一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系及應(yīng)用。本發(fā)明提供了猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8,CCTCCNO：C2014207。該細(xì)胞系蛋白表達(dá)量高，雞防御素8表達(dá)量高達(dá)203.1ng/ml，傳代穩(wěn)定。本發(fā)明的細(xì)胞系可用于制備抑菌藥物，特別是制備家禽抗菌類(lèi)的生物制品，將該防御素用于雞疾病防治中，治療效果顯著，安全無(wú)毒，具有廣泛的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步研究其抗菌活性、抗菌機(jī)理及其在獸用生物制品中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。CCTCC NO:C20142072014.11.07
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御轟8的細(xì)胞系及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì) 胞系及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 我國(guó)是禽類(lèi)產(chǎn)品出口大國(guó)，養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展不僅關(guān)系到廣大養(yǎng)殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)利 益，還關(guān)系到國(guó)民的身體健康。然而，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致檢測(cè)出藥物殘留量超標(biāo)，嚴(yán)重 威脅食品安全問(wèn)題，同時(shí)也產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，該給養(yǎng)禽業(yè)的疾病防控和治療工作帶 來(lái)了嚴(yán)重的阻礙。為了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，我們亟需尋找到一種新的途徑或者新的方法，防 止耐藥性的出現(xiàn)和食品安全等問(wèn)題。因此尋找和開(kāi)發(fā)無(wú)耐藥性的新型抗菌藥物具有非常重 要的現(xiàn)實(shí)意義（Miyasaki，1998)。
[0003] 防御素（defensin)又名嗜中性多膚（Neutrophil Peptides, NP)，是一類(lèi)對(duì)抗外 源性病源菌的防御性膚類(lèi)活性物質(zhì)，是生物機(jī)體免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，在動(dòng)物、植 物、昆蟲(chóng)體內(nèi)廣泛存在，具有廣譜抗菌功能（Tang, 1999)。研究表明，各種防御素對(duì)革蘭氏 陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、分枝桿菌、霉菌、真菌、囊膜病毒及腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用 (Salzman，2003)。Gallinacin是廣泛存在于雞體內(nèi)的一種目-防御素，在雞防御系統(tǒng)中有 重要作用，具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性和廣泛的抗菌譜，提示我們可W將其開(kāi)發(fā)為一種新的抗 微生物制劑。因此，雞防御素的成功獲取能帶來(lái)極大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。但雞體內(nèi)天然防御 素表達(dá)量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成防御素成本又太高，所W利用基因工程技術(shù)重 組表達(dá)外源基因已成為獲取目標(biāo)蛋白的有效途徑之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供了一種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8 (Gallinacin-8,本發(fā)明 或稱(chēng)Ga^8)的細(xì)胞系，該細(xì)胞系已于2014年11月7日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也進(jìn)行 保藏，分類(lèi)命名；猴胎腎細(xì)胞MARC145Akd-8,保藏編號(hào)；CCTCC NO ;C2014207,地址；中國(guó)武 漢武漢大學(xué)。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了猴胎腎細(xì)胞MRC145/Gal-8細(xì)胞系表達(dá)的重組 雞防御素8,該防御素具有顯著的抗菌活性，安全性好。
[0006] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供了猴胎腎細(xì)胞MRC145/Gal-8細(xì)胞系在制備抑 菌藥物中的應(yīng)用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的應(yīng)用，還包括用于制備家禽生物 藥品中的應(yīng)用，特別是在制備雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0008] -種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系，其制備方法如下：
[000引 （1)從15日齡的仔雞體內(nèi)采集新鮮的雞腎組織，提取雞組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄的CDNA 產(chǎn)物用0化36 1371：處理20111111^去除基因組0臟污染；
[0010] (2)根據(jù)雞防御素8基因序列，PCR擴(kuò)增雞防御素8,設(shè)計(jì)引物如下：
[0011] P8-1 ;5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0012] P8-2 ;5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0013] (3)用EcoR I和BamH I雙酶切雞防御素8和PIRES2-EGFP，將防御素8基因連 接到載體PIRES2-EGFP，獲得重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-GAk8,用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
[0014] (4)將復(fù)蘇后傳代3次的marc-145細(xì)胞W膜蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高 糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)成5 X IO5個(gè)/mL的密度，接種于若干個(gè)直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，于37C、 5%(：〇2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2化。待細(xì)胞融合至70%?80%時(shí)，按照^口〇'6(31311111162000 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，對(duì)照組不加脂質(zhì)體?；蟾鼡Q有血清、無(wú)雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4她后，開(kāi)始用600 y g/mL的G418進(jìn)行篩選，直至絕大部分細(xì)胞死 亡，維持篩選6周。將獲得的細(xì)胞采用極限稀釋法傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔大約1個(gè)細(xì) 胞，交替使用常規(guī)培養(yǎng)基和G418化OOy g/mL)培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，至其長(zhǎng)出單個(gè)克隆。在 英光顯微鏡下挑選出最優(yōu)的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，并不斷擴(kuò)繁至建立新的細(xì)胞系，得到穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-GAL-8的細(xì)胞系。該細(xì)胞系已于2014年11月7日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中也進(jìn)行保藏，分類(lèi)命名；猴胎腎細(xì)胞MRC145Akd-8,保藏編號(hào)；CCTCC N0;C2014207。 地址；中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0015] 它具有W下特征；（1)從形態(tài)上觀(guān)察，猴胎腎細(xì)胞MRC145/Gal-8形態(tài)比較規(guī)則， 呈近圓形，細(xì)胞折光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿(mǎn)，核質(zhì)清晰；(2)細(xì)胞易于消化、貼壁和傳代，最適在含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增時(shí)間為32h ; (3)能高效表達(dá)雞防御素8,具 有較好的抑菌活性，抑菌譜廣泛；（4)細(xì)胞傳代50次W上，仍可W穩(wěn)定遺傳Gal-8基因，穩(wěn) 定表達(dá)出雞防御素8。
[0016] 猴胎腎細(xì)胞MRC145/Gal-8細(xì)胞系在制備抑菌藥物中的應(yīng)用，包括在制備生物防 腐劑，生物抑菌劑中的應(yīng)用，所述的雞防御素8在作為生物防腐劑或抑菌劑時(shí)，將其涂布在 需防腐或抑菌的物體表面即可還包括用于制備家禽生物藥品中的應(yīng)用，特別是在制備治療 雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用，將其制備成各類(lèi)具有抑菌作用的劑型，直接用于家禽即 可。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下特點(diǎn)：
[0018] (1)本發(fā)明提供的真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP-GAL-8可W同時(shí)表達(dá)重組雞防御素 8和綠色英光蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行直觀(guān)、及時(shí)的觀(guān)察和檢測(cè)；能高效表達(dá)重組 雞防御素8,蛋白獲取方法簡(jiǎn)單，成本低。
[0019] (2)本發(fā)明提供的重組雞防御素8具有顯著的抗菌活性，安全性好，提供了一種新 的雞疾病防治中的抗菌藥物的方法及其在獸用生物制品中的應(yīng)用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為一種重組表達(dá)質(zhì)粒PIRES2-EGFP-GAL8PCR鑒定示意圖。
[0021] M, DL2000marker ;1, GAk8。
[002引 圖2為一種重組表達(dá)質(zhì)粒PIRES2-EGFP-GAL8酶切鑒定示意圖。
[0023] M, DL2000marker ; 1，ECORI 和 BamHI 雙酶切重組質(zhì)粒 PIRES2-EGFP-GAk8。
[0024] 圖3為一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GAkS基因的marcl45細(xì)胞示意圖。
[002引 A,未轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞；A':穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GAL-8基因的marcl45細(xì)胞。
[0026] 圖4為一種PIRES2-EGFP-GAL-8重組質(zhì)粒PCR穩(wěn)定性檢測(cè)示意圖。
[0027] 其中M，化2000marker ;1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組質(zhì)粒；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組質(zhì)粒； 3,連續(xù)培養(yǎng)50代重組質(zhì)粒。
[0028] 圖5為一種GAL-8蛋白表達(dá)的Western Blot鑒定示意圖。
[0029] 1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組蛋白；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組蛋白；3,連續(xù)培養(yǎng)50代重組蛋 白。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。在實(shí)施例中涉及的所有培 養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本實(shí)驗(yàn)所涉及的分子生物學(xué)方法為 常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩 姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。
[00引]實(shí)施例1 ;
[0032] -種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系，通過(guò)W下步驟篩選得到：
[0033] (1)雞腎組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0034] 從15日齡的仔雞體內(nèi)采集新鮮的雞腎組織，按照TRIz化Reagent試劑盒佑IBCO 公司）并按其說(shuō)明書(shū)提取雞組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄的CDNA產(chǎn)物用面ase I 37C處理20min W去除基因組DNA污染。
[00巧](2)雞防御素基因的制備：
[0036] 1)雞防御素8基因的制備：
[0037] 根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的雞防御素8基因的序列；GeneBank ;NM_001001781. 1 設(shè)計(jì)引物，
[0038] P8-1 ;5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0039] P8-2 ;5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0040] W步驟1)中的CDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為；20ymol/L的引物各IyL, 2. 5mmol/L 的 dNTPs 5uL，10Xbuffer 5uL，2. 5U/UL 的 Thq DNA 聚合酶 IyL,加 d地2〇 至50y L。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，56°C退火40s，72°C延伸45s，共30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，得到雞防御素8基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0041] (3)真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 1)真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP-GAL-8的構(gòu)建：
[0043] 用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、BamH I雙酶切載體PIRES2-EGFP和純化的GAkSPCR產(chǎn) 物。酶切體系如下：
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系，其特征在于：猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8， CCTCC NO ：C2014207〇
2. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞系表達(dá)的雞防御素。
3. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
4. 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系或權(quán)利要求2所述的雞防御素在制備抑菌藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備生物防腐劑中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備家禽抗菌生物制品中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104357399SQ201410649945
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】周莉, 譚本忠, 錢(qián)運(yùn)國(guó), 高其雙, 陳志華, 劉武, 彭霞, 盧順, 童偉文, 夏瑜, 王連芳 申請(qǐng)人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所