一種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2(CgCLec-2)重組蛋白的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2(CgCLec-2)的應(yīng)用。長牡蠣C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制備抑菌劑或飼料添加劑。本發(fā)明中體外重組表達(dá)的長牡蠣凝集素-2(CgCLec-2)蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有抑制生長作用，作為一種有效的模式識別受體，在開發(fā)抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價值。
【專利說明】一種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)重組 蛋白的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集 素-2 (CgCLec-2)的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 長牡蠣是一種重要的海水養(yǎng)殖貝類，在中國沿海均有分布。牡蠣養(yǎng)殖業(yè)在我國沿 海經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展中占據(jù)舉足輕重的地位，并具有巨大的發(fā)展前景。由于各種微生物引起的 多種疾病在長牡蠣的養(yǎng)殖群體中不斷爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對長牡蠣開展免 疫防御機(jī)制研宄將有助于人類對其病害進(jìn)行有效防控和治療。
[0003] 長牡蠣作為軟體動物的代表，以其特殊的進(jìn)化地位，得到人們越來越多的關(guān)注。由 于缺乏適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，長牡蠣主要依賴固有免疫系統(tǒng)抵御外源病原微生物的侵染。 海洋環(huán)境中存在著大量的微生物群，宿主識別有害非己成分的能力顯得尤為重要。C型凝集 素作為一類重要的模式識別受體，能夠識別表達(dá)在微生物細(xì)胞表面的病原相關(guān)分子模式， 在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可或缺的作用。
[0004] C型凝集素是一類包含有糖類識別結(jié)構(gòu)域（CRD)并且以鈣離子依賴的形式識別并 結(jié)合糖類的蛋白。I860年，研宄人員報道了蛇毒凝集素的凝集活性。隨著對C型凝集素的 深入研宄，越來越多的證據(jù)表明，C型凝集素不僅作為模式識別分子在固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中 起作用，同時也作為效應(yīng)分子抵御病原微生物的入侵。它不僅可以識別并結(jié)合入侵病原，并 且具有促吞噬，結(jié)節(jié)形成及激活補(bǔ)體等功能。C型凝集素的抑菌活性首先在小鼠中發(fā)現(xiàn)，隨 后文昌魚中也有類似報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的在于提供一種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)重組蛋 白的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)重組蛋白的應(yīng)用，長牡蠣C 型凝集素-2 (CgCLec-2)基因用于制備抑菌劑或飼料添加劑。
[0008] 所述長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因用于制備抑制抗金黃色葡萄球菌的抑 菌劑。
[0009] 所述長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示。
[0010] 制備方法：
[0011] (1)用特定引物Pl和P2對長牡蠣C型凝集素CgCLec-2編碼區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增；
[0012] Pl :5, -CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3，
[0013] P2 :5' -CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3'
[0014] (2)采用BamH I和Hind III對上述的重組子及pET32a載體進(jìn)行酶切，酶切片段通 過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組子；
[0015] (3)將上述構(gòu)建重組子轉(zhuǎn)入Transetta DE3表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白CgCLec-2。本發(fā)明所具有的優(yōu) 占.
[0016] 本發(fā)明中體外重組表達(dá)的長牡蠣凝集素-2(CgCLec-2)蛋白對革蘭氏陽性菌金黃 色葡萄球菌有抑制生長作用，作為一種有效的模式識別受體，在開發(fā)抗菌類藥物、新型免疫 制劑以及飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)時例提供的長牡蠣重組蛋白rCgCLec-2以鈣離子依賴的形式識別 并結(jié)合PAMPs。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的長牡蠣重組蛋白rCgCLec-2對金黃色葡萄球菌生長的 影響。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面的實(shí)驗(yàn)例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 長牡蠣凝集素-2(CgCLec-2)基因編碼區(qū)的體外原核重組表達(dá)，包括下列步驟：
[0022] 1、重組載體的構(gòu)建
[0023] 本發(fā)明中采用的重組載體為pET_32a原核表達(dá)載體。
[0024] 通過PCR技術(shù)，采用5'末端分別添加了 Bam H I和Hind HI特定酶切位點(diǎn)的基因 特異性引物，對長牡蠣C型凝集素CgCLec-2編碼區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增：
[0025] 基因特異性引物為：
[0026] Pl(5' -CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3' ）：
[0027] P2 (5' -CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3'），
[0028] 反應(yīng)條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94°C變性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸45秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增片段純化回收， 與PMD19-T載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒；使用BamH I和Hind III兩個酶酶 切質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回 收；回收目的片段與經(jīng)BamH I和Hind III兩個酶酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，完成載體 的構(gòu)建。上述實(shí)驗(yàn)操作的具體方法請參照《分子克隆第三版》。
[0029] 2、重組蛋白CgCLec-2的表達(dá)
[0030] 將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Transetta(DE3)中，并篩選陽性克隆，測序 確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于200mL的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至 OD 600 = 0.4-0.8。加入IPTG，使終濃度達(dá)到lmmol L-1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4°C，5000rpm， 離心10分鐘，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離心，棄去上清后，加入80 y L水和 20 y L的5倍的蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物。
[0031] 3、重組蛋白CgCLec-2的純化與復(fù)性
[0032] 本發(fā)明中重組蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF柱純化。獲得了變性重組蛋白，用透析緩 沖液透析復(fù)性。
[0033] 具體操作步驟如下：
[0034] 鎳瓊脂糖凝膠柱純化分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白變性狀態(tài)下蛋白純化步驟如下：
[0035] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，I. 6 X 20cm，柱床體積為IOmL ;
[0036] (2)用緩沖液 I (緩沖液 I 為 50mmol L-ITris-Hcl 緩沖液，pH = 7. 4, 50m mol L-INaCl, 8mol L-I尿素）平衡2-5個床體積，流速為2mL min-1 ;
[0037] (3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用緩沖液I重懸，150瓦超聲破碎30分鐘，12000轉(zhuǎn)， 4°C離心30分鐘，上清液用0. 45 y m濾膜過濾后，過柱，流速為ImL min-1 ;
[0038] (4)用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2mL min-1 ;
[0039] (5)用含有50mmol L-I咪唑的緩沖液I再洗2-5個柱床體積，流速為2mL min-1 ; [0040] (6)用含400mmol L-I咪唑的緩沖液I洗脫目的蛋白，收集。
[0041] (7)用SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達(dá)；
[0042] (8)用純水流洗5個柱床體積，再用20 %的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2mL min-1，柱子置于4°C環(huán)境中保存變性狀態(tài)下提純的重組蛋白需要在適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中通 過透析除去尿素，使蛋白重新正確折疊，恢復(fù)正確構(gòu)象。變性純化產(chǎn)物經(jīng)2mM的還原谷胱 甘肽、0.2mM 氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HClUOOmM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及 梯度降低的尿素透析復(fù)性，尿素濃度從起始的6M逐漸替換到4M、3M、2M、1M、0M，最后一次透 析至無尿素的透析液時不加甘油。每次在4°C透析12h，即得到SEQ ID NO. 1所示的長牡蠣 CgCLec-2基因重組蛋白。
[0043] SEQ ID NO. 1
[0044] MDTEVTSLQDKYTDQKDNITDLGDTLKILLREQEWMVSNVSELHGKMQEMRDATLVIHQQVSEQLNHTE DSLRRFFVESFQNITNEYFENLQNISKQNVTSSLFEVVFKQANAAVALKEEIRKYALMMERLQFEISELKQNITLNK GTPSSPVTCPVGWSMFETSCYMAFNQQLSWNDASMKCLMSGSKLVEIETKAENDFLTTTLPNFKAGEAYWTGGKDDV TEGLWVWISSGATFGFLNWNQGEPNDAGGIEDC LQLYKRRGRKTYffNDNYCERSFNFICEQTL
[0045] ?長度：286個氨基酸
[0046] ?類型：氨基酸
[0047] ?鏈型：單鏈
[0048] ?特性：分子量為33kDa，等電點(diǎn)為4. 75,具有一個保守的CRD結(jié)構(gòu)域。
[0049] ?來源：長牡蠣
[0050] 實(shí)施例2
[0051] 長牡蠣重組蛋白rCgCLec-2以鈣離子依賴的形式識別并結(jié)合糖類
[0052]將20 y g的LSP，PGN和MAN分別溶于50mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中（pH 9. 6)， 每孔100^包被酶標(biāo)板，41：過夜。為了避免非特異性結(jié)合加入200 ^3%854,371：封閉 Ih。之后，每孔加入IOOy L 2倍梯度稀釋的重組蛋白rCgCLec-2,在加入終濃度為IOmM Ca2+ 或者不加入Ca2+的條件下18°C孵育3h。加入100 y L用3% BSA稀釋的大鼠抗rCgCLec-2 的多克隆抗體（l:l〇〇〇)，37°C孵育lh。加入IOOyL HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(l:3000)， 37°C孵育lh。每次孵育步驟之間用TBST洗3次，每次5min。二抗孵育并徹底清洗結(jié)束后， 每孔加入100 U L TMB，避光發(fā)色30min后，加入50 y L 2M NaOH終止發(fā)色，酶標(biāo)儀405nm處 讀取并記錄數(shù)值。設(shè)rTrx蛋白陰性對照組和TBS空白對照組。每個樣品設(shè)三個重復(fù)，根據(jù) 3次測定結(jié)果取平均值作圖（參見圖1)。數(shù)據(jù)分析時，實(shí)驗(yàn)組（P)-空白對照（B)/陰性對 照組（N)-空白對照（B) >2. 1的孔視為陽性（參見圖1)。實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白CgCLec-2在 沒有鈣離子的條件下，LPS，PGN和MN的P/N都小于2. 1，表明對該三類糖都沒有結(jié)合能力 (參見圖1.A);重組蛋白rCgCLec-2在IOmM鈣離子存在的條件下當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?7yg I71 時，LPS孔的P/N值為3. 37,當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?. 12 y g I71時，PGN孔的P/N值為2. 23,當(dāng)?shù)鞍?濃度為68 y g I71時，MN孔的P/N值為3. 95。隨著蛋白濃度的升高，各個PAMPs的P/N值 逐漸變大，表明對糖的結(jié)合能力逐漸增強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)表明重組rCgCLec-2蛋白對糖類的識別 和結(jié)合有鈣離子依賴性。
[0053] 實(shí)施例3
[0054] 長牡蠣重組蛋白rCgCLec-2的抑菌活性
[0055] 1、微生物的培養(yǎng)及制備
[0056] 金黃色葡萄球菌用LB培養(yǎng)基37 °C，220rpm，培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，用 Tris-HCl(50mmol L_l，pH = 8. 0)稀釋菌體，使其每毫升菌液中的菌落數(shù)約為1X103CFU。
[0057] 2、重組蛋白CgCLec-2抑菌活性測定
[0058] 對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌離心收集后用TBS (50mM Tris-Hcl，150mM NaCl)清 洗重懸（IO4CFU)。50 y L的長牡蠣重組蛋白CgCLec-2與等體積的金黃色葡萄球菌重懸液在 CaCl2終濃度IOmM的條件下室溫孵育2h。取20 y L上述混合物于平底96孔板（Costar， Fisher)中，每孔加入200 y L LB液體培養(yǎng)基，于酶標(biāo)儀中37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih分別檢測 記錄各孔0D600值。另設(shè)rTrx蛋白對照組和TBS空白對照組。每個樣品設(shè)三個重復(fù)，根據(jù) 3次測定結(jié)果取平均值作圖（參見圖2)。實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白CgCLec-2在沒有鈣離子的條件 下對LPS，PGN和MAN的P/N值〈2. 1，表明沒有結(jié)合能力（參見圖LA);重組蛋白CgCLec-2 在IOmM的鈣離子存在的條件下隨著。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有抑菌活性的長牡蠣c型凝集素-2 (CgCLec-2)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：長牡蠣C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制備抑菌劑或飼料添加劑。
2. 按權(quán)利要求1所述的所述的具有抑菌活性的長牡蠣C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因 重組蛋白的的應(yīng)用，其特征在于：所述長牡蠣C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制備抑制 抗金黃色葡萄球菌的抑菌劑。
【文檔編號】A61K38/36GK104474557SQ201410686778
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】宋林生, 李慧, 張峘, 王玲玲 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所