[0293] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)；
[0294] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結(jié)合。
[0295] 28.如第27項(xiàng)的抗體，其包括：
[0296] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0297] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0298] 29.如第27項(xiàng)的抗體，其包括：
[0299] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0300] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0301] 30.如第27項(xiàng)的抗體，其包括：
[0302] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
[0303] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0304] 31. -種組合物，其含有如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可 接受的載體。
[0305] 32. -種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié) 合部分。
[0306] 33. -種組合物，其含有如第32項(xiàng)的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0307] 34.如第32項(xiàng)的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。
[0308] 35. -種組合物，其含有如第34項(xiàng)的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0309] 36.如第32項(xiàng)的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。
[0310] 37. -種組合物，其含有如第34項(xiàng)的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0311] 38. -種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的如第1-30任一項(xiàng)的抗體或 其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
[0312] 39. -種組合物，其含有如第38項(xiàng)的雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體。
[0313] 40. -種分離的核酸分子，其編碼如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0314] 41. 一種表達(dá)載體，其包含第40項(xiàng)的核酸分子。
[0315] 42. -種宿主細(xì)胞，其包含第41項(xiàng)的表達(dá)載體。
[0316] 43. -種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)如 第1-30任一項(xiàng)的抗體。
[0317] 44.由第43項(xiàng)的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。
[0318] 45. -種調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給該受試者施用如第1-30任一項(xiàng) 的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中的免疫應(yīng)答得到調(diào)節(jié)。
[0319] 46. -種抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括給該受試者施用治療有效量 的抗-PD-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0320] 47.如第46項(xiàng)的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
[0321] 48.如第46項(xiàng)的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
[0322] 49.如第46項(xiàng)的方法，其中所述抗體是完全人類抗體。
[0323] 50.如第46項(xiàng)的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是選自黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、 結(jié)腸癌和肺癌的癌的腫瘤細(xì)胞。
[0324] 51.如第46項(xiàng)的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是選自以下癌的腫瘤細(xì)胞：骨癌、胰腺 癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸 癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴 瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、 陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、急性成淋巴 細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿 管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦 干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘發(fā)的癌 癥，包括石棉誘發(fā)的癌癥，以及所述癌癥的組合。
[0325] 52. -種抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括給該受試者施用有效抑制腫 瘤生長(zhǎng)的量的如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0326] 53. -種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用如第1-30任一項(xiàng)的 抗體或其抗原結(jié)合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。
[0327] 54.如第53項(xiàng)的方法，其中所述傳染病選自：HIV，流行性感冒，皰疹，賈第蟲，瘧 疾，利什曼原蟲，以下病毒引起的病原體感染：肝炎病毒（甲、乙、丙）、皰疹病毒（例如VZV、 HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒）、腺病毒、流感病毒、蟲媒病毒、?？刹《尽⒈遣《?、柯 薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、 細(xì)小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬 病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒，以下細(xì)菌引起的病原體感染：衣原體、立克次氏體菌、 分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏桿菌、變形菌、雷氏 菌、假單胞菌、軍團(tuán)桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風(fēng)菌、肉毒桿菌、炭疽桿 菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體、和萊姆病細(xì)菌，以下真菌引起的病原體感染：假絲酵母（白假絲 酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等）、新型隱球菌、曲霉（煙曲霉、黑曲 霉等）、毛霉屬（毛霉、犁頭霉、根霉）、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢 子菌和夾膜組織胞漿菌，和以下寄生蟲引起的病原體感染：溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛 蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴屬的種、蘭伯賈第蟲、隱孢子蟲屬的種、卡氏肺囊蟲、間日 瘧原蟲、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日?qǐng)A線蟲。
[0328] 55. -種增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括給該受試者施用：（i)抗 原；和（ii)如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得所述受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng) 答得到加強(qiáng)。
[0329] 56.如第55項(xiàng)的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或來(lái)自病原 體的抗原。
[0330] 57. -種治療或預(yù)防受試者中的炎性疾病的方法，包括給該受試者施用如第1-30 任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得所述受試者的炎性疾病得到治療。
[0331] 58.如第57項(xiàng)的方法，其中所述炎性疾病是扁平苔蘚（LP)。
[0332] 59. -種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0333] (a)提供：⑴重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和選自3￡010勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列 ；或（^)輕鏈可 變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、 選自5￡010勵(lì)：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和選自5￡010勵(lì) ：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0334] (b)改變至少一種可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述可變區(qū)抗體序 列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列； 和
[0335] (C)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
[0336] 60.抗I3D-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
[0337] 61.抗I3D-Ll抗體或其抗原結(jié)合部分在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途。
[0338] 62.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
[0339] 63.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物 中的用途。
[0340] 64.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分應(yīng)用于治療傳染病的方法。
[0341] 65.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備治療傳染病的藥物中的用 途。
[0342] 66.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分應(yīng)用于治療炎性疾病的方法。
[0343] 67.如第1-30任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備治療炎性疾病的藥物中的 用途。
[0344] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)下面的詳述和實(shí)施例將是顯而易見(jiàn)的，該詳述和實(shí) 施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank項(xiàng)、專利和公布的 專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0345] 圖IA顯示3G10人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :81)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:1)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:21)、CDR2(SEQ ID N0:31)和 CDR3(SEQ ID NO :41)區(qū)，并指出了 V、D和J的種系來(lái)源。
[0346] 圖IB顯示3G10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :91)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:11)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:51)、CDR2(SEQ ID N0:61)和 CDR3(SEQ ID NO :71)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0347] 圖2A顯示12A4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :82)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:2)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:22)、CDR2(SEQ ID N0:32)和 CDR3(SEQ ID NO :42)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0348] 圖2B顯示12A4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :92)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:12)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:52)、CDR2(SEQ ID N0:62)和 CDR3(SEQ ID NO :72)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0349] 圖3A顯示10A5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :83)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:3)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:33)和 CDR3(SEQ ID NO :43)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0350] 圖3B顯示10A5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :93)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:13)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:53)、CDR2(SEQ ID N0:63)和 CDR3(SEQ ID NO :73)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0351] 圖4A顯示5F8人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :84)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:4)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:24)、CDR2(SEQ ID N0:34)和 CDR3(SEQ ID NO :44)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0352] 圖4B顯示5F8人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :94)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:14)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:54)、CDR2(SEQ ID N0:64)和 CDR3(SEQ ID NO :74)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0353] 圖5A顯示10H10人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :85)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:5)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:25)、CDR2(SEQ ID 勵(lì)：35和〇?3(5￡0 ID NO :45)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0354] 圖5B顯示10H10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :95)和氨基 酸序列（5￡0 10勵(lì)：15)。勾畫出了001?1(5￡0 10勵(lì)：55)、〇)1?2(5￡0 10勵(lì)：65)和〇)1?3(5￡0 ID NO :75)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0355] 圖6A顯示1B12人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :86)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:6)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:36)和 CDR3(SEQ ID NO :46)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0356] 圖6B顯示1B12人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :96)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:16)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:56)、CDR2(SEQ ID N0:66)和 CDR3(SEQ ID NO :76)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0357] 圖7A顯示7H1人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :87)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:7)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:27)、CDR2(SEQ ID N0:37)和 CDR3(SEQ ID NO :47)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0358] 圖7B顯示7H1人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :97)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:17)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:57)、CDR2(SEQ ID N0:67)和 CDR3(SEQ ID NO :77)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0359] 圖8A顯示11E6人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :88)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:8)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:28)、CDR2(SEQ ID N0:38)和 CDR3(SEQ ID NO :48)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0360] 圖8B顯示11E6人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :98)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:18)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:58)、CDR2(SEQ ID N0:68)和 CDR3(SEQ ID NO :78)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0361] 圖9A顯示12B7人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :89)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:9)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:29)、CDR2(SEQ ID N0:39)和 CDR3(SEQ ID NO :49)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0362] 圖9B顯示12B7人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :99)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:19)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:59)、CDR2(SEQ ID N0:69)和 CDR3(SEQ ID NO :79)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0363] 圖10A顯示13G4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO :90)和氨基 酸序列（5￡0 10勵(lì)：10)。勾畫出了001?1(5￡0 10勵(lì)：30)、〇)1?2(5￡0 10勵(lì)：40)和〇)1?3(5￡0 ID NO :50)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0364] 圖10B顯示13G4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO : 100)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:20)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:60)、CDR2(SEQ ID N0:70)和 CDR3(SEQ ID NO :80)區(qū)，并指出了 V和J的種系來(lái)源。
[0365] 圖11顯示13G10的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :1)與人種系Vh 1-18氨 基酸序列（SEQ ID N0:101)的比對(duì)。
[0366] 圖12顯示12A4的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :2)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH6b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:110。
[0367] 圖13顯示10A5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :3)與人種系Vh 1-3氨基 酸序列（SEQ ID N0:103)的比對(duì)。JH4b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:111。
[0368] 圖14顯示5F8的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :4)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH4b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:111。
[0369] 圖15顯示10H10的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :5)與人種系Vh 3-9氨基 酸序列（SEQ ID N0:104)的比對(duì)。JH4b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:111。
[0370] 圖16顯示1B12的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :6)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH6b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:110。
[0371] 圖17顯示7H1的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :7)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH6b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:110。
[0372] 圖18顯示11E6的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :8)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH6c種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:112。
[0373] 圖19顯示12B7的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :9)與人種系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比對(duì)。JH6b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:110。
[0374] 圖20顯示13G4的重鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :10)與人種系Vh 3-9氨基 酸序列（SEQ ID N0:104)的比對(duì)。JH4b種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:113。
[0375] 圖21顯示3G10的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :11)與人種系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比對(duì)。JKl種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:114。
[0376] 圖22顯示12A4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :12)與人種系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比對(duì)。JKl種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:115。
[0377] 圖23顯示10A5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :13)與人種系Vk L15氨基 酸序列（SEQ ID N0:106)的比對(duì)。JK2種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:116。
[0378] 圖24顯示5F8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :14)與人種系Vk A27氨基 酸序列（SEQ ID N0:107)的比對(duì)。JKl種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:114。
[0379] 圖25顯示10H10的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :15)與人種系Vk L15氨 基酸序列（SEQ ID N0:106)的比對(duì)。JK2種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:116。
[0380] 圖26顯示1B12的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :16)與人種系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比對(duì)。JKl種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:115。
[0381] 圖27顯示7H1的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :17)與人種系Vk L6氨基酸 序列（SEQ ID N0:105)的比對(duì)。JKl種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:115。
[0382] 圖28顯示11E6的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :18)與人種系Vk A27氨基 酸序列（SEQ ID N0:107)的比對(duì)。JK4種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:117。
[0383] 圖29顯示llE6a的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :109)與人種系Vk A27氨 基酸序列（SEQ ID N0:107)的比對(duì)。JK4種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:118。
[0384] 圖30顯示12B7的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :19)與人種系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比對(duì)。JK5種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:119。
[0385] 圖31顯示13G4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列（SEQ ID NO :20)與人種系Vk L18氨基 酸序列（SEQ ID N0:108)的比對(duì)。JK3種系序列公開(kāi)為SEQ ID N0:120。
[0386] 圖32A_C顯不流式細(xì)胞頭驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果證明抗人]3D-Ll的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4與全長(zhǎng)人I3D-Ll轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合。（A) 3G10的流式細(xì)胞分析 圖，（B) 10A5的流式細(xì)胞分析圖，（C) 12A4的流式細(xì)胞分析圖。
[0387] 圖33顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該結(jié)果證明抗人H)-L1的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4以濃度依賴的方式與全長(zhǎng)人H)-L1轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合。
[0388] 圖34顯示ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該結(jié)果證明抗人H)-L1的人單克隆抗體3G10、10A5 和12A4與ro-Ll-Fc融合蛋白結(jié)合。
[0389] 圖35顯示證明在刺激的人⑶4+T細(xì)胞上HuMab滴定的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0390] 圖36顯示證明在刺激的食蟹猴PBMC上HuMab滴定的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0391] 圖37A_C顯不流式細(xì)胞頭驗(yàn)的結(jié)果，該結(jié)果證明抗人]3D-Ll的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4與活化的T細(xì)胞表面上的H)-L1結(jié)合。（A) 3G10的流式細(xì)胞分析圖，（B) 10A5 的流式細(xì)胞分析圖，（C) 12A4的流式細(xì)胞分析圖。
[0392] 圖38證明HuMab與ES-2細(xì)胞結(jié)合。
[0393] 圖39A-D顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試 驗(yàn)中促進(jìn)T細(xì)胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。圖39A是顯示使用HuMb 10A5的濃度依 賴性T細(xì)胞增殖的條圖；圖39B是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性IFN- Y分泌的條圖； 圖39C是顯示使用HuMb 3G10和12A4的濃度依賴性IFN- Y分泌的條圖；圖39D是顯示使 用HuMb 10A5的濃度依賴性IL-2分泌的條圖。
[0394] 圖40證明在MLR中使用異基因樹突細(xì)胞和T細(xì)胞（CD4+效應(yīng)T細(xì)胞）樹突細(xì)胞， 人抗I 3D-Ll抗體對(duì)增殖和IFN-Y分泌的影響。
[0395] 圖41A-D顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體在含有T調(diào)節(jié)細(xì)胞的MLR 中促進(jìn)T細(xì)胞增殖和IFN- Y分泌。圖41A是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性T細(xì)胞增 殖的條圖；圖41B是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性IFN-Y分泌的條圖。
[0396] 圖42證明在存在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抗H)-L1抗體對(duì)細(xì)胞增殖的 結(jié)果。
[0397] 圖43證明在存在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抗PD-Ll抗體對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn) 生的結(jié)果。
[0398] 圖44證明抗PD-Ll抗體對(duì)CMV裂解液刺激的人PBMC IFN- Y分泌的結(jié)果。
[0399] 圖45顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體阻斷H)-L1與表達(dá) ro-i的CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。
[0400] 圖46顯示抗PD-Ll抗體阻斷PD-Ll與IFN- Y處理的ES-2細(xì)胞的結(jié)合。
[0401] 圖47顯示抗I3D-Ll抗體對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
[0402] 發(fā)明詳沭
[0403] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合ro-Ll的分離的單克隆抗體，特別是人單克 隆抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出一種或多種所需的功能性質(zhì)，如與人 PD-Ll的高親和力結(jié)合，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中增強(qiáng)T細(xì)胞增殖、IFN- Y和/或IL-2分泌 的能力，抑制ro-Ll與ro-1受體結(jié)合的能力，刺激抗體應(yīng)答的能力，和/或逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞 的抑制功能的能力。另外或者可替代地，本發(fā)明的抗體源自特定重鏈和輕鏈種系序列，和/ 或包含特定結(jié)構(gòu)特征，如包含特定氨基酸序列的⑶R區(qū)。
[0404] 例如，本發(fā)明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙 特異性分子、和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。
[0405] 在另一方面，本發(fā)明涉及使用抗ro-Li抗體抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。 本發(fā)明也涉及利用該抗體改變免疫應(yīng)答，以及治療疾病如癌癥或傳染病，或刺激保護(hù)性自 身免疫應(yīng)答或刺激抗原特異性免疫應(yīng)答的方法（例如通過(guò)抗ro-Li和目標(biāo)抗原的共給藥）。
[0406] 為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語(yǔ)。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中 說(shuō)明。
[0407] 術(shù)語(yǔ)"免疫應(yīng)答"是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞 或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子（包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體）的作用，其導(dǎo)致選擇性損傷、破 壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或（在自身免疫或 病理性炎癥的情況下）正常人細(xì)胞或組織。
[0408] "信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"是指在信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞的一部分向一個(gè)細(xì)胞的另一部分傳送中 起作用的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。本文使用的短語(yǔ)"細(xì)胞表面受體"包括，例如， 能夠接收信號(hào)和跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號(hào)的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的"細(xì)胞表面受 體"的一個(gè)例子是ro-Li受體。
[0409] 這里提到的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段（即"抗原結(jié)合部 分"）或單鏈。"抗體"是指包含通過(guò)二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重（H)鏈和兩條輕 (L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)（在此縮寫為V h)和重鏈恒定 區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和C h3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)（在此縮寫 為')和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q組成。V1^P'區(qū)可進(jìn)一步再分為 高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)（FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè) V h和八均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列：FR1，CDRl， FR2,⑶R2，F(xiàn)R3,⑶R3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？?體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系 統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如效應(yīng)細(xì)胞）和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分（Clq)。
[0410] 本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡(jiǎn)稱為"抗體部分"）是指保留與抗原 (例如ro-Li)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可 由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)行使。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"中所包括的結(jié)合片段的例子包括： (1汗 &13片段，即由^11、(^和〇11結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；出汗妯'） 2片段，即包含在鉸鏈 區(qū)處通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；（iii)由V1^P Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段； (iv)由抗體單臂的Vlj和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由V h結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（Ward 等（1989)Nature 341 :544-546);和（vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。此外，盡管Fv片段的 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域'和Vh由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過(guò)合成連接體連接在 一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中 '和Vh區(qū)配對(duì)構(gòu)成單價(jià)分子（稱為單 鏈 Fv(scFv);參見(jiàn)，例如 Bird 等（1988) Science 242 :423-426;和 Huston 等（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分" 內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對(duì) 這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。
[0411] 本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體 (例如，與PD-Ll特異性結(jié)合的分離的抗體基本不含與除PD-Ll以外的抗原特異性結(jié)合的抗 體）。但是，與ro-Li特異性結(jié)合的分離的抗體與諸如來(lái)自其他物種的ro-Li分子等其他抗 原可能具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。
[0412] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體 分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。
[0413] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"人抗體"包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，構(gòu)架區(qū)和 CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種 系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘 基（例如，通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變）。但是，本 文使用的術(shù)語(yǔ)"人抗體"不包括其中源自另一哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已被移 植到人構(gòu)架序列上的抗體。
[0414] 術(shù)語(yǔ)"人單克隆抗體"是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR 區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn) 生，該雜交瘤包括與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈 轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物（例如轉(zhuǎn)基因小鼠）中獲得。
[0415] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"重組人抗體"包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有 人抗體，例如：(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物（例如小鼠）或由其 制備的雜交瘤（下文進(jìn)一步描述）中分離的抗體，（b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如 轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，（c)從重組組合人抗體文庫(kù)中分離的抗體，和（d)通過(guò)包括將人免疫 球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這 些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和⑶R區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在 某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變（或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變），因此重組抗體的V h和' 區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系 %和'序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分 (repertoire)中。
[0416] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別（例如IgM或 IgGl)。
[0417] 短語(yǔ)"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體"在此與術(shù)語(yǔ)"與抗原特異性結(jié)合的 抗體"可互換使用。
[0418] 術(shù)語(yǔ)"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的 偶聯(lián)物。
[0419] 術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指其中來(lái)源于另外一種哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序 列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。
[0420] 術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"是指其中可變區(qū)序列來(lái)源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來(lái)源于另一 個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來(lái)源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來(lái)源于人抗體的抗體。
[0421] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"與人ro-Ll特異性結(jié)合"的抗體是指以IXKT7M或更低、更優(yōu)選 5 X KT8M或更低、更優(yōu)選I X KT8M或更低、更優(yōu)選5 X KT9M或更低、甚至更優(yōu)選I X KT8M至 I X KTwM或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合的抗體。
[0422] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"Kass。。"或"Ka"是指特定抗體_抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文 使用的術(shù)語(yǔ)"K dis"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術(shù)語(yǔ)"Kd" 是指解離常數(shù)，它是由心與心的比值獲得的（即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度（M)?？贵w的 Kd值可能用本領(lǐng)域建立的方法測(cè)定。測(cè)定抗體Kd的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共 振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biacore?系統(tǒng)。
[0423] 本文使用的術(shù)語(yǔ)IgG抗體的"高親和力"是指抗體對(duì)于靶抗原的Kd為KT 8M或更 低、更優(yōu)選KT9M或更低、甚至更優(yōu)選KTwM或更低。但是對(duì)于其他抗體同種型來(lái)說(shuō)，"高親 和力"結(jié)合可能不同。例如，對(duì)于IgM同種型來(lái)說(shuō)，"高親和力"結(jié)合是指抗體具有KT 7M或 更低、更優(yōu)選KT8M或更低、甚至更優(yōu)選KT9M或更低的K d。
[0424] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)"非人類動(dòng)物"包括所 有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲 類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。
[0425] 本申請(qǐng)的各個(gè)方面在下面的章節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0426] 抗-PD-Ll 抗體
[0427] 本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與人I3D-Ll 特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力與ro-Ll結(jié)合，例如K d為IX KT7M或更低。 本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體優(yōu)選地表現(xiàn)出以下一種或多種特性：
[0428] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0429] (b)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0430] (c)在MLR試驗(yàn)中提高干擾素-Y產(chǎn)生；
[0431] (d)在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌；
[0432] (e)刺激抗體應(yīng)答；和/或
[0433] (f)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞的作用。
[0434] 優(yōu)選地，該抗體以5 X KT8M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合，以I X KT8M或更低的Kd 與人ro-Ll結(jié)合，以5X1(T9M或更低的Kd與人ro-Ll結(jié)合，以4X1(T9M或更低的K d與人 PD-Ll結(jié)合，或以2X KT9M或更低的Kd與人I3D-Ll結(jié)合，或以IX KT9M至IX KTkiM或更低 的Kd與人ro-Li結(jié)合。
[0435] 評(píng)價(jià)抗體對(duì)I3D-Ll的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的，包括，例如 ELISA、We Stem印跡分析和RIA。合適的試驗(yàn)在實(shí)施例中詳細(xì)描述?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)（例 如結(jié)合親和力）也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)（如Biacore?分析）來(lái)評(píng)價(jià)。
[0436] 單克降抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4
[0437] 本發(fā)明優(yōu)選的抗體是如實(shí)施例1和2所述分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 ％氨基酸序列分別顯示在 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10中。3610、12六4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的\氨基酸序列分別 顯示在 SEQ ID 吣：11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中。
[0438] 假定這些抗體中的每一個(gè)都能夠與H)-L1結(jié)合，則V1^P '序列可以"混合并匹 配"，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PD-Ll結(jié)合分子。PD-Ll與這些"混合并匹配的"抗體的 結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)（例如ELISA)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)V 1^P'鏈混 合并匹配時(shí)，來(lái)自特定VH/\配對(duì)的Vh序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的V h序列。同樣，優(yōu)選地， 來(lái)自特定VH/\配對(duì)的 '序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的' 序列。
[0439] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包 括：
[0440] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； 和
[0441] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)；
[0442] 其中該抗體與ro-Ll、優(yōu)選與人ro-Ll特異性結(jié)合。
[0443] 優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括：
[0444] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :11的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0445] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :12的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0446] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :13的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0447] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO : 14的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0448] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :15的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0449] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO : 16的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0450] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :17的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0451] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO : 18的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0452] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO : 19的 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或
[0453] (a)包含SEQ ID NO :10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和（b)包含SEQ ID NO :20 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0454] 在另一方面，本發(fā)明提供包含 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 比12、7111、1比6、1287和1364的￥ 11〇)1?1的氨基酸序列示于5￡0 10吣：21、22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vh CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 中。3G10、12A4、 10八5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的￥11〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣： 41、42、43、44、45、46、47、48、49和50中。3610、12六4、1(^5、5卩8、101110、1812、7111、1比6、1287 和 13G4 的 Vk CDRl 的氨基酸序列示于 SEQ ID 勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vk CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥1?〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣：71、72、73、74、75、76、77、 78、79 和 80 中。CDR 區(qū)用 Kabat 系統(tǒng)（Kabat，E.A?等（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號(hào)91-3242)勾畫出。
[0455] 假如這些抗體均能與H)-L1結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由⑶Rl、2和3區(qū) 提供的，則V h⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列與Vk⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列可以"混合并匹 配"（即來(lái)自不同抗體的⑶R可以混合并匹配，但是每個(gè)抗體必須含有Vh OTR1XDR2和⑶R 3和Vk OTR1XDR 2和⑶R 3)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PD-Ll結(jié)合分子。PD-Ll與這些 "混合并匹配的"抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)（例如ELISA，Biacore 分析）檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)V h OTR序列混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或 ⑶R3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列。同樣，當(dāng)V k OTR序列混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定 Vk序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列。對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)V h和/或' CDR區(qū)序列替換為來(lái)自此處 公開(kāi)的單克隆抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 CDR 序列 的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和' 序列。
[0456] 因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包 括：
[0457] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0458] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0459] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0460] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDRl ;
[0461] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0462] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0463] 其中該抗體與ro-Ll、優(yōu)選與人ro-Ll特異性結(jié)合。
[0464] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0465] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0466] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0467] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0468] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0469] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0470] (f)包含SEQ ID NO : 71的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0471] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0472] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0473] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0474] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0475] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0476] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0477] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0478] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0479] (a)包含SEQ ID NO丨3的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0480] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0481] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0482] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0483] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0484] (f)包含SEQ ID NO J3的輕鏈可變區(qū)CDR 3。
[0485] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0486] (a)包含SEQ ID NO丨4的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0487] (b)包含SEQ ID NO : 34的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0488] (c)包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區(qū)CDR 3 ;
[0489] (d)包含SEQ ID NO :54的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0490] (e)包含SEQ ID NO :64的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0491] (f)包含SEQ ID NO :74的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0492] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0493] (a)包含SEQ ID NO :?的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0494] (b)包含SEQ ID NO :35的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0495] (c)包含SEQ ID NO :4 5的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0496] (d)包含SEQ ID NO :55的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0497] (e)包含SEQ ID NO :65的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0498] (f)包含SEQ ID NO J5的輕鏈可變區(qū)CDR 3。
[0499] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0500] (a)包含SEQ ID NO :26的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0501] (b)包含SEQ ID NO :36的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0502] (c)包含SEQ ID NO :46的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0503] (d)包含SEQ ID NO :56的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0504] (e)包含SEQ ID NO :66的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0505] (f)包含SEQ ID NO :76的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0506] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0507] (a)包含SEQ ID NO :27的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0508] (b)包含SEQ ID NO :37的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0509] (c)包含SEQ ID NO :47的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0510] (d)包含SEQ ID NO :57的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0511] (e)包含SEQ ID NO :67的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0512] (f)包含SEQ ID NO :77的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0513] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0514] (a)包含SEQ ID NO :28的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0515] (b)包含SEQ ID NO :38的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0516] (c)包含SEQ ID NO :48的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0517] (d)包含SEQ ID NO :58的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0518] (e)包含SEQ ID NO :68的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0519] (f)包含SEQ ID NO :78的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0520] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0521] (a)包含SEQ ID NO :29的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0522] (b)包含SEQ ID NO :39的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0523] (c)包含SEQ ID NO :49的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0524] (d)包含SEQ ID NO :59的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0525] (e)包含SEQ ID NO :69的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0526] (f)包含SEQ ID NO :79的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0527] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括：
[0528] (a)包含SEQ ID NO :30的重鏈可變區(qū)CDRl ;
[0529] (b)包含SEQ ID NO :40的重鏈可變區(qū)CDR2 ;
[0530] (c)包含SEQ ID NO :50的重鏈可變區(qū)CDR3 ;
[0531] (d)包含SEQ ID NO :60的輕鏈可變區(qū)CDRl ;
[0532] (e)包含SEQ ID NO :70的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
[0533] (f)包含SEQ ID NO :80的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0534] 本領(lǐng)域公知，不依賴于⑶Rl和/或⑶R2域，單獨(dú)的⑶R3域即可以決定抗體對(duì)于同 源抗原的結(jié)合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預(yù)測(cè)性地產(chǎn)生具有相同結(jié)合特異性 的多種抗體。參見(jiàn)，例如，Klimka 等，British J.of Cancer 83(2) :252-260(2000)(描述了 僅使用鼠抗-⑶30抗體Ki-4的重鏈可變域⑶R3產(chǎn)生人源化抗-⑶30抗體）；Beib 〇er等， J. Mol Biol. 296 :833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠 M0C-31 抗-EGP-2 抗體的重鏈 CDR3 序列產(chǎn)生重組上皮糖蛋白-2 (EGP-2)抗體）；Rader 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 95 : 8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯(lián)蛋白a J3抗體LM609的重鏈和輕鏈可變CDR3域 的一組人源化抗整聯(lián)蛋白a J 3抗體，其中每個(gè)成員抗體在CDR3域之外含有不同的序列， 并且能夠與親本鼠抗體結(jié)合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣高或更高）；Barbas 等，J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162(1994)(公開(kāi)了 CDR3域?qū)乖Y(jié)合提供了最重要的貢 獻(xiàn)）；Barbas 等，Proc，Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (I"5)(描述了三種抗人胎盤 DNA的Fab (SI-1，SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列向抗破傷風(fēng)類毒素Fab的重鏈上的移 植，由此替換了存在的重鏈⑶R3,并且證明單獨(dú)的⑶R3提供結(jié)合特異性）；和Ditzel等， J. Immunol. 157 :739-749(1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異性IgG破傷風(fēng)類毒素結(jié) 合Fab p313抗體轉(zhuǎn)移親本多特異性Fab LNA3的重鏈⑶R3足以保留親本Fab的結(jié)合特異 性）。上述每一參考文獻(xiàn)都全文引入作為參考。
[0535] 因此，在某些方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人抗體如小鼠或大鼠抗體 的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合CD19。在某 些實(shí)施方案中，這些本發(fā)明的包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗 體與相應(yīng)的親本非人抗體（a)能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；(b)保留功能特性；（c)結(jié)合相同的表位；和/ 或（d)具有類似的結(jié)合親和力。
[0536] 在其他方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自第一人抗體（如從非人動(dòng)物獲得 的人抗體）的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠特異性結(jié)合 CD19,并且其中來(lái)自該第一人抗體的CD3域代替了缺乏對(duì)H)-L1的結(jié)合特異性的人抗體中 的CDR3域，從而產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合H)-L1的第二人抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的 包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應(yīng)的親本第一人抗 體（a)能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合相同的表位；和/或（d)具有類似的結(jié) 合親和力。
[0537] 具有特定種系序列的抗體
[0538] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含來(lái)自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈 可變區(qū)和/或來(lái)自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。
[0539] 例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合 部分，其包含產(chǎn)自或源自人V h 1-18基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-L 1特異性結(jié)合。 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn) 自或源自人V h 1-69基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自 人V h 1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人V h 3-9基因的重 鏈可變區(qū)，其中該抗體與ro-Li特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離 的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人V k L6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗 體與H)-L1特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其 抗原結(jié)合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人V k L15基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1 特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部 分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人V k A27基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1特異性結(jié) 合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或片段， 其包含產(chǎn)自或源自人V k L18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與H)-L1特異性結(jié)合。在另一 優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體：
[0540] (a)包含產(chǎn)自或源自人Vh 1-18、1-69、1-3或3-9基因（該基因分別編碼SEQ ID NO : 101、102、103和104所示的氨基酸序列）的重鏈可變區(qū)；
[0541] (b)包含產(chǎn)自或源自人Vk L6、L15、A27或Ll基因（該基因分別編碼SEQ ID NO : 105、106、107和108所示的氨基酸序列）的輕鏈可變區(qū)；且
[0542] (c)與ro-Ll、優(yōu)選與人PD-Ll特異性結(jié)合。
[0543] 分別具有￥11 1-18和Vk 的抗體的一個(gè)例子是3G10。分別具有￥11 1-69 和Vk L6的Vk的抗體的例子是12A4、1B12、7H1和12B7。分別具有Vh 1-3和Vk L15的 Vh和Vk的抗體的一個(gè)例子是10A5。分別具有Vh 1-69和Vk A27的Vh和Vk的抗體的例子是 5F8U1E6和llE6a。分別具有V h 3-9和Vk L15的Vh和Vk的抗體的一個(gè)例子是10H10。分 另Ij具有Vh 1-3和Vk L15的Vh和Vk的抗體的一個(gè)例子是10A5。分別具有Vh 3-9和Vk L18 的Vh和Vk的抗體的一個(gè)例子是13G4。
[0544] 在本文中，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲 得的，則該人抗體包含"產(chǎn)自"或"源自"特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng) 包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬 菌體上的人免疫球蛋白基因文庫(kù)。"產(chǎn)自"或"源自"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以 這樣鑒定：將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，選擇在 序列上最接近于該人抗體序列（即有最高％同一性）的人種系免疫球蛋白序列。"產(chǎn)自"或 "源自"特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如 由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo)致的氨基酸差異。但是，選擇的人 抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列通常至少90%相同，并且 含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列（例如鼠種系序列）相比較時(shí)確認(rèn)該人抗 體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋 白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。在某 些實(shí)施方案中，源自特定人種系序列的人抗體表現(xiàn)與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基 酸序列有不超過(guò)10個(gè)氨基酸的差異。在某些其他實(shí)施方案中，該人抗體可能表現(xiàn)與該種系 免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過(guò)5個(gè)、或者甚至不超過(guò)4、3、2或1個(gè)氨基酸的 差異。
[0545] 同源抗體
[0546] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選 抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗-PD-Ll抗體的所 需功能特性。
[0547] 例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)，其中 ：
[0548] (a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0549] (b)輕鏈可變區(qū)包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0550] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0551] (d)該抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0552] (e)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高干擾素-Y產(chǎn)生；
[0553] (f)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌；
[0554] (g)該抗體刺激抗體應(yīng)答；且
[0555] (h)該抗體逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞的作用。
[0556] 在另外一些實(shí)施方案中，￥11和/或'氨基酸序列可以與上述序列 95 %、96 %、97%、98 %或99 %同源。具有與上述序列的Vh和'區(qū)高度（即80 %或更高） 同源的Vh和 '區(qū)的抗體可以如下獲得：誘變（例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變）編碼SEQ ID NO :25、26、27、28、29和30的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)編碼的被改變 抗體的保留的功能（即以上（c)到（h)所述的功能）。
[0557] 本文使用的兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分同一 性。考慮為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度后， 兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)（即％同源性= 相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)X100)。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以 如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。
[0558] 兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序（2.0版本） 中的 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17(1988))的算法來(lái)確定，其使 用PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分，4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的 百分同一'I"生也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包（可從www. gcg. com獲得）的GAP程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444-453 (1970))的算法來(lái)確定，其使用 Blossum 62 矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。
[0559] 在某些情況中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步作為"查詢序列"用于進(jìn)行公共 數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，例如鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等（1990)J. Mol. Biol. 215: 403-10的XBLAST程序（2. 0版本）進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得 分=50,字長(zhǎng)=3,以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目 的的空位比對(duì)，可以采用如 Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 所 述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序（例如XBLAST和 NBLAST)的缺省參數(shù)。參見(jiàn) www. ncbi. nlm. nih. gov。
[0560] 具有保守修飾的抗體
[0561] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含⑶Rl XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和 含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些⑶R序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本 文所述優(yōu)選抗體（例如3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364)的特定 氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-PD-Ll抗體的所需功能特性。因 此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序 列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中 ：
[0562] (a)重鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，
[0563] (b)輕鏈可變區(qū) CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，
[0564] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0565] (d)該抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0566] (e)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高干擾素-Y產(chǎn)生；
[0567] (f)該抗體在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌；
[0568] (g)該抗體刺激抗體應(yīng)答；且
[0569] (h)該抗體逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞的作用。
[0570] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID N0:31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶R2 序列包含選自SEQ ID勵(lì)：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列和其保守修 飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :21、 22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū) CDRl序列包含選自SEQ ID勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列和其保 守修飾的氨基酸序列。
[0571] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"保守序列修飾"是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗 體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過(guò)本 領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基 酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的 家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括：具有堿性側(cè)鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、 酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷極性側(cè)鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、￠-分支側(cè)鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和 芳族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū) 內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被置換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以 用此處所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)改變的抗體保留的功能（即以上（c)至（h)所述的功能）。
[0572] 與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體結(jié)合相同表位的抗體
[0573] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任意I3D-Ll單克隆抗體結(jié)合相同表位 的抗體（即能夠與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ro-Li的抗體）。在優(yōu)選實(shí)施方案 中，用于交叉競(jìng)爭(zhēng)研究的參比抗體可以是單克隆抗體3G10 (具有分別如SEQ ID NO :1和11 所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體12A4 (具有分別如SEQ ID NO :2和12所示的Vh和' 序列），或單克隆抗體10A5 (具有分別如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或單克 隆抗體10A5 (具有分別如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體5F8 (具 有分別如SEQ ID NO :4和14所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體10H10 (具有分別如SEQ ID NO :5和15所示的Vh和八序列），或單克隆抗體1B12 (具有分別如SEQ ID NO :6和16 所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體7H1 (具有分別如SEQ ID NO :7和17所示的Vh和 '序 列），或單克隆抗體11E6 (具有分別如SEQ ID NO :8和18所示的Vh和 '序列），或單克隆 抗體12B7 (具有分別如SEQ ID NO :9和19所示的Vh和八序列），或單克隆抗體13G4 (具 有分別如SEQ ID NO: 10和20所示的V1^P'序列）。這些交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體可以根據(jù)它們?cè)?標(biāo)準(zhǔn) PD-Ll 結(jié)合測(cè)定中與 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 交叉 競(jìng)爭(zhēng)的能力來(lái)鑒定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測(cè)定或流式細(xì)胞分析來(lái)證明與本 發(fā)明抗體的交叉競(jìng)爭(zhēng)。被測(cè)試抗體抑制例如3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、 12B7或13G4與人I 3D-Ll結(jié)合的能力證明，該測(cè)試抗體可以與3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1812、7111、11￡6、1287或1364競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人^)-11，因此所結(jié)合的人^)-11上的表位與3610、 12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4相同。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所結(jié)合 的人 PD-Ll 上的表位與 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 相同的 抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實(shí)施例所述制備和分離。
[0574] 工稈化抗體和修飾的抗體
[0575] 本發(fā)明的抗體進(jìn)一步可以利用具有此處所公開(kāi)的一種或多種Vh和/或\序列的 抗體作為起始材料來(lái)制備，以構(gòu)建一種修飾的抗體，該修飾的抗體相對(duì)于與起始抗體相比 可以具有改變的特性?？梢酝ㄟ^(guò)修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)（即％和/或^例如一個(gè)或多個(gè) CDR區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基來(lái)構(gòu)建抗體。另外，或者，可以通過(guò) 修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來(lái)構(gòu)建抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能。
[0576] 可以進(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程化是⑶R移植?？贵w主要是通過(guò)位于六個(gè)重 鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個(gè)原因，CDR內(nèi) 的氨基酸序列比CDR外的序列在各個(gè)抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗 體-抗原相互作用，因此通過(guò)構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性 的重組抗體：該表達(dá)載體包含來(lái)自特定天然存在抗體的⑶R序列，該⑶R序列被移植到來(lái) 自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上（參見(jiàn)，例如，Riechmann，L.等（1998)Nature 332 :323-327 Jones，P?等（1986)Nature 321:522-525 ;Queen，C?等（1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :10029-10033 ;Winter 的美國(guó)專利 5, 225, 539,和 Queen 等的美國(guó)專利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0577] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包括含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)，該⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列分別包含選自 5￡〇10恥：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30,5￡〇10從） ：31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40,和 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的氨基酸序列，并且包括含 CDRl、 CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60,5￡01〇勵(lì)：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70，和5￡0 ID勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗 體3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364的￥ 11和'〇)1?序列，但是可 能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。
[0578] 這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)或發(fā)表的參考 文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn) ： "VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)（可從因特網(wǎng)上www. mrc~cpe. cam, ac. uk/vbase獲得），以及 Rabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U. S. Department of Health and Human Services,NIH出版號(hào)91-3242 ;Tomlinson, I. M?等 (1992)"The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol. 227 :776-798;和 Cox, J. P. L?等（1994)''A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur. J. Immunol. 24 :827-836 ;其內(nèi)容均引入本文作為參考。
[0579] 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一種被稱為缺口 BLAST(Altschul等（1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)的序列相似性檢索方法，將抗體蛋白質(zhì)序列與匯編的蛋白 質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。BLAST是一種啟發(fā)式算法，其中抗體序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性比對(duì)可能含有所比對(duì)的字句的高得分的片段對(duì)（HSP)。延伸或修剪不能提高其得 分的片段對(duì)被稱為命中（hit)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，翻譯VBASE來(lái)源的核苷酸序列（vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbasel/list2. php)，而保留FRl至FR3構(gòu)架區(qū)之間并且包括該構(gòu)架區(qū)的區(qū)域。 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的平均長(zhǎng)度為98個(gè)殘基。除去在蛋白質(zhì)全長(zhǎng)上準(zhǔn)確匹配的重復(fù)序列。使用程 序blastp，除關(guān)閉的低復(fù)雜性過(guò)濾器和BL0SUM62置換矩陣以外應(yīng)用缺省標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)對(duì)蛋白 質(zhì)進(jìn)行BLAST檢索，對(duì)于排名前5位的命中，過(guò)濾器產(chǎn)生序列匹配。在所有6個(gè)框架內(nèi)的核 苷酸序列都翻譯，在數(shù)據(jù)庫(kù)序列的匹配片段中沒(méi)有終止密碼子的框架被認(rèn)為是潛在命中。 然后使用BLAST程序tblastx進(jìn)行證實(shí)。該程序翻譯所有6個(gè)框架內(nèi)的抗體序列，并且比 較其翻譯與在所有6個(gè)框架內(nèi)動(dòng)態(tài)翻譯的VBASE核苷酸序列。
[0580] 同一性是抗體序列和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)之間在序列全長(zhǎng)上的完全氨基酸匹配。陽(yáng)性 (同一性+置換匹配）不同，但是氨基酸置換由BL0SUM62置換矩陣指導(dǎo)。如果抗體序列以 相同的同一性匹配兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列，則陽(yáng)性最強(qiáng)的命中被判斷為匹配序列命中。
[0581] 用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于所選擇的本發(fā)明抗體使用的構(gòu) 架序列，例如，類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的V h 1-18構(gòu)架序列（SEQ ID NO :101) 和/*VH 1-69 構(gòu)架序列（SEQ ID NO: 102)和/或 Vh 1-3 構(gòu)架序列（SEQ ID NO: 103)和 / *VH 3-9 構(gòu)架序列（SEQ ID N0:104)和 / 或Vk L6 構(gòu)架序列（SEQ ID N0:105)和/*VK L15 構(gòu)架序列（SEQ ID NO :106)和 / 或 Vk A27 構(gòu)架序列（SEQ ID NO :107)和 / 或 Vk L18 構(gòu)架序列（SEQ ID NO : 107)。Vh CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序列和 Vk CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序 列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來(lái)源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者 CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有 利的（參見(jiàn),例如，Queen 等的美國(guó)專利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0582] 另一種類型的可變區(qū)修飾是突變VjP /或Vk CDRUCDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基 酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性（例如親和力）?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或 PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合的影響，或者其他目標(biāo)功能特性，可以用此處所述 和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選引入（如上文所述的）保守修飾。這些突 變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變⑶R區(qū)內(nèi)的不超過(guò)1、2、 3、4或5個(gè)殘基。
[0583] 因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-PD-Ll單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有：（a)V H CDRl區(qū)，其包含選自SEQ ID N0:21、22、23、24、 25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，或與5￡01〇勵(lì)：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30 相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b) Vh OTR2區(qū)，其包含選 自5￡01〇勵(lì)：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列，或與5￡01〇勵(lì)：31、32、 33、34、35、36、37、38、39和40相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序 列；（c)V H CDR3 區(qū)，其包含選自 SEQ ID 勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序 列，或與5￡0 1〇勵(lì)：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸 置換、缺失或添加的氨基酸序列；（d)V K CDRl區(qū)，其包含選自SEQ ID N0:51、52、53、54、55、 56、57、58、59和60的氨基酸序列，或與5￡01〇勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60相 比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e) Vk OTR2區(qū)，其包含選自 5￡01〇勵(lì)：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列，或與5￡01〇勵(lì)：61、62、63、 64、65、66、67、68、69和70相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列； 和（f)V K CDR3 區(qū)，其包含選自 SEQ ID 勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序 列，或與5￡0 1〇勵(lì)：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸 置換、缺失或添加的氨基酸序列。
[0584] 本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對(duì)其Vh和/或Vk內(nèi)的構(gòu)架殘 基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種 方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基"回復(fù)突變"為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變 的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過(guò)比較抗體構(gòu)架序列與衍生該 抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，如下所述，抗-PD-I抗體3G10、12A4、10A5、5F8、 10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的構(gòu)架區(qū)中的大量氨基酸改變不同于親本種系序列。 為了使構(gòu)架區(qū)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(guò)（例如）定點(diǎn) 誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變"回復(fù)突變"為種系序列。3G10的V h區(qū)與親本種 系VH1-18序列的比對(duì)顯示在圖11中。12A4的Vh區(qū)與親本種系V h 1-69序列的比對(duì)顯示在 圖12中。10A5的Vh區(qū)與親本種系Vh 1-3序列的比對(duì)顯示在圖13中。5F8的Vh區(qū)與親本 種系Vh 1-69序列的比對(duì)顯示在圖14中。IOHlO的Vh區(qū)與親本種系Vh 3-9序列的比對(duì)顯 示在圖15中。川12的Vh區(qū)與親本種系Vh 1-69序列的比對(duì)顯示在圖16中。7H1的VHg 與親本種系Vh 1-69序列的比對(duì)顯示在圖17中。11E6的Vh區(qū)與親本種系Vh 1-69序列的 比對(duì)顯示在圖18中。12B7的Vh區(qū)與親本種系Vh 1-69序列的比對(duì)顯示在圖19中。13G4 的Vh區(qū)與親本種系Vh 3-9序列的比對(duì)顯示在圖20中。
[0585] 例如，對(duì)于3G10, Vh的氨基酸殘基#79 (FR3內(nèi)）是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-18種 系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(guò)（例如）定點(diǎn) 誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變"回復(fù)突變"為種系序列（例如，3G10的V h的殘基 #79 (FR3的殘基#13)可以從纈氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸）。
[0586] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12A4, Vh的氨基酸殘基#24(FR1內(nèi)）是蘇氨酸，而在相應(yīng)的 Vh 1-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12A4的Vh的殘基#24從蘇氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在 本發(fā)明內(nèi)。
[0587] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12A4, Vh的氨基酸殘基#27 (FR1內(nèi)）是天冬氨酸，而在相應(yīng)的 Vh 1-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12A4的Vh的殘基#27從天冬氨酸"回復(fù)突變"為甘氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括 在本發(fā)明內(nèi)。
[0588] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12A4, Vh的氨基酸殘基#95 (FR3內(nèi)）是苯丙冬氨酸，而在相應(yīng) 的Vh 1-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以 將12A4的￥11的殘基#95(FR3的殘基#29)從苯丙氨酸"回復(fù)突變"為酪氨酸。這種"回復(fù) 突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0589] 另一個(gè)例子是，對(duì)于5F8,氨基酸殘基#24 (FR1內(nèi)）是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將5F8的Vh 的殘基#24從纈氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0590] 另一個(gè)例子是，對(duì)于5F8,氨基酸殘基#28 (FR1內(nèi)）是異亮氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將5F8 的Vh的殘基#28從異亮氨酸"回復(fù)突變"為蘇氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā) 明內(nèi)。
[0591] 另一個(gè)例子是，對(duì)于10H10,氨基酸殘基#24(FR1內(nèi)）是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vh 3-9 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將10H10的 Vh的殘基#24從纈氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0592] 另一個(gè)例子是，對(duì)于10H10,可以在氨基酸殘基#97 (FR3內(nèi)）后插入氨基酸。該氨 基酸為纈氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將在10H10的Vh的殘基 #97之后插入的氨基酸"回復(fù)突變"，從而刪除該纈氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在 本發(fā)明內(nèi)。
[0593] 另一個(gè)例子是，對(duì)于1B12,氨基酸殘基#24(FR1內(nèi)）是蘇氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將1B12的 Vh的殘基#24從蘇氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0594] 另一個(gè)例子是，對(duì)于1B12,氨基酸殘基#27 (FR1內(nèi)）是天冬氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 1B12的Vh的殘基#27從天冬氨酸"回復(fù)突變"為甘氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括 在本發(fā)明內(nèi)。
[0595] 另一個(gè)例子是，對(duì)于1B12,氨基酸殘基#95 (FR3內(nèi)）是苯丙氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 1B12的Vh的殘基#95 (FR3的殘基#29)從苯丙氨酸"回復(fù)突變"為酪氨酸。這種"回復(fù)突 變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0596] 另一個(gè)例子是，對(duì)于7H1，氨基酸殘基#24 (FR1內(nèi)）是蘇氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將7H1的Vh 的殘基#24從蘇氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0597] 另一個(gè)例子是，對(duì)于7H1，氨基酸殘基#77 (FR3內(nèi)）是蘇氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將7H1的Vh 的殘基#72(FR3的殘基#11)從蘇氨酸"回復(fù)突變"為絲氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也 包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0598] 另一個(gè)例子是，對(duì)于11E6,氨基酸殘基#78(FR3內(nèi)）是丙氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將11E6的 Vh的殘基#78 (FR3的殘基12)從丙氨酸"回復(fù)突變"為蘇氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也 包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0599] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12B7,氨基酸殘基#13 (FR1內(nèi)）是谷氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69 種系序列中該殘基為賴氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將12B7的 Vh的殘基#13從谷氨酸"回復(fù)突變"為賴氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。 [0600] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12B7,氨基酸殘基#30 (FR1內(nèi)）是天冬酰胺，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#30從天冬酰胺"回復(fù)突變"為絲氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包括 在本發(fā)明內(nèi)。
[0601] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12B7,氨基酸殘基#77 (FR3內(nèi)）是天冬酰胺，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#377 (FR3的殘基11)從天冬酰胺"回復(fù)突變"為絲氨酸。這種"回復(fù)突 變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0602] 另一個(gè)例子是，對(duì)于12B7,氨基酸殘基#82 (FR3內(nèi)）是天冬氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為谷氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#82 (FR3的殘基#16)從天冬氨酸"回復(fù)突變"為谷氨酸。這種"回復(fù)突 變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0603] 另一個(gè)例子是，對(duì)于13G4,氨基酸殘基#27 (FR1內(nèi)）是異亮氨酸，而在相應(yīng)的Vh 1-69種系序列中該殘基為苯丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#27從異亮氨酸"回復(fù)突變"為苯丙氨酸。這種"回復(fù)突變"的抗體也包 括在本發(fā)明內(nèi)。
[0604] 另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、乃至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè) 殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為 "脫免疫"，在Carr等的公布號(hào)為20030153043的美國(guó)專利中詳細(xì)記載。
[0605] 除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本 發(fā)明的抗體改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，如 血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的 抗體化學(xué)修飾（例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到該抗體上），或者修飾改變其糖基化， 以改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編 號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。
[0606] 在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變， 例如增加或減少。該方法在Bodmer等的美國(guó)專利No. 5, 677, 425號(hào)中詳細(xì)記載。改變CHl 鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了（例如）促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn) 定性。
[0607] 在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。 更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得該 抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在 Ward等的美國(guó)專利No. 6, 165, 745號(hào)中詳細(xì)記載。
[0608] 在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期?？梢允褂酶鞣N方法。例如，如 Ward的美國(guó)專利No. 6, 277, 375所述，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變：T252L、T254S、T256F。 或者，如Presta等的美國(guó)專利No. 5, 869, 046和6, 121，022所述，為了提高生物半衰期，該 抗體可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變，使之含有來(lái)自IgG Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救 受體結(jié)合表位。
[0609] 在其他一些實(shí)施方案中，通過(guò)將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來(lái) 改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、 318、320、322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的親 和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如， Fc受體或補(bǔ)體的Cl成分。該方法在Winter等的美國(guó)專利No. 5, 624, 821和5, 648, 260中 更詳細(xì)地描述。
[0610] 在另外一個(gè)實(shí)施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC) 降低或消除。該方法在Idusogie等的美國(guó)專利No. 6, 194, 551中更詳細(xì)地描述。
[0611] 在另外一個(gè)實(shí)施例中，改變氨基酸位點(diǎn)231和239中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從 而改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中進(jìn)一步描 述。
[0612] 在另外一個(gè)實(shí)施例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)的能力和/ 或提高抗體對(duì)Fe Y受體的親和力，通過(guò)在下列位點(diǎn)處修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)修飾Fc區(qū)： 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、 398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。該方法在？代8七&的？(：1'公布冊(cè) 00/42072 中進(jìn)一步描述。而且，人IgGl上對(duì)于Fe Y RI、Fe Y RII、Fe Y RIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已 經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體（參見(jiàn)，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位點(diǎn) 256、290、298、333、334 和 339 處的特定突變顯示改善了與 FcYRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcYRIII的結(jié)合：T256A/S298A， S298A/E333A，S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。
[0613] 在另一實(shí)施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無(wú)糖基化的抗體（即該 抗體缺乏糖基化）。例如，為了提高抗體對(duì)抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化 合物修飾可以通過(guò)（例如）改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以 進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，使一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn) 處的糖基化。這種無(wú)糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等的美國(guó)專利 No. 5, 714, 350和6, 350, 861中更詳細(xì)地描述。
[0614] 在某些其他實(shí)施方案中，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目 減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模 式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過(guò)（例如）在糖基化機(jī)制改變的宿 主細(xì)胞中表達(dá)抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。糖基化機(jī)制改變的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì) 胞，在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，細(xì)胞系Ms704、Ms705 和Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8(a (1，6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因），因此在Ms704、 Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。通過(guò)使用兩種替 代載體定向破壞CH0/DG44細(xì)胞中的FUT8基因，產(chǎn)生Ms704、Ms705和Ms709FUT8+細(xì)胞系 (參見(jiàn) Yamane 等的美國(guó)專利申請(qǐng) No. 20040110704 和 Yamane-Ohnuki 等?（2004) Biotechnol Bioeng 87 :614-22)。另一個(gè)例子是，Hanai等的EP 1，176, 195描述了具有功能破壞的 FUT8基因的細(xì)胞系，該基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，由于減少或消除了 a (1，6)鍵相關(guān)的酶，在 這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結(jié)合抗體Fc區(qū)的 N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞 系 YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta 的 PCT 公布 WO 03/035835 記載了一種變異 CHO 細(xì)胞系， Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn (297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿 主細(xì)胞中表達(dá)的抗體為低巖藻糖基化（參見(jiàn)，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 277 : 26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342記載了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶 (例如Ml，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIIl))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì) 胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高（參見(jiàn)，Umana 等（1999)Nat. Biotech. 17 :176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例 如，巖藻糖苷酶〇-1-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基0^代拉111 〇，尤1.等.（1975) Biochem. 14 :5516-23)。
[0615] 本發(fā)明涉及的對(duì)此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生 物（例如血清）半衰期，可以將該抗體PEG化。為了 PEG化一種抗體，一般在一個(gè)或多個(gè) PEG基團(tuán)與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇（PEG)如PEG的反 應(yīng)性酯或醒衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，通過(guò)與反應(yīng)性PEG分子（或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物） 的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。本文使用的術(shù)語(yǔ)"聚乙二醇"包括用來(lái)衍生化其他 蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單（Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來(lái)酰 亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是一種無(wú)糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的 方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見(jiàn),例如，Nishimura等的EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
[0616] 抗體工稈化方法
[0617] 如上所述，能夠利用具有此處公開(kāi)的V1^P Vk序列的抗-PD-Ll抗體，通過(guò)修飾Vh 和/或\序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-PD-Ll抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面， 利用本發(fā)明的抗-PD-Ll 抗體（例如 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4)的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗-PD-Ll抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗體保留本發(fā)明抗 體的至少一種功能特性，如與人I 3D-Ll結(jié)合。如上所述，例如，3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7或13G4的一個(gè)或多個(gè)⑶R區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其 他⑶R重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。其他類型的修飾 包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種％和/或 V k序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定必須實(shí)際制備（即表達(dá)為蛋 白質(zhì)）具有此處提供的一種或多種Vj^P/*V K序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。而是 用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該 "第二代"序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。
[0618] 因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0619] (a)提供：（i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和 / 或選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的 CDR3 序列；和 / 或 (ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 的 CDR2 序列、和 / 或選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0620] (b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘 基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和
[0621] (C)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
[0622] 可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。
[0623] 優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-PD-Ll抗體的一種、一些 或全部功能特性，該功能特性包括但不限于：
[0624] ⑴以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結(jié)合；
[0625] (ii)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖；
[0626] (iii)在MLR試驗(yàn)中提高干擾素1產(chǎn)生；
[0627] (iv)在MLR試驗(yàn)中提高IL-2分泌；
[0628] (v)刺激抗體應(yīng)答；和/或
[0629] (Vi)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞的作用。
[0630] 改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的（如實(shí)施例中所 述的）標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)（例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測(cè)定）來(lái)評(píng)價(jià)。
[0631] 在本發(fā)明抗體的工程化方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-PD-Ll抗 體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對(duì)結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特 性，篩選獲得的修飾的抗-PD-Ll抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT 公布WO 02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突 變的方法。另外，Lazar等的PCT公布WO 03/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體 的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。
[0632] 編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子
[0633] 本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細(xì) 胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過(guò)包括堿/SDS處理、CsCl 顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法與其他細(xì)胞成分 或其他污染物（例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)）分離純化時(shí)，核酸是"分離的"或"基本上純 的，'。參見(jiàn)，F(xiàn). Ausubel 等 ed. (1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發(fā)明的核酸可以是例如 DNA 或 RNA, 并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。
[0634] 本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對(duì)于雜交瘤（例如，由如下文 進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤）表達(dá)的抗體，編碼由雜 交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對(duì)于從免 疫球蛋白基因文庫(kù)中獲得的抗體（例如使用噬菌體展示技術(shù)），可以從文庫(kù)中回收編碼該 抗體的一種或多種核酸。
[0635] 本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4單克隆抗體的'序列的核酸分子。編碼3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥ 11序列的〇嫩序列分別在5￡0 1〇勵(lì)：81、82、83、84、85、86、87、 88、89 和 90 中示出。編碼 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的' 序列的 DNA 序列分別在 SEQ ID N0:91、92、93、94、95、96、97、98、99 和 100 中示出。
[0636] -旦獲得編碼Vh和 '片段的DNA片段，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這 些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這 些操作中，編碼\或V h的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另 一個(gè)DNA片段有效連接。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"意思是兩個(gè)DNA片段連接在一起， 使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀框。
[0637] 通過(guò)將編碼Vh的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)（CHI、CH2和CH3)的另外一種DNA分 子有效連接，可以將分離的編碼V h區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因 的序列在本領(lǐng)域中公知（參見(jiàn)，例如，Kabat，E. A?等（1991) Sequences of Proteins of Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以 是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgGl或IgG4恒定 區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，編碼Vh的DNA可以與只編碼重鏈CHl恒定區(qū)的另外一種DNA 分子有效連接。
[0638] 通過(guò)將編碼 '的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以 將分離的編碼'區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人輕鏈恒定區(qū)基 因的序列在本領(lǐng)域中公知（參見(jiàn)，例如，5^匕&1：，￡.4.等（1991)36911611068〇1^?1'(^6；[11801^ Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，輕鏈恒定區(qū)可以是K或A恒定區(qū)，但最優(yōu)選地是 K恒定區(qū)。
[0639] 為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VdP '的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸 序列（Gly4-Ser) 3的另外一個(gè)片段有效連接，使得Vh和'序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白 質(zhì)，其'和V h區(qū)通過(guò)該柔性連接體連接（參見(jiàn)，例如Bird等（1988) Science 242 :423-426 ; Huston 等（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ;McCafTerty 等（1990)Nature 348 :552-554)〇
[0640] 本發(fā)明的單克降抗體的產(chǎn)牛
[0641] 本發(fā)明的單克隆抗體（mAb)能夠通過(guò)多種技術(shù)制備，包括常規(guī)的單克隆抗體方 法，例如，Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu) 選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病 毒或致癌轉(zhuǎn)化。
[0642] 用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立 的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體 (例如鼠骨髓瘤細(xì)胞）和融合程序也是公知的。
[0643] 本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述獲得的鼠單克隆抗體的序列來(lái)制 備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子 生物學(xué)技術(shù)將其改造為含有非鼠（例如人類）免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗 體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上（參見(jiàn)，例如，Cabilly等 的美國(guó)專利No. 4, 816, 567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR 區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)（參見(jiàn)，例如，Winter的美國(guó)專利No. 5, 225, 539,和Queen等的美國(guó)專利 No. 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0644] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗I3D-Ll人單克隆 抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因 和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別被稱作HuMab小鼠和KM小鼠?的小鼠，并且在此通稱為"人 Ig小鼠"。
[0645] HuMab小鼠? (Medarex, Inc.)包含編碼未重排的人重鏈（ii和Y)和K輕鏈免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源U和K鏈基因座失活的定向突變 (參見(jiàn)，例如，Lonberg等（1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠 IgM或K表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞 突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgG K單克隆抗體（Lonberg，N?等（1994)，同上；綜述Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101;Lonberg,N. ^PHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93,和 Harding, F?和 Lonberg，N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 :536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾， 在下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述：Taylor，L?等（1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen，J?等（1993)International Immunology 5 :647-656 ;Tuaillon 等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :3720-3724 ;Choi 等（1993)Nature Genetics 4:117-123 ;Chen，J?等 (1993)EMB0 J. 12 :82卜830 ;Tuaillon 等（1994)J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor， L?等（1994) International Immunology 6 :579-591;和 Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851,這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文引入本文作為參考。進(jìn)一步參見(jiàn)， Lonberg 和 Kay 的美國(guó)專利 No. 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ;5, 661，016 ;5, 814, 318 ;5, 874, 299 ;和 5, 770, 429 ;和 Surani 等的美國(guó)專利 No. 5, 545, 807 ;Lonberg 和 Kay 的 PCT 公布號(hào) WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, TO 98/24884 和 TO 99/45962 ;和 Korman 等的 PCT 公布號(hào) TO 01/14424。
[0646] 在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠， 例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此被 稱為"KM小鼠?"，在Ishida等的PCT公布WO 02/43478中詳細(xì)描述。
[0647] 再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能 夠用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse (Abgenix， Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等的美國(guó)專利No. 5, 939, 598 ; 6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 和 6, 162, 963 中描述。
[0648] 而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能 夠用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色 體的小鼠，其被稱作"TC小鼠"；這種小鼠在Tomizuka等（2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛（Kuroiwa 等（2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，其能夠用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。
[0649] 本發(fā)明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫(kù)的噬菌體 展示方法制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見(jiàn)，例 如，Ladner 等的美國(guó)專利 No. 5, 223, 409 ;5, 403, 484 ;和 5, 571，698 ;Dower 等的美國(guó)專利 No. 5, 427, 908 和 5, 580, 717 ;McCafferty 等的美國(guó)專利 No. 5, 969, 108 和 6, 172, 197 ;和 Griffiths 等的美國(guó)專利 No. 5, 885, 793 ;6, Ml, 404 ;6, 544, 73I ;6, 555, 3I3 ;6, 582, 9I3O, 31，32, 33, 34, 35 和 36, 593, 081。
[0650] 本發(fā)明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免 疫細(xì)胞，因此在免疫時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等的美國(guó)專利 No. 5, 476, 996 和 5, 698, 767 中描述。
[0651] 人Ig小鼠的免疫
[0652] 當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，根據(jù)Lonberg，N.等（1994)Nature 368(6474) :856-859 ;Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851 JPPCT 公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用純化的或富集的H)-L1抗原和/或重組H)-L1 或F1D-Ll融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時(shí)小鼠為6-16周齡。例如，可 以使用純化的或重組的I 3D-Ll抗原的制劑（5-50 ii g)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。
[0653] 產(chǎn)生抗H)-L1完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在下面的實(shí)施例1中描述。應(yīng)用各種 抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)（IP)免疫，接著隔周用弗 氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫（最多共六次）時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)弗 氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有佐劑時(shí)，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免 疫方案進(jìn)程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過(guò)ELISA(如下所述）篩選 血漿，用具有足夠抗-PD-Ll人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi) 加強(qiáng)免疫，3天后處死并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要2-3次融合。每一種抗原一般 免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCol2系都使用。另外，HCo7和HCol2轉(zhuǎn)基因可以雜交， 產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因（HC 〇7/HC〇12)的一種小鼠?？商娲鼗蛘吡硗?，如實(shí)施例 1所述，可以使用KM小鼠?系。
[0654] 產(chǎn)牛本發(fā)明的人單克降抗體的雜奪瘤的制各
[0655] 為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和 /或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無(wú)限增殖化細(xì)胞系（例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系）融合。根據(jù)抗 原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，可以使用50% PEG，將來(lái)自被免疫小鼠的脾 淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞（ATCC， CRL 1580)融合。將細(xì)胞以大約2X IO5的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20% 胎克隆血清，18%"653"條件基質(zhì)，5%〇1^611(16￡沁，411111-谷氨酰胺，11111丙酮酸鈉，51111 HEPES，0. 055mM 2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和 lXHAT(Sigma;融合后24小時(shí)加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用 HT替換了 HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過(guò)ELISA根據(jù)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各 孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交 瘤再次平板接種，再次篩選，如果對(duì)于人IgG仍然是陽(yáng)性，則可以通過(guò)有限稀釋將單克隆抗 體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表 征。
[0656] 為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖 瓶中生長(zhǎng)。過(guò)濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway，N. J.)進(jìn) 行親和層析。洗脫下來(lái)的IgG通過(guò)凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖 溶液換成PBS，用1. 43的消光系數(shù)根據(jù)0D280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且 在-80°C下保存。
[0657] 產(chǎn)牛本發(fā)明的單克降抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制各
[0658] 利用（例如）本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合（例如， Morrison，S. (1985)science 229:1202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
[0659] 例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)（例如，使用表達(dá) 目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆），獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，并 將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語(yǔ) "有效連接"意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào) 節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和 表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開(kāi)的載體中，或者，更通常地， 將兩個(gè)基因插入到同一表達(dá)載體中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中（例如， 抗體基因片段上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)與載體連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的活，則平端 連接）。通過(guò)插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得 Vh區(qū)段與載體中的C h區(qū)段有效連接，而Vk區(qū)段與載體中的Q區(qū)段有效連接，可以利用本文 描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)生任意抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外，或者可替代 地，重組表達(dá)載體能編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載 體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋 白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽（即，來(lái)自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽）。
[0660] 除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞 中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯 的其他表達(dá)控制元件（例如，多腺苷酸化信號(hào)）。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego， CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決 于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來(lái)源 于巨細(xì)胞病毒（CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子（AdMLP))和 多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?？商娲乜梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子 或珠蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來(lái)自諸如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)等不同來(lái)源的序列 組成，SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)含有來(lái)自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng) 末端重復(fù)序列（Takebe，Y?等（1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
[0661] 除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序 列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列（例如，復(fù)制起點(diǎn)）和選擇性標(biāo)記基因。選擇 性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞（參見(jiàn)，例如，Axel等的美國(guó)專利 No. 4, 399, 216,4, 634, 665和5, 179, 017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿 主細(xì)胞帶來(lái)抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉 酸還原酶（DHFR)基因（在dhfr-宿主細(xì)胞中用于氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增）和neo基因（用 于G418選擇）。
[0662] 為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì) 胞中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種 技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真 核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中 表達(dá)該抗體，因?yàn)檫@樣的真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌正 確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，原核表達(dá)抗體基因無(wú)法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體 (Boss，M. A?和 Wood，C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
[0663] 用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0細(xì) 胞）（包括 Urlaub 和 Chasin，（1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220 中描述的 dhfr-CHO細(xì)胞，和DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，例如，如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601-621所述）、NS0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，用于NSO骨 髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是WO 87/04462、W0 89/01036和EP 338, 841公開(kāi)的GS基 因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)將宿主 細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主 細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的時(shí)間，而產(chǎn)生抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗 體。
[0664] 抗體與抗原結(jié)合的表征
[0665] 通過(guò)（例如）標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以檢測(cè)本發(fā)明的抗體與H)-L1的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用 0. 25 ii g/ml的純化H)-L1在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5 %牛血清白 蛋白封閉。向各個(gè)孔中加入抗體的稀釋液（例如，來(lái)自PD-Ll免疫小鼠的血漿的稀釋液）， 并且在37°C下溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，之后和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二 試劑（例如，對(duì)于人抗體，為山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑）一起在37°C下溫育1小 時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用PNPP底物（lmg/ml)顯色，并且在OD 405-650下分析。優(yōu)選地，用表 現(xiàn)出最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。
[0666] 如上所述的ELISA分析也可以用來(lái)篩選表現(xiàn)出與H)-L1免疫原有陽(yáng)性反應(yīng)性的雜 交瘤。將與ro-Li高親合力結(jié)合的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個(gè)雜交瘤中選 擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個(gè)克?。ㄍㄟ^(guò)ELISA)，制備5-10小瓶細(xì)胞庫(kù)，保存在-140°C下， 用于抗體純化。
[0667] 為了純化抗-PD-Ll抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶 中生長(zhǎng)。過(guò)濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ)進(jìn) 行親和層析。通過(guò)凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成 PBS，并且使用1. 43的消光系數(shù)根據(jù)OD28tl確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80°C 下保存。
[0668] 為了確定選擇的抗-PD-Ll單克隆抗體是否與獨(dú)特表位結(jié)合，可以使用商售試劑 (Pierce，Rockford，IL)將每種抗體生物素化。可以使用如上所述的H)-L1包被的ELISA 板，應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)研究?？梢允褂面溍箍股?素蛋白-堿性磷酸酶探針檢測(cè)生物素化mAb的結(jié)合。
[0669] 為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對(duì)特定同種型抗體具有特異性的試劑進(jìn) 行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4°C下用I y g/ml抗人免疫球 蛋白包被微量滴定板的孔過(guò)夜。用1% BSA封閉之后，平板與I y g/ml或更少的測(cè)試單克隆 抗體或純化的同種型對(duì)照物在室溫下反應(yīng)1-2小時(shí)。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異 性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針?lè)磻?yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。
[0670] 可以通過(guò)Western印跡法進(jìn)一步檢測(cè)抗-PD-Ll人IgG與F1D-Ll抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn) 要地說(shuō)，制備ro-Li并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測(cè)的單克隆抗體探查。人IgG的結(jié)合 可以用抗人IgG堿性磷酸酶檢測(cè)，并用BCIP/NBT底物片（Sigma Chem. Co.，St. Louis，Mo.) 顯色。
[0671] 抗體的物理件質(zhì)
[0672] 本發(fā)明的抗體可以進(jìn)一步通過(guò)抗I3D-Ll抗體的各種物理性質(zhì)進(jìn)行表征?？梢岳?各種試驗(yàn)基于這些物理性質(zhì)檢測(cè)和/或區(qū)分不同類別的抗體。
[0673] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中含有一個(gè)或多個(gè)糖 基化位點(diǎn)。可變區(qū)中一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的存在可能由于抗原結(jié)合改變而導(dǎo)致抗體的 免疫原性提高或者抗體的pK改變（Marshall等（1972)Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 和 Morrison SL(2004)J Immunol 172 :5489-94 ;Wallick 等人（1988)J Exp Med 168 :1099-109 ;Spiro RG (2002) Glycobiology 12 :43R-56R ;Parekh等（1985) Nature 316 : 452-7 ;Mimura 等人（2000) Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有 N-X-S/T 序列的 基序處發(fā)生?？勺儏^(qū)糖基化可以用Glycoblot試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，該試驗(yàn)切割抗體，產(chǎn)生Fab，然 后利用測(cè)定高碘酸鹽氧化和席夫堿形成的試驗(yàn)檢測(cè)糖基化。或者，可變區(qū)糖基化也可以用 Dionex光層析法（Dionex-LC)檢測(cè)，該方法從Fab上切下糖成為單糖，并且分析各個(gè)糖的含 量。在某些情況中，優(yōu)選不含可變區(qū)糖基化的抗-PD-Ll抗體。這可以通過(guò)選擇在可變區(qū)中 不含糖基化基序的抗體或者利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變糖基化基序內(nèi)的殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0674] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不含天冬酰胺異構(gòu)化位點(diǎn)。脫酰胺或異天 冬氨酸作用可以分別在N-G或D-G序列上發(fā)生。脫酰胺或異天冬氨酸作用導(dǎo)致產(chǎn)生異天冬 氨酸，這通過(guò)在側(cè)鏈羧基末端而不是在主鏈上產(chǎn)生扭結(jié)的結(jié)構(gòu)而降低了抗體的穩(wěn)定性。異 天冬氨酸的產(chǎn)生可以用iso-quant試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，該試驗(yàn)利用反相HPLC檢測(cè)異天冬氨酸。
[0675] 每種抗體具有獨(dú)特的等電點(diǎn)（pi)，但是通?？贵w落入6至9. 5的pH范圍內(nèi)。IgGl 抗體的Pl -般落入7-9. 5的pH范圍內(nèi)，IgG4抗體的pi -般落入6-8的pH范圍內(nèi)?？?體可以具有該范圍之外的pi。盡管這種作用通常未知，但是推測(cè)Pl落于正常范圍之外的 抗體在體內(nèi)條件下可能具有一定的解折疊和不穩(wěn)定性。等電點(diǎn)可以用毛細(xì)管等電聚焦試 驗(yàn)來(lái)測(cè)定，該試驗(yàn)產(chǎn)生PH梯度，并且可以利用激光聚焦來(lái)提高精確性（Janini等（2002) Electrophoresis 23 :16〇5_11 ;Ma 等（2OOl)Chromatographia 53 :S75-89 ;Hunt 等（I"8) J Chromatogr A 800:355-67)。在某些情況中，優(yōu)選pi值落入正常范圍內(nèi)的抗H)-L1抗 體。這可以通過(guò)選擇Pl位于正常范圍內(nèi)的抗體或者通過(guò)利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變 帶電荷的表面殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0676] 每種抗體的烙解溫度指示熱穩(wěn)定性（Krishnamurthy R和Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3 :361-71)。較高的熱穩(wěn)定性表示在體內(nèi)有較高的總體抗體穩(wěn)定性?？?體的熔點(diǎn)可以用諸如差示掃描量熱法（Chen等（2003)Pharm Res 20 :1952-60 ;Ghirlando 等（1999) Immunol Lett 68 :47-52)等技術(shù)來(lái)測(cè)量。Tm表示抗體最初解折疊的溫度。Tm2表 示抗體完全解折疊的溫度。通常，優(yōu)選地本發(fā)明的抗體的T m大于60°C，優(yōu)選大于65°C，甚 至更優(yōu)選大于70°C。此外，抗體的熱穩(wěn)定性也可以利用圓二色性來(lái)測(cè)量（Murray等（2002) J. Chromatogr Sci 40 :343-9)。本文公開(kāi)的抗F1D-Ll抗體的熱穩(wěn)定性總結(jié)在表1中。
[0677] 表 1
[0678]

【權(quán)利要求】
1. 一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括： (a) 包含具有選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重鏈可變 區(qū)；和 (b) 包含具有選自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)； 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合ro-Li。
2. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :1所示的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :11所示的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)； 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合ro-Li。
3. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :2所示的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :12所示的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)； 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合ro-Li。
4. 一種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性地結(jié)合人ro-Li且表現(xiàn)出至少一種 以下性質(zhì)： (a) 以1 X 1(T7M或更低的KD與人PD-L1結(jié)合； (b) 在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)試驗(yàn)中提高T細(xì)胞增殖； (c) 在MLR試驗(yàn)中提高干擾素產(chǎn)生；或 ⑷在MLR試驗(yàn)中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
5. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體或其抗原結(jié)合部分交叉 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人H)-L1，所述參比抗體或其抗原結(jié)合部分包括： (a) 包含具有選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重鏈可變 區(qū)；和 (b) 包含具有選自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)。
6. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-18種系基因的重鏈可變區(qū)；和 (b) 源自人VK L6種系基因的輕鏈可變區(qū)； 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分與ro-Li特異性結(jié)合。
7. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-69種系基因的重鏈可變區(qū)；和 (b) 源自人VK L6種系基因的輕鏈可變區(qū)； 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分與ro-Li特異性結(jié)合。
8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在制備用于抑制受試者中的 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途。
9. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在制備用于治療受試者中的 傳染病的藥物中的用途。
10. -種制備抗-PD-L1抗體的方法，包括： (a) 提供編碼抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含：（i)包含 具有選自SEQ ID勵(lì)：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū) CDR1、具有選自SEQ ID勵(lì)：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的序列的氨基酸的重鏈可 變區(qū)CDR2、和具有選自SEQ ID N0:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的序列的氨基酸的 重鏈可變區(qū) CDR3;或（ii)包含具有選自 SEQ ID 勵(lì)：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60 的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)CDR1、具有選自SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和70的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)CDR2、和具有選自SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、 78、79和80的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)CDR3 ; (b) 改變編碼至少一種可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基的核酸以產(chǎn)生編碼包含至少一 個(gè)氨基酸改變的經(jīng)改變的抗體序列或其抗原結(jié)合部分； (c) 表達(dá)所述改變的抗體序列或其抗原結(jié)合部分為蛋白質(zhì)；和 (d) 評(píng)估所述改變的抗體序列或其抗原結(jié)合部分的結(jié)合活性， 其中所述改變的抗體序列或其抗原結(jié)合部分以1 X 1(T7M或更低的KD與人ro-Li特異 性結(jié)合。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104356236SQ201410639719
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2005年7月1日
【發(fā)明者】A·J·科曼, M·J·塞爾比, 王常宇, M·斯里尼瓦桑, D·B·帕斯莫爾, 黃海春, 陳海斌 申請(qǐng)人:梅達(dá)雷克斯有限責(zé)任公司