表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法
【專(zhuān)利摘要】一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,包括如下步驟:鼠尾膠原的制備、人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備與觀察、復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備與觀察。本發(fā)明證實(shí)了在體外利用復(fù)方殼多糖組織工程皮膚和凝膠三維培養(yǎng),一定濃度的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)、垂直振蕩培養(yǎng),能形成管腔樣結(jié)構(gòu),且所形成的管腔樣結(jié)構(gòu),在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及功能上與在體汗腺分泌部細(xì)胞相似,具有與正常汗腺分泌部細(xì)胞相似的生理結(jié)構(gòu)及生理作用基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法,特別涉及一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮 細(xì)胞分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嚴(yán)重的皮膚缺損,如大面積的深度燒傷等,傷及皮膚全層及其附屬器,僅靠創(chuàng)面 自身難以實(shí)現(xiàn)皮膚再生,需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。目前構(gòu)建的表真皮雙層組織 工程皮膚雖已應(yīng)用于臨床,基本解決了創(chuàng)面覆蓋的問(wèn)題,但未達(dá)到真正的皮膚組織結(jié)構(gòu)和 功能的完全重建,其最大的問(wèn)題是缺乏皮膚附件,如皮脂腺、汗腺等附屬器。表皮干細(xì)胞 (Epidermalstemcell,ESC)是皮膚組織特異性干細(xì)胞,位于表皮基底層,在維持表皮更 新,保持細(xì)胞恒定等方面起著重要作用。表皮干細(xì)胞具有多向分化潛能,體內(nèi)證實(shí)能夠向皮 膚附屬器及表皮分化。若能在體外誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向汗腺分化,將為研究帶汗腺的組織工 程皮膚提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題,本發(fā)明的目的是提供一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣 上皮細(xì)胞分化的方法。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005] -種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,包括如下步驟:
[0006] 1)鼠尾膠原的制備
[0007] 將凍存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解凍后,去皮,采用D-Hanks液沖洗,抽出尾 腱,剪碎成泥,溶于無(wú)菌的冰醋酸中保存一段時(shí)間,其間反復(fù)振蕩,然后進(jìn)行離心處理,提取 上清溶液,得到乳白色半透明粘稠液體,即為所得物鼠尾膠原,將其貯存?zhèn)溆茫?br>
[0008] 2)人成纖維細(xì)胞(FB)的培養(yǎng)
[0009] 將健康成人包皮環(huán)切術(shù)的包皮標(biāo)本用酒精浸浴并擦拭,用PBS液反復(fù)沖洗;去除 皮下組織和真皮網(wǎng)狀層,將表真皮部分剪成長(zhǎng)方形條狀后進(jìn)行消化;然后將表皮從真皮上 揭下,刮真皮表面,將所得真皮剪成糊狀,加膠原酶,再加蓋,移至孵箱中并不時(shí)搖動(dòng);接著 取出液體,篩網(wǎng)過(guò)濾,加PBS液,離心棄上清,加DMEM混勻成細(xì)胞懸液,移入孵箱中培養(yǎng),待 原代培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合后,用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,當(dāng)細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)收 縮裂隙時(shí),用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化,最后分析細(xì)胞體積及增殖情況,并按照 1:3傳代,建立FB細(xì)胞庫(kù),提供來(lái)源統(tǒng)一的FB。
[0010] 3)表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0011] 先將人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng),包括下列步驟:
[0012]a)將取下的人包皮標(biāo)本用酒精浸泡并擦拭后,再用PBS平衡鹽液沖洗,直至標(biāo)本 發(fā)白發(fā)漲;
[0013]b)將上述步驟a)中的人包皮標(biāo)本在培養(yǎng)皿中剪去皮下組織后剪成長(zhǎng)方形的條 狀,然后進(jìn)行分離消化;
[0014] C)將步驟b)中的人包皮標(biāo)本用PBS平衡鹽液漂洗,然后對(duì)人包皮標(biāo)本的表皮和真 皮進(jìn)行分離,再將分離后所得的表皮進(jìn)行消化,消化后進(jìn)行離心、篩網(wǎng)過(guò)濾,棄去上清液,再 放入K-SFM培養(yǎng)液中,制成細(xì)胞混懸液,計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù),細(xì)胞按5XIO4/孔接種在 預(yù)先鋪滿(mǎn)IV型膠原的培養(yǎng)板中,30min后吸盡未貼壁的細(xì)胞,計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù)和貼 壁率,并每天更換K-SFM培養(yǎng)液;
[0015] 再進(jìn)行人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng),包括下列步驟:
[0016] d)待原代表皮干細(xì)胞融合約70 %后,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS進(jìn)行洗滌;
[0017] e)每孔加入0. 25%膜蛋白酶后放入冰箱,保持在4C;
[0018] f)待4-6h后將培養(yǎng)板取出,輕輕拍打細(xì)胞脫落,加入含10%FBS的DMEM中和; [0019]g)將液體吸入離心管中,用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中進(jìn)行離心;
[0020]h)棄去上清液,加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,計(jì)算細(xì)胞數(shù)后備用;
[0021] 4)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備
[0022] 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM; 再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入FB細(xì)胞,細(xì)胞量達(dá)到IO5Ail;吸入多孔 培養(yǎng)板中,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,每孔輕輕加入濃度為8X105/ml的1代表皮干細(xì)胞, 最后再加入KGM培養(yǎng)基,置孵箱培養(yǎng),每天進(jìn)行換液;待培養(yǎng)3天后,進(jìn)行行氣液界面培養(yǎng), 將組織工程皮膚分為兩組:一組僅用KGM培養(yǎng),一組在KGM中添加20ng/mlEGF;兩組均每 日垂直振蕩;待培養(yǎng)16天后,用4%多聚甲醛固定后行HE染色,觀察皮膚生長(zhǎng)情況;
[0023] 5)復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備
[0024] 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DiffiM; 再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞,細(xì)胞量為8XIO5Ail; 吸入多孔培養(yǎng)板中,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,再加入KGM,置孵箱中培養(yǎng),每天進(jìn)行換液; 每日垂直振蕩;待培養(yǎng)3天后,在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF;待培養(yǎng)16天后行組織 學(xué)及形態(tài)學(xué)檢查;
[0025] 6)組織工程凝膠的觀察
[0026] 步驟包括組織學(xué)觀察、免疫熒光觀察、透射電鏡下觀察以及激光共聚焦顯微鏡觀 察鈣通道。
[0027] 進(jìn)一步地,所述步驟1)中尾腱保存條件為4°C,保存48h,所得物鼠尾膠原的貯存 條件為4°C。
[0028] 進(jìn)一步地,所述各步驟中酒精的濃度均為75%,所述孵箱的條件為37°C、5% C02/95 %空氣、90 %以上濕度,所述篩網(wǎng)規(guī)格為200目。
[0029] 進(jìn)一步地,所述步驟1)中離心條件為3000rpm,離心Ih;所述步驟2)中離心條件 為1500rpm,離心5min;所述步驟3)中離心條件為IOOOrpm,離心5min。
[0030] 進(jìn)一步地,所述步驟2)和3)b)中人包皮標(biāo)本剪成長(zhǎng)方形條狀的尺寸為 0. 3cmX2cm〇
[0031] 進(jìn)一步地,所述步驟3)c)中分離采用0.25%分離酶進(jìn)行,其中所述分離酶與樣本 的比例為5:1,消化采用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行,其中表皮與所述胰蛋白酶體積比為3:1。
[0032] 進(jìn)一步地,所述步驟2)中采用且鑷子將表皮從真皮上揭下,彎頭鑷子刮真皮表 面;所述步驟3)c)中表皮和真皮進(jìn)行分離采用眼科鑷輕輕揭下表皮即完成表皮和真皮的 分離。
[0033] 進(jìn)一步地,所述步驟2)中所述FB為第4-10代;所述步驟3)、4)和5)中培養(yǎng)板為 24孔培養(yǎng)板。
[0034] 進(jìn)一步地,所述步驟2)中采用CASY?.系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況,所述步驟 3)c)中利用CASY?系統(tǒng)來(lái)分析計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)。
[0035] 進(jìn)一步地,所述步驟4)和步驟5)中所述的混勻在冰浴條件下進(jìn)行和所述的垂直 振蕩條件為振蕩頻率為75次/分,振幅為2cm。
[0036] 由于采用以上技術(shù)方案,本發(fā)明的有益效果至少包括:
[0037] 本發(fā)明證實(shí)了在體外利用復(fù)方殼多糖組織工程皮膚和凝膠三維培養(yǎng),一定濃度的 EGF(如,20ng/ml)在誘導(dǎo)條件下,垂直振蕩培養(yǎng),能形成管腔樣結(jié)構(gòu),且所形成的管腔樣結(jié) 構(gòu),在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及功能上與在體汗腺分泌部細(xì)胞相似,具有與正常汗腺分泌部細(xì)胞相 似的生理結(jié)構(gòu)及生理作用基礎(chǔ)。
[0038] 三維細(xì)胞培養(yǎng)(Threediamensionscellculture,TDCC)是將細(xì)胞培植在一定的 細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)中,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白充當(dāng)生長(zhǎng)支架,使得細(xì)胞能 夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu),所創(chuàng)建的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境能最大程度地模擬體內(nèi)環(huán) 境。這種培養(yǎng)方式一方面能夠?yàn)轶w外培養(yǎng)細(xì)胞提供近似體內(nèi)的微環(huán)境,從而有利于細(xì)胞增 殖、遷移和分化;另一方面可在體外構(gòu)建各類(lèi)組織、器官相應(yīng)的細(xì)胞三維生長(zhǎng)類(lèi)似物或等同 物,是基礎(chǔ)研究和體外構(gòu)建組織工程廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)方法。TDCC作為體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)及單 層細(xì)胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁,顯示了它既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物 質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。
[0039] 用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架材料需要滿(mǎn)足以下要求:①具有良好的組織相容性和生 物相容性;②無(wú)免疫排斥反應(yīng);③具有可塑性,能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維立體支架;④無(wú)毒、 無(wú)污染性;⑤生物可降解性。 申請(qǐng)人:研制的復(fù)方殼多糖膠原凝膠是一種良好的三維培養(yǎng)細(xì) 胞的模型,在此基礎(chǔ)上研制復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)和人工雙層皮膚接近天然真皮和皮膚的生 物學(xué)特性(專(zhuān)利號(hào):ZL01107099. 4,ZL200610095122. 9),組織相容性及生物安全性高,無(wú)毒 副作用及免疫排斥反應(yīng),同時(shí)可根據(jù)不同的需要進(jìn)行隨意的塑形。
[0040] 細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)有表面培養(yǎng)、"三明治"培養(yǎng)、混合培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)等多種方 法。采用不同的三維細(xì)胞培養(yǎng)方法所獲結(jié)果是存在差異性的,對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō),為了更好的 接近體內(nèi)汗腺的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,發(fā)明人采用了表面培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的方法在體外構(gòu)建組織 工程皮膚。表面培養(yǎng)法就是將細(xì)胞接種在一定厚度的基質(zhì)材料表面上,使其向下生長(zhǎng),有研 究表明,運(yùn)用表面培養(yǎng)法將分離純化后的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于膠原表面,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì) 胞能向膠原層內(nèi)遷移,形成三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和封閉的管腔樣腔隙。混合培養(yǎng)法就是將細(xì)胞和 基質(zhì)材料充分混合后培養(yǎng),另有研究表明,使用混合法,將膠原溶液與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞混 合后灌注在培養(yǎng)皿中,待膠原凝固后,加入培養(yǎng)基培養(yǎng),微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以形成復(fù)雜的血 管樣結(jié)構(gòu)。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖IA為本發(fā)明人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)中FB(XlOO)的原代培養(yǎng)生長(zhǎng)顯示 圖;
[0042] 圖IB為本發(fā)明人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)中FB(XlOO)的傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)顯示 圖;
[0043] 圖2為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8XIOVml的ESC,僅用KGM 培養(yǎng)行氣液界面培養(yǎng)(X200)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖;
[0044] 圖3為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8X105/ml的ESC,在KGM中 添加濃度為20ng/ml的EGF(XlOO)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖;
[0045] 圖4為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備中加入8X105/ml的ESC,在KGM中 添加濃度為20ng/ml的EGF(X200)的表皮結(jié)構(gòu)分化顯示圖;
[0046] 圖5A為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的60μm冰凍 切片HE染色(XlOO)顯示圖;
[0047] 圖5B為本發(fā)明圖5A的放大顯示圖;
[0048] 圖6為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描,利 用抗CK19抗體觀察細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯示圖;
[0049] 圖7為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描, 抗-CK18免疫熒光染色表達(dá)陽(yáng)性的顯示圖;
[0050] 圖8為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中免疫熒光觀察實(shí)驗(yàn)中采用CLSM掃描, 抗-CEA免疫熒光染色表達(dá)陽(yáng)性的顯示圖;
[0051] 圖9為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 的類(lèi)似分泌樣顆粒的高電子致密度物質(zhì)(箭頭所示)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體的顯示圖;
[0052] 圖10為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 的線(xiàn)粒體的顯示圖;
[0053] 圖11為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞內(nèi) 指狀突起的顯不圖;
[0054] 圖12為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)中觀察的細(xì)胞之 間可見(jiàn)連接(箭頭1)和類(lèi)似分泌小管的腔隙(箭頭2)的顯示圖;
[0055] 圖13為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí),氯化乙酰膽堿對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線(xiàn)圖;
[0056] 圖14為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí),阿托品對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線(xiàn)圖;
[0057] 圖15為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液高鈣時(shí),超純水對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線(xiàn)圖;
[0058] 圖16為本發(fā)明復(fù)方殼多糖組織工程凝膠中激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道實(shí)驗(yàn)中 在細(xì)胞外液無(wú)鈣時(shí),氯化乙酰膽堿對(duì)管腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的作用曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明,并不用 于限定本發(fā)明。
[0060] 下面通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。
[0061] -.材料和儀器
[0062] 1.主要儀器
[0063] 二氧化碳孵箱(TC2323) 美國(guó)SHELLAB公司 電熱鼓風(fēng)干燥箱(CS-101) 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱(ΗΗ·Β] 1365-S) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限 公司 倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(CKX41-32PH)日本Olympus公司 萬(wàn)分之一電子天平(BSIIOm 德國(guó)StartOrios公司 數(shù)顯普通離心機(jī)(KDC-40) 安徽中國(guó)科大中佳公司 24孔培養(yǎng)板 美國(guó)FALCON公司 微量移液器 法國(guó)Gilson Rios16 水純化糸統(tǒng) NMi丨丨iporeCorporation 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-600DB) 浙江昆山市超聲儀器有限公司 壓力蒸汽滅菌器(ZDX-35SBI) 上海申安醫(yī)療器械廠 超低溫冰箱(MDF-382E) 日本Sanyo公司 CASY?細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 德國(guó)CASY公司 2.主要試劑
[0064] 胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司 分離酶、膠原酶 美國(guó)Sigma公司 IV型膠原 美國(guó)Sigma公司 DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司 K-SFM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司 青霉素針、鏈霉素針 華北制藥股份有限公司 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 天津(特級(jí)) 多聚甲醛 美國(guó)Sigma公司 鼠抗人CK10、CK19抗體 北京中杉公司 鼠抗人整合素β?抗體 博士德公司 通用型SPkit 北京中杉公司 DAB顯色劑 北京中杉公司 CASYton 德國(guó)CASY公司 Trizol裂解液 美國(guó)Sigma公司 大鼠鼠尾 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬 醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
[0065] 二·實(shí)施例
[0066] 實(shí)施例1:鼠尾膠原的制備
[0067] 具體操作步驟如下:
[0068] 1)解凍:凍存300g左右大白鼠鼠尾3根,于75%酒精溶液中解凍1小時(shí);
[0069] 2)取腱:去皮,D-Hanks液沖洗3遍,抽出尾腱,剪碎成泥,溶于無(wú)菌的1 %冰醋酸 250ml中,4°C保存48小時(shí)以上,其間反復(fù)振蕩;
[0070] 3)離心:3000rpm離心1小時(shí),取上清;
[0071] 4)貯存:所得物位乳白色半透明粘稠液體,4°C貯存?zhèn)溆茫瑴y(cè)得濃度為20mg/ml(濕 重)。
[0072] 實(shí)施例2人成纖維細(xì)朐的培養(yǎng)
[0073] 具體步驟如下:
[0074] 1)標(biāo)本系健康成人包皮環(huán)切術(shù)之包皮(健康包皮,由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大 學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科和中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容中心提 供,患者均知情并同意。下同),用75%酒精在凈化工作臺(tái)中浸浴并擦拭5min后,用PBS液 反復(fù)沖洗3遍,每遍3-5min;
[0075] 2)盡量去除皮下組織和真皮網(wǎng)狀層,在另一清潔培養(yǎng)皿中將表真皮部分剪成 2(^1\0.3(^大小,移入裝有0.25%分離酶10-201111的玻璃小瓶中,加蓋后置于41:消化 18-20小時(shí);
[0076] 3)取出皮片至清潔培養(yǎng)皿,用且鑷子將表皮從真皮上揭下,彎頭鑷子刮真皮表面, 所得真皮盡量剪成糊狀,轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿,加〇. 2%膠原酶,所加量以浸沒(méi)全部真皮碎泥 為度,加蓋,移至37°C孵箱2-3小時(shí),并不時(shí)搖動(dòng);
[0077] 4)取出,成液體,用200目篩網(wǎng)過(guò)濾,加PBS液,1500rpm離心5min,棄上清,反復(fù)5 次。加DMEM至離心管,混勻成細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶中,置37°C、5%C02/95%空氣、90%以 上濕度孵箱培養(yǎng),每2-3天換液1次;
[0078] 5)待原代培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合,用0. 25%胰蛋白酶消化,在倒置顯微鏡下觀 察,細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)收縮裂隙時(shí),用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化,CASY?]系 統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況,并按照1:3傳代,建立FB細(xì)胞庫(kù),為本實(shí)驗(yàn)提供來(lái)源統(tǒng)一的 FB。本實(shí)驗(yàn)所用FB為第4-10代。
[0079] 6) !CASY?:系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況:
[0080] 取CASY測(cè)量杯,每杯加入IOml的CASYton ;
[0081] 取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吹打均勻后,取50ul滴加于CASY測(cè)量杯中;
[0082] 將CASY測(cè)量杯置于測(cè)量毛細(xì)管;
[0083] 將鉬電極浸沒(méi)其中測(cè)量各標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活力;
[0084] 每標(biāo)本測(cè)量3次。
[0085] 實(shí)施例3表皮干細(xì)朐的培養(yǎng)
[0086] 1.人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)
[0087] 標(biāo)本取自健康包皮。
[0088] 標(biāo)本取下后浸泡于PBS平衡鹽液中,4°C冰箱中保存,按下列步驟操作:
[0089]1)酒精浸泡5min后,置超凈工作臺(tái)上,用酒精棉球?qū)?biāo)本輕輕擦拭三遍;
[0090] 2)標(biāo)本移至培養(yǎng)皿中,用PBS平衡鹽液反復(fù)沖洗標(biāo)本3遍,每個(gè)角落均要沖洗到, 每遍不少于5min,直至標(biāo)本發(fā)白發(fā)脹;
[0091] 3)在培養(yǎng)皿中用手術(shù)剪剪去皮下組織,并將標(biāo)本剪成0. 3cmX2cm大小的皮條;
[0092] 4)將皮條置于培養(yǎng)皿中,加0.25%分離酶浸沒(méi)組織(分離酶與標(biāo)本之比為5:1);
[0093] 5) 4°C冰箱中消化過(guò)夜;
[0094] 6)取出消化后的標(biāo)本置于另一潔凈培養(yǎng)皿中,PBS平衡鹽液漂洗兩遍;
[0095] 7)用眼科鑷輕輕揭下表皮,真皮部分置于另一培養(yǎng)皿中(可用于分離培養(yǎng)成纖維 細(xì)胞),揭下的表皮置于培養(yǎng)皿中,加〇.25%胰蛋白酶2-3ml( -般表皮與胰蛋白酶體積比 為3 :1),在37°C孵箱中消化30min ;
[0096] 8)消化時(shí)間滿(mǎn)30min后取出置于另一培養(yǎng)皿中,加含10%FBS的DMEM終止胰蛋 白酶消化,用吸管小心反復(fù)吹打,盡量使表皮分散;
[0097] 9)200 目篩網(wǎng)過(guò)濾,IOOOrpm離心 5min;
[0098] 10)棄上清,加K-SFM于其中,制成細(xì)胞混懸液,利用CASY?甘算細(xì)胞活力及細(xì) 胞數(shù);
[0099] 11)細(xì)胞按5XIO4/孔接種在預(yù)先鋪滿(mǎn)IV型膠原的24孔板中,30min后吸盡未貼 壁的細(xì)胞,利用CASY?·計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù),計(jì)算貼壁率=(接種的細(xì)胞總數(shù)-懸浮 的細(xì)胞數(shù))/接種的細(xì)胞總數(shù);
[0100] 12)以后每天更換K-SFM培養(yǎng)液。
[0101] 2.人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0102] 1)待原代表皮干細(xì)胞融合約70%后,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌2-3遍;
[0103] 2)每孔加入0· 25%胰蛋白酶Iml后放入4°C冰箱;
[0104] 3)待4h后將培養(yǎng)板取出,輕輕拍打細(xì)胞脫落,加入含10%FBS的DMEM中和;
[0105] 4)將液體吸入15ml離心管中,用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中,IOOOrpm/ s,離心 5min;
[0106] 5)棄去上清液,加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,CASY?i計(jì)數(shù)后備用。
[0107] 在上述實(shí)施例中,采用膠原酶消化法消化健康成人包皮真皮獲得FB,進(jìn)行原代培 養(yǎng)。
[0108] 如圖IA所示,剛移入培養(yǎng)瓶的FB,在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為各層面的大量的懸浮圓 形細(xì)胞,30min后即可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁并伸展,12小時(shí)后絕大部分細(xì)胞貼壁,并伸出較鈍細(xì) 胞突出,并隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,表現(xiàn)為突起變長(zhǎng),呈長(zhǎng)梭形,基本平行,在接種的7-10天 培養(yǎng)的FB可融合,且排列緊密呈漩渦狀生長(zhǎng)。如圖IB所示,傳代培養(yǎng)的FB生長(zhǎng)旺盛,呈梭 形,排列緊密有序,在不斷通過(guò)胰蛋白酶消化提供種子細(xì)胞用于組織工程皮膚制備的同時(shí), 細(xì)胞庫(kù)的FB-直保持正常的生長(zhǎng)活性,未發(fā)生污染現(xiàn)象。
[0109] 實(shí)施例4復(fù)方殼多糖組織工稈皮膚制備
[0110] 具體步驟如下:
[0111] 1)在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性 蛋白及濃縮DMEM;
[0112] 2)用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;
[0113] 3)在凝膠中加入FB細(xì)胞,細(xì)胞量達(dá)到IOVml;
[0114] 4)吸入24孔板培養(yǎng)板中,每孔1ml,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,每孔輕輕加入1代 表皮干細(xì)胞Iml(濃度分別為8XIO5Ail),最后再加入KGM培養(yǎng)基,置37°C、5%C02/95%空 氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng),每天換液1次;
[0115] 5)培養(yǎng)3天后,用不銹鋼篩網(wǎng)支架抬高3_,行氣液界面培養(yǎng),并將組織工程皮膚 分為兩組:一組僅用KGM培養(yǎng),一組在KGM中添加EGF(濃度為20ng/ml);兩組均每日垂直 振蕩,振蕩頻率為75次/分,振幅為2cm;
[0116] 6)培養(yǎng)16天后,用4%多聚甲醛固定后行HE染色,觀察皮膚生長(zhǎng)情況。
[0117] 7)HE染色
[0118]脫水:組織工程皮膚的各個(gè)標(biāo)本按照30%酒精30min---50(%酒精3〇111;[11---75% 酒精30min 80 %酒精30min 95 %酒精30min(兩次)無(wú)水酒精30min(兩次),梯度 脫水,
[0119] 浸蠟,石蠟包埋,5μm厚連續(xù)切片;
[0120] 脫蠟水洗:烤片一二甲苯I、11各5min-一水洗(無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒 精各Imin蒸饋水);
[0121] HE染色按常規(guī)進(jìn)行。
[0122] 在上述實(shí)施例中,如圖2所示,加入8XIO5Ail的ESC,僅用KGM培養(yǎng)行氣液界面培 養(yǎng),可見(jiàn)表皮結(jié)構(gòu)分化良好,并大致可分為基底層,棘層和角質(zhì)層,角質(zhì)層較厚,基底層排列 規(guī)則,各層均有層數(shù)不等的扁平梭形細(xì)胞,但未見(jiàn)細(xì)胞向真皮內(nèi)生長(zhǎng)分化;如圖3和圖4所 示,加入8XIO5Ail的ESC,在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF,可見(jiàn)皮膚熟化程度較高, 表皮分化良好,表真皮結(jié)合較好,見(jiàn)表皮細(xì)胞向真皮基質(zhì)凝膠內(nèi)生長(zhǎng),并出現(xiàn)管腺樣結(jié)構(gòu)。
[0123]實(shí)施例5復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備
[0124] 具體操作步驟如下:
[0125] 1)在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性 蛋白及濃縮DMEM;
[0126] 2)用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4;
[0127] 3)在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞,細(xì)胞量為SXlOVml;
[0128] 4)吸入24孔板培養(yǎng)板中,每孔lml,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,再加入KGM,置 37°C、5%C02/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng),每天換液1次;
[0129] 5)每日垂直振蕩,振蕩頻率為75次/分,振幅為2cm ;
[0130] 6)培養(yǎng)3天后,在KGM中添加EGF(濃度為20ng/ml);
[0131] 7)培養(yǎng)16天后行組織學(xué)及形態(tài)學(xué)檢查。
[0132]實(shí)施例6組織工程凝膠的觀察
[0133]1.組織學(xué)觀察
[0134] 1)將長(zhǎng)有細(xì)胞團(tuán)的組織工程凝膠置于特制的小盒中,加入適量OTC包埋劑浸沒(méi)凝 膠,液氮下速凍5-lOsec,使OTC固化呈乳白色后取出;
[0135]2)冰凍切片機(jī)開(kāi)始切片,切片厚度為60um ;
[0136] 3)將切片貼附在涂有多聚賴(lài)氨酸的載玻片上,室溫下風(fēng)干后,置于無(wú)水乙醇和甲 醛液各半配制的溶液中固定30min,PBS漂洗5minX3次;
[0137] 4)按常規(guī)進(jìn)行HE染色。
[0138] 在上述實(shí)驗(yàn)中,如圖5A和圖5B所示,組織切片HE染色可見(jiàn)凝膠內(nèi)的細(xì)胞成團(tuán)生 長(zhǎng)形成管腔樣結(jié)構(gòu),管腔結(jié)構(gòu)的管壁由單層細(xì)胞構(gòu)成,中間可見(jiàn)較大腔隙,細(xì)胞胞漿紅染, 部分細(xì)胞核位于基底部,顏色較深,部分細(xì)胞形態(tài)可見(jiàn)腔面窄、基底部大,排列有一定的極 性,與汗腺分泌部管狀結(jié)構(gòu)相似。
[0139] 2、免疫熒光觀察
[0140] 1)將凝膠置于4%多聚甲醛中固定2h,PBS漂洗5minX3次;
[0141] 2)加一抗工作液(CK19、CK18、CEA),濕盒內(nèi)37°C孵箱內(nèi)放置30min,PBS漂洗 5minX3 次;
[0142] 3)加入熒光標(biāo)記的抗體羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒內(nèi)37°C孵箱內(nèi)放置30min, PBS漂洗 5minX3 次;
[0143] 4)緩沖甘油封片;
[0144] 5)將制備的樣品放在激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上,在倒置顯微鏡下尋找細(xì) 胞后轉(zhuǎn)到激光光源進(jìn)行掃描。
[0145] 在上述實(shí)驗(yàn)中,ESC和汗腺細(xì)胞均表達(dá)的CK19,在CLSM掃描下,利用抗-CK19抗體 觀察凝膠中細(xì)胞的形態(tài)。如圖6所示,可以發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞聚集成團(tuán),形成管腔樣結(jié)構(gòu),管腔結(jié) 構(gòu)由單層細(xì)胞構(gòu)成的管壁和中央空腔組成,與汗腺分泌部的管狀結(jié)構(gòu)相似。如圖7和圖8 所示,管腔樣結(jié)構(gòu)抗-CK18和抗-CEA免疫熒光染色均表達(dá)陽(yáng)性。
[0146] 3.透射電鏡下觀察
[0147] 1)2. 5%的戊二醛固定膠原凝膠中的細(xì)胞團(tuán)2h;
[0148] 2)PBS漂洗lh;
[0149] 3)1 %鋨酸固定Ih;
[0150] 4)PBS漂洗 3 次,每次 5min;
[0151] 5)50%、70%、80%、90%、無(wú)水丙酮1、無(wú)水丙酮11,分別脫水1511^11;
[0152] 6) 1:1丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂的混合劑室溫中浸透3h ;
[0153] 7) 1:2丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂的混合劑室溫中浸透Ih;
[0154] 8)純丙酮 37°C浸透 2h。;
[0155] 9)環(huán)氧樹(shù)脂包埋液注入干燥的塑料模板中;
[0156] 10)細(xì)胞團(tuán)移至塑料模板的液面上,使其自然沉落;
[0157] 11)貼標(biāo)簽,包埋后的模板依次置于 37°C(12h)、45°C(12h)、60°C(24h);
[0158] 12)行半薄切片定位,光學(xué)顯微鏡觀察,確定檢測(cè)范圍;
[0159] 13)制備超薄切片;
[0160] 14)撈片:鑷子夾持銅網(wǎng),蘸取液面上的切片;
[0161] 15)濾紙吸干銅網(wǎng);
[0162] 16)醋酸鈾乙醇液染色20min;
[0163] 17)雙蒸水沖洗;
[0164] 18)檸檬酸鉛液染色I(xiàn)Omin;
[0165] 19)雙蒸水沖洗;
[0166]20)透射電鏡下觀察。
[0167] 在上述實(shí)驗(yàn)中,透射電鏡觀察結(jié)果顯示,如圖9所示,電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有成束的 張力細(xì)絲,含有類(lèi)似分泌樣顆粒的高電子致密度物質(zhì),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌增多,較多核糖體, 如圖10所示,細(xì)胞中則含有較多線(xiàn)粒體;如圖11所述,細(xì)胞有指狀突起,如圖12所示,細(xì)胞 之間可見(jiàn)緊密連接和縫隙連接,有以及類(lèi)似分泌小管的腔隙。
[0168] 4、激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道
[0169] 1)實(shí)驗(yàn)分組:取24孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)良好的汗腺腺上皮管腔樣細(xì)胞團(tuán)20孔,隨機(jī) 分為4組。具體見(jiàn)下表1:
[0170]表1激光共聚焦顯微鏡觀察鈣通道的實(shí)驗(yàn)分組
[0171]
【權(quán)利要求】
1. 一種表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,包括如下步驟: 1) 鼠尾膠原的制備 將凍存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解凍后,去皮,采用D-Hanks液沖洗,抽出尾腱,剪 碎成泥,溶于無(wú)菌的冰醋酸中保存一段時(shí)間,其間反復(fù)振蕩,然后進(jìn)行離心處理,提取上清 溶液,得到乳白色半透明粘稠液體,即為所得物鼠尾膠原,將其貯存?zhèn)溆茫? 2) 人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 將健康成人包皮環(huán)切術(shù)的包皮標(biāo)本用酒精浸浴并擦拭,再用PBS液反復(fù)沖洗;去除皮 下組織和真皮網(wǎng)狀層,將表真皮部分剪成長(zhǎng)方形條狀后進(jìn)行消化;然后將表皮從真皮上揭 下,刮真皮表面,將所得真皮剪成糊狀,加膠原酶,加蓋,移至孵箱中并不時(shí)搖動(dòng);接著取出 液體,篩網(wǎng)過(guò)濾,加PBS液,離心棄上清,加DMEM混勻成細(xì)胞懸液,移入孵箱中培養(yǎng),待原代 培養(yǎng)的FB接近或達(dá)到融合后,用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,當(dāng)細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)收縮裂 隙時(shí),用含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)接終止消化,最后分析細(xì)胞體積及增殖情況,并按照1:3傳 代,建立FB細(xì)胞庫(kù),提供來(lái)源統(tǒng)一的FB。 3) 表皮干細(xì)胞的培養(yǎng) 先將人表皮干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng),包括下列步驟: a)將取下的人包皮標(biāo)本用酒精浸泡并擦拭后,再用PBS平衡鹽液沖洗,直至標(biāo)本發(fā)白 發(fā)漲; b)將上述步驟a)中的人包皮標(biāo)本剪去皮下組織后剪成長(zhǎng)方形的條狀,然后進(jìn)行分離 消化; c)將步驟b)中的人包皮標(biāo)本用PBS平衡鹽液漂洗,對(duì)人包皮標(biāo)本的表皮和真皮進(jìn)行分 離,將分離后所得的表皮進(jìn)行消化,消化后進(jìn)行離心、篩網(wǎng)過(guò)濾,棄去上清液,再放入K-SFM 培養(yǎng)液中,制成細(xì)胞混懸液,計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù),細(xì)胞按5 X 104/孔接種在預(yù)先鋪滿(mǎn)IV 型膠原的培養(yǎng)板中,30min后吸盡未貼壁的細(xì)胞,計(jì)算吸出液中的細(xì)胞數(shù)和貼壁率,并每天 更換K-SFM培養(yǎng)液; 再進(jìn)行人表皮干細(xì)胞的傳代培養(yǎng),包括下列步驟: d)待原代表皮干細(xì)胞融合約70%后,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS進(jìn)行洗滌; e) 每孔加入0. 25 %膜蛋白酶后放入冰箱,保持在4C; f)待4h后將培養(yǎng)板取出,輕輕拍打細(xì)胞脫落,加入含10% FBS的DMEM中和; g) 將液體吸入離心管中,用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)板后移入離心管中進(jìn)行離心; h)棄去上清液,加入K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,計(jì)算細(xì)胞數(shù)后備用; 4) 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM;再 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4;在凝膠中加入FB細(xì)胞,細(xì)胞量達(dá)到105/ml ;吸入多孔培 養(yǎng)板中,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,每孔輕輕加入濃度為8X105/ml的1代表皮干細(xì)胞,最 后再加入KGM培養(yǎng)基,置孵箱培養(yǎng),每天進(jìn)行換液;待培養(yǎng)3天后,進(jìn)行行氣液界面培養(yǎng),將 組織工程皮膚分為兩組:一組僅用KGM培養(yǎng),一組在KGM中添加EGF;兩組均每日垂直振蕩; 待培養(yǎng)16天后,用4%多聚甲醛固定后行HE染色,觀察皮膚生長(zhǎng)情況; 5) 復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備 按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM;再 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 4 ;在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞,細(xì)胞量為8X105/ml;吸 入多孔培養(yǎng)板中,放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后,再加入KGM,置孵箱中培養(yǎng),每天進(jìn)行換液;每 日垂直振蕩;待培養(yǎng)3天后,在KGM中添加濃度為20ng/ml的EGF;待培養(yǎng)16天后行組織學(xué) 及形態(tài)學(xué)檢查; 6)組織工程凝膠的觀察 步驟包括組織學(xué)觀察、免疫熒光觀察、透射電鏡下觀察以及激光共聚焦顯微鏡觀察鈣 通道。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟1)中尾腱保存條件為4°C,保存48h,所得物鼠尾膠原的貯存條件為4°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述各步驟中酒精的濃度均為75%,所述孵箱的條件為37°C、5%C02/95%空氣、90%以上濕 度,所述篩網(wǎng)規(guī)格為200目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟1)中離心條件為3000rpm,離心lh;所述步驟2)中離心條件為1500rpm,離心5min; 所述步驟3)中離心條件為lOOOrpm,離心5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟2)和3)b)中人包皮標(biāo)本剪成長(zhǎng)方形條狀的尺寸為0. 3cmX 2cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟3)c)中分離采用0. 25%分離酶進(jìn)行,其中所述分離酶與樣本的比例為5:1,消化采 用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行,其中表皮與所述胰蛋白酶體積比為3:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟2)中采用且鑷子將表皮從真皮上揭下,彎頭鑷子刮真皮表面;所述步驟3)c)中表皮 和真皮進(jìn)行分離采用眼科鑷輕輕揭下表皮即完成表皮和真皮的分離。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟2)中所述FB為第4-10代;所述步驟3)、4)和5)中培養(yǎng)板為24孔培養(yǎng)板。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟2)中采用CASY?系統(tǒng)分析細(xì)胞體積及增殖情況,所述步驟3)c)中利用CASY* 系統(tǒng)來(lái)分析計(jì)算細(xì)胞活力及細(xì)胞數(shù)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮細(xì)胞分化的方法,其特征在于,所 述步驟4)和步驟5)中所述的混勻在冰浴條件下進(jìn)行和所述的垂直振蕩條件為振蕩頻率為 75次/分,振幅為2cm。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK104399125SQ201410718190
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】王元元, 伍津津, 楊亞?wèn)|, 魯元?jiǎng)? 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院