一種輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎纖維化模型的建立和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎纖維化模型的建立方法及應(yīng)用。具體技術(shù)方案為:用麻醉劑麻醉實(shí)驗(yàn)猴,并維持手術(shù)麻醉;實(shí)驗(yàn)猴腹部消毒后沿腹中線切開,打開腹腔;暴露手術(shù)視野,順沿單側(cè)輸尿管,在單側(cè)腎下緣處以手術(shù)絲線于輸尿管結(jié)扎兩道,完全阻斷該單側(cè)輸尿管;保留另一側(cè)腎臟不結(jié)扎,作為自體對(duì)照;消毒手術(shù)切口后分層縫合傷口;在結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn),采取生物樣品測(cè)量腎纖維化的指標(biāo);或取下左腎和右腎,于中性甲醛溶液中固定;甲醛固定腎樣本進(jìn)行組織切片和病理檢查。本發(fā)明的動(dòng)物模型具有現(xiàn)有嚙齒類和兔動(dòng)物模型無(wú)法實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用價(jià)值,本發(fā)明建立的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型在纖維化的各相關(guān)領(lǐng)域有廣泛的用途。
【專利說(shuō)明】一種輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎纖維化模型的建 立和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病的動(dòng)物模型建立,具體涉及一種輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 腎纖維化模型的建立方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟纖維化是一種病理生理改變,特征包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積、腎小 球硬化和間質(zhì)纖維化,是所有腎病的終末期表現(xiàn)。腎臟由于受到創(chuàng)傷、感染、炎癥、血循環(huán)障 礙、以及免疫反應(yīng)等各種致病因素刺激,造成細(xì)胞受損,引起腎實(shí)質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。巨噬細(xì) 胞釋放細(xì)胞因子促使腎小管凋亡和成纖維細(xì)胞活化增殖,而腎小管細(xì)胞凋亡和壞死造成腎 小管壞死和形成無(wú)小管腎小球。繼而引起腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞表型變化,產(chǎn)生大量肌成纖維細(xì)胞,造 成大量膠原沉積和積聚,使得腎實(shí)質(zhì)逐漸硬化,形成瘢痕,直至腎臟完全喪失功能。腎纖維 化通常是一個(gè)長(zhǎng)期的過程,發(fā)病可以見于任何年齡階段,成年人腎纖維化的主要原因是肥 胖,糖尿病和高血壓,其他原因包括腎毒性藥物和感染等等。
[0003] 目前腎纖維化的動(dòng)物模型通常建立在嚙齒類和兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上,但是,由于這些實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)化關(guān)系、腎臟的組織結(jié)構(gòu)和生化、以及造成的腎纖維化病變等與人類相距甚遠(yuǎn), 以其為研宄對(duì)象所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義不大。實(shí)踐表明,使用嚙齒類動(dòng)物和兔 腎纖維化模型產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在臨床實(shí)驗(yàn)中很難得到驗(yàn)證,以此模型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行藥物 開發(fā)的成功率亦較低。非人靈長(zhǎng)類的解剖特點(diǎn)、各系統(tǒng)生理生化功能、病理變化、疾病癥狀、 以及對(duì)治療藥物的反應(yīng)性等與人類極為相近,是進(jìn)行腎纖維化相關(guān)疾病研宄、治療、和進(jìn)行 藥物臨床前有效性和安全性評(píng)價(jià)的敏感動(dòng)物。
[0004] 隨著腎纖維化發(fā)病分子細(xì)胞機(jī)制研宄的不斷深入,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)多種抗腎纖維 化的新藥靶點(diǎn)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的親緣相近,靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和生物系統(tǒng)相似,可以提供 很好的交叉反應(yīng)性。因此建立非人靈長(zhǎng)類腎纖維化模型可以滿足腎纖維化治療藥物臨床前 評(píng)價(jià)的迫切需要,利用模型對(duì)腎纖維化研宄的數(shù)據(jù)、對(duì)腎纖維化疾病診斷和治療方案的評(píng) 估等具有重要的臨床應(yīng)用指導(dǎo)意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明建立了一種單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎纖維化模型的方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007] a、麻醉實(shí)驗(yàn)猴,局部手術(shù)消毒后沿腹中線切開,打開腹腔,暴露手術(shù)視野;
[0008] b、順沿單側(cè)輸尿管,在單側(cè)腎下緣處以手術(shù)絲線于輸尿管結(jié)扎兩道,完全阻斷該 側(cè)輸尿管;
[0009] c、消毒手術(shù)切口后分層縫合傷口;
[0010] d、在不同時(shí)間點(diǎn),采取樣品(血液、尿液、組織等)測(cè)量腎纖維化的指標(biāo);
[0011] e、或取下左腎和右腎,于中性甲醛溶液中固定,進(jìn)行組織切片和病理檢查;
[0012] 本發(fā)明的模型建立方法是利用猴子,結(jié)扎其單側(cè)輸尿管來(lái)誘導(dǎo)腎纖維化過程,同 時(shí)保留另一側(cè)腎臟的正常功能,作為自體對(duì)照,提供了正常腎臟纖維化水平的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同 嚙齒類動(dòng)物以及兔相比,猴輸尿管結(jié)扎后誘導(dǎo)的腎臟纖維化病變較為緩慢,其病理改變同 人腎纖維化的病理特征相似,更符合人類腎纖維化病變過程。由于本方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎病 病變隨時(shí)間慢性發(fā)展,該猴模型可以在不同病程時(shí)建立觀察點(diǎn),以利于纖維化病的研宄和 評(píng)估抗纖維化藥物的效果。另外,該誘導(dǎo)的猴模型在建立單側(cè)腎臟纖維化的不同病程時(shí),可 以手術(shù)摘除另一側(cè)腎,使該猴依靠單側(cè)纖維化的腎臟功能,則該模型可以直接用于腎纖維 化病、腎功能缺失補(bǔ)償及替代、以及抗纖維化藥物的研宄和評(píng)估。
[0013] 本發(fā)明結(jié)合中國(guó)實(shí)驗(yàn)獼猴動(dòng)物大量存欄的現(xiàn)狀,在反復(fù)研宄積累經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 創(chuàng)新使用食蟹猴(Macacafascicularis)作為非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,經(jīng)單側(cè)輸尿管結(jié)扎成 功誘導(dǎo)產(chǎn)生腎纖維化病變。經(jīng)病理切片檢查驗(yàn)證,本方法可重復(fù)性地在實(shí)驗(yàn)猴腎中誘導(dǎo)出 與人相似的典型的腎纖維化病變。
[0014] 本發(fā)明所提供的一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)腎纖維化模型的建立 方法,優(yōu)選的是:創(chuàng)新的使用食蟹猴(Macacafascicularis)作為非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0016] 本發(fā)明的動(dòng)物模型具有現(xiàn)有嚙齒類和兔動(dòng)物模型無(wú)法實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用價(jià)值:
[0017]a、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在解剖特點(diǎn)、各大生理功能和生化系統(tǒng)、以及病理變化等方面 與人類極為相近;
[0018]b、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的生物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和生物調(diào)控與人類相似,可為藥物特異性 (如抗體,核酸,蛋白類藥物技術(shù)等)作用靶點(diǎn)提供很好的交叉反應(yīng)性;
[0019]c、本模型產(chǎn)生的腎纖維化與人類腎纖維化在病程、病理改變等諸方面有高度的相 似性;
[0020]d、采用中國(guó)猴場(chǎng)大量繁育的實(shí)驗(yàn)用猴,質(zhì)量控制嚴(yán)格,遺傳背景清楚,來(lái)源豐富。
[0021] 本發(fā)明建立的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型在腎纖維化的各相關(guān)領(lǐng)域有廣泛的用途,例 如:
[0022]a、在腎纖維化疾病研宄領(lǐng)域,可利用模型進(jìn)行腎纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)病機(jī)制、診 斷、生物識(shí)別、病理變化、和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研宄;
[0023]b、在纖維化疾病研宄領(lǐng)域,可利用模型進(jìn)行纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制、病程進(jìn)展、預(yù) 后、生物識(shí)別、病理特征、和藥物靶標(biāo)研宄;
[0024]c、在腎纖維化疾病的干預(yù)方法研宄和開發(fā)以及電子媒介領(lǐng)域,可利用模型的發(fā)病 率、發(fā)病程度、和發(fā)病特征,進(jìn)行腎纖維化疾病的預(yù)防、治療、護(hù)理等各類方法、技術(shù)、裝置等 進(jìn)行可行性研宄;
[0025]d、在纖維化疾病的藥物研宄和開發(fā)領(lǐng)域,可利用模型的發(fā)病率、發(fā)病程度、和發(fā)病 特征,對(duì)新藥進(jìn)行評(píng)價(jià)和藥效評(píng)估等;
[0026]e、利用模型的材料(如組織、血樣、基因、數(shù)據(jù)等)建立腎纖維化疾病研宄相關(guān)的 數(shù)據(jù)庫(kù)、基因庫(kù)、材料庫(kù)等。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1輸尿管結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟病理切片。
[0028] 圖2計(jì)算機(jī)輔助分析纖維化組織在整張腎臟病理切片中所占面積的比例。
[0029] 圖3通過質(zhì)譜法測(cè)定腎臟中羥脯氨酸含量(ug/mg腎臟蛋白)。
[0030] 以下通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述,但并不限制本發(fā)明,本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形,只要不脫離本發(fā)明的精神,均應(yīng)屬于本 發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 為了可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述 本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0032] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取3只食蟹猴(Macacafascicularis,雄性,3歲,體重3-4千克);
[0033] 實(shí)驗(yàn)方法:
[0034] a.選取3只7周歲左右、體重5kg左右的雄性實(shí)驗(yàn)猴用于模型;
[0035] b.用氯胺酮注射液按3ml/kg劑量肌注麻醉實(shí)驗(yàn)猴,以5% -10%異氟烷吸入維持 麻醉;
[0036] c.實(shí)驗(yàn)猴腹部剃毛消毒后沿腹中線切開,打開腹腔,暴露手術(shù)視野后;
[0037] d.順沿左側(cè)輸尿管,在左腎下緣處以手術(shù)絲線于左側(cè)輸尿管結(jié)扎2道,完全阻斷 左側(cè)輸尿管;
[0038] e.消毒手術(shù)切口后,分層縫合傷口;
[0039] f.手術(shù)后第1、2、4周,取左腎和右腎部分組織樣本,測(cè)定腎臟組織中的羥脯氨酸 含量:
[0040] 首先測(cè)定腎臟組織的蛋白含量,取含有Img蛋白量的腎臟組織,以6M的鹽酸95度 水解過夜,離心去除沉淀后,取上清液用質(zhì)譜法測(cè)定羥脯氨酸含量:
[0041] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與右腎比較,結(jié)扎的左腎臟組織中的羥脯氨酸的含量(ug/mg腎臟蛋 白)在4周時(shí)明顯增高,標(biāo)示纖維化含量增加:
[0042]
【權(quán)利要求】
1. 建立一種單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎纖維化模型的方法,所述模型建 立方法為:用麻醉劑麻醉實(shí)驗(yàn)猴,并維持麻醉,實(shí)驗(yàn)猴腹部消毒后沿腹中線切開,打開腹腔 暴露手術(shù)視野,順沿單側(cè)輸尿管,在單側(cè)腎下緣輸尿管處以手術(shù)絲線結(jié)扎兩道,完全阻斷 該側(cè)輸尿管,消毒手術(shù)切口后分層縫合傷口,在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn),采取生物樣品和組織樣品 測(cè)量腎纖維化的指標(biāo),或取左腎和右腎進(jìn)行組織切片和病理檢查。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作為 非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:使用單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)建立非人靈長(zhǎng)類 腎纖維化。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:在單側(cè)輸尿管結(jié)扎后的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量評(píng) 估腎纖維化的程度。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:在單側(cè)輸尿管結(jié)扎后的不同時(shí)間點(diǎn),摘除另 一側(cè)腎臟,以測(cè)量評(píng)估單側(cè)纖維化腎臟的功能。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述動(dòng)物是非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,如恒河猴 (Macaca mulatta)和狨猴(Marmoset)。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法在腎纖維化研宄和實(shí)驗(yàn)性干預(yù)中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于:使用生物和組織采樣測(cè)量、影像學(xué)檢查、病 理檢查方法評(píng)估腎疾病程度以及發(fā)病、恢復(fù)、和復(fù)發(fā)等各期的標(biāo)準(zhǔn)。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于:評(píng)估疾病程度的電子存儲(chǔ)媒介中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于:評(píng)價(jià)任何一種技術(shù)、方法、裝置在診斷或干 預(yù)腎纖維化疾病中的應(yīng)用。
11. 如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用,其特征在于:所述的技術(shù)、方法、裝置是腎功能缺失補(bǔ) 償和維護(hù)技術(shù)或裝置、診斷指標(biāo)、生物標(biāo)示物、化合物、治療或預(yù)防藥物。
12. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于:利用模型的材料(如組織、血樣、基因、數(shù) 據(jù)等)建立腎纖維化疾病研宄相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)、基因庫(kù)、材料庫(kù)。
【文檔編號(hào)】A61B19/00GK104473703SQ201410658685
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】倪佳, 劉俊娥, 馮建明, 邢志霄, 周業(yè)明, 崔國(guó)強(qiáng), 鄧?yán)^林, 宋之戰(zhàn), 張紅 申請(qǐng)人:上海浦靈生物科技有限公司