一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物。該液體藥物組合物包含治療有效量或診斷有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的pH5.0～7.0的緩沖液、濃度范圍在0.1％～2.0％w/v的氨基己酸、濃度范圍在30％～70％v/v的多元醇以及藥用防腐劑。該液體藥物組合物可以制成口服劑、皮下注射劑、舌下含服劑、氣霧劑、鼻腔劑、皮膚點刺劑等劑型，可應(yīng)用于診斷或治療由動物毛皮屑變應(yīng)原誘發(fā)的過敏性疾病。
【專利說明】一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液 體藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 過敏性疾病是當(dāng)今世界上最常見的疾病之一。過敏性疾病的發(fā)病率約占人口的 20%。過敏性疾病從新生兒到老年人的各年齡段均可能發(fā)生，且有明顯的遺傳性傾向。過 敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、過敏性結(jié)膜炎等，嚴(yán)重的甚至?xí){ 到人的生命（過敏性休克）。
[0003] 當(dāng)變應(yīng)原通過食入、吸入、皮膚接觸等方式接觸人體后，會誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性 的抗體IgE(SlgE)。SlgE會牢固地結(jié)合在肥大細(xì)胞、噬堿粒細(xì)胞表面。當(dāng)變應(yīng)原再次進(jìn)入 體內(nèi)時，會與這些SlgE相結(jié)合。這種結(jié)合會誘導(dǎo)與SlgE結(jié)合的肥大細(xì)胞和噬堿粒細(xì)胞釋 放生物活性介質(zhì)。釋放的生物活性介質(zhì)除了組織胺以外，還可以是前列腺素 D2、白三烯、血 小板活化因子等，它們的作用相似，都可引起平滑肌收縮，毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增強(qiáng)，腺 體分泌物增多，即導(dǎo)致過敏性疾病的發(fā)生。
[0004] 引起過敏的主要變應(yīng)原之一是動物毛皮屑。狗、貓、牛、羊、兔、鼠等動物的毛皮屑 均可能誘發(fā)過敏性哮喘、過敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎等疾病。研究發(fā)現(xiàn)，動物毛皮屑中含有不 同的變應(yīng)原蛋白。這些變應(yīng)原蛋白在動物毛皮屑誘發(fā)過敏反應(yīng)中起到了主要的作用。例如， 狗毛皮屑中的變應(yīng)原蛋白Can Π ，貓毛皮屑中的變應(yīng)原蛋白Fel dl，馬毛皮屑中的變應(yīng)原 蛋白Equc 1及Equ c2,牛毛皮屑中的變應(yīng)原蛋白Bos d2及Bos d5,兔毛皮屑中的變應(yīng)原 蛋白Ory cl,小鼠毛皮屑中的變應(yīng)原蛋白Mus ml、大鼠毛皮屑中的變應(yīng)原蛋白Rat nl等均 是主要的變應(yīng)原蛋白。
[0005] 由于導(dǎo)致過敏性疾病的變應(yīng)原種類繁多，因此，進(jìn)行診斷導(dǎo)致患者過敏的變應(yīng)原 種類的檢測顯得尤為重要，其中，皮膚點刺試驗是目前臨床上最常見的變應(yīng)原體內(nèi)診斷方 法。當(dāng)變應(yīng)原進(jìn)入過敏性疾病患者皮膚后，與肥大細(xì)胞上的特異性IgE抗體結(jié)合，導(dǎo)致肥大 細(xì)胞脫顆粒釋放組胺等炎癥介質(zhì)，使局部血管擴(kuò)張，滲出增加，引起皮膚表面的風(fēng)團(tuán)和紅暈 反應(yīng)?；颊邫C(jī)體對變應(yīng)原刺激的敏感程度與體內(nèi)組胺的釋放量、皮膚表面的風(fēng)團(tuán)反應(yīng)呈正 相關(guān)。
[0006] 過敏性疾病的治療方法主要有對癥藥物治療與特異性免疫治療（脫敏治療）?，F(xiàn) 有的對癥藥物主要包括抗組胺藥物、過敏反應(yīng)介質(zhì)阻滯劑、鈣劑、免疫抑制劑等。但對癥藥 物常伴有不同的副作用，且長期或大劑量服用易產(chǎn)生耐藥性，因此并不能達(dá)到根治的效果。 特異性免疫治療是在皮膚點刺試驗或其他方法驗證導(dǎo)致過敏的主要變應(yīng)原物質(zhì)后，將主要 變應(yīng)原制成不同濃度的藥物制劑，通過梯度遞增的給藥方式連續(xù)給患者以變應(yīng)原制劑，并 在較高濃度維持給藥，從而使患者對變應(yīng)原脫敏。特異性免疫治療是一種對因治療，世界衛(wèi) 生組織WHO在其關(guān)于免疫脫敏的指導(dǎo)性文件中明確指出："脫敏治療是唯一可以改變過敏 性疾病自然進(jìn)程的治療方法"。
[0007] 過敏性疾病的診斷和治療上，變應(yīng)原藥物制劑都起到了至關(guān)重要的作用，因此，開 發(fā)穩(wěn)定而有效的變應(yīng)原藥物制劑具有重要的意義。
[0008] 由于動物毛皮屑變應(yīng)原物質(zhì)本身的組成與結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易受物理或化學(xué)因素的影響 而失去活性、降低效價。因此，目前動物毛皮屑變應(yīng)原藥物制劑較難長期穩(wěn)定保存，該類藥 物的貨架壽命一般都較短。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物貨架壽命短的缺陷，提 供一種能長期穩(wěn)定保存的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組 合物，其特征在于，包含治療有效量或診斷有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的 pH5. 0?7. 0的緩沖液、濃度范圍在0. 1%?2. 0%w/v的氨基己酸、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇以及藥用防腐劑。
[0011] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物還包含濃度范圍在〇. 1%? 2. 0% w/v的NaCl。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中含有的NaCl濃 度范圍在0.5%?1.0% w/v。
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述動物毛皮屑變應(yīng)原來源于以下動物：貓毛皮屑變 應(yīng)原、狗毛皮屑變應(yīng)原、馬毛皮屑變應(yīng)原、牛毛皮屑變應(yīng)原、兔毛皮屑變應(yīng)原、鼠毛皮屑變應(yīng) 原。
[0013] 在一個更加優(yōu)選的實施方案中，所述貓毛皮屑變應(yīng)原選自：中華田園貓（包括貍 花貓、三花貓、白貓、黑貓、黑白花貓、黃貓）毛皮屑變應(yīng)原、美國短毛貓毛皮屑變應(yīng)原、俄國 藍(lán)貓毛皮屑變應(yīng)原、英國貓毛皮屑變應(yīng)原、波斯貓毛皮屑變應(yīng)原、蘇格蘭折耳貓毛皮屑變應(yīng) 原。
[0014] 在另一個更加優(yōu)選的實施方案中，所述狗毛皮屑變應(yīng)原選自：中華田園犬毛皮屑 變應(yīng)原、邊境牧羊犬毛皮屑變應(yīng)原、德國牧羊犬毛皮屑變應(yīng)原、中國沙皮犬毛皮屑變應(yīng)原、 阿拉斯加雪橇犬毛皮屑變應(yīng)原、薩摩耶毛皮屑變應(yīng)原、拉布拉多尋回犬毛皮屑變應(yīng)原。
[0015] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑變應(yīng)原是動物毛皮屑變應(yīng)原浸提 液，它是將動物毛皮屑用不導(dǎo)致變應(yīng)原嚴(yán)重降解或失活的去離子水或緩沖液浸提獲得。更 優(yōu)選地，可以通過將動物毛皮屑脫脂、干燥、浸提、濃縮而獲得。
[0016] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑變應(yīng)原是單一成分的動物毛皮屑 變應(yīng)原蛋白或其組合。所述單一成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白選自：Can fl、Fel dl、Equ cl λ Equ c2、Bos d2、Bos d5、0ry cl、Mus ml、Rat nl〇
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述單一成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白獲得的方法是 重組載體表達(dá)或天然動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白純化。所述重組載體表達(dá)包含以下步驟：克隆、 構(gòu)建載體、表達(dá)、純化、重組蛋白復(fù)性。所述天然動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白純化包含以下步驟： 粗提動物毛皮屑蛋白、過分子篩、離子交換。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述天然動物毛 皮屑變應(yīng)原蛋白純化方法由以下步驟組成：粗提動物毛皮屑蛋白、過分子篩、離子交換、反 向色譜。
[0018] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中所含有的氨基己酸濃度范圍在 0. 3?I. O% w/v。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中所含有的氨基 己酸濃度為〇. 65% w/v。
[0019] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的緩沖液的濃度范圍在5mmol/ L ?500mmol/L〇
[0020] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中的緩沖液的p H的范圍為 pH5. 0?6. 5。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中的緩沖液的pH選自 pH5. 0, pH5. 5, pH6. 0, pH6. 5, pH7. 0。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述pH5. 0?7. 0的緩沖液選自甘氨酸-鹽酸緩沖液、 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙 酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-EDTA緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷 酸二氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、硼 酸-硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩 沖液、碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液、氯化鉀-鹽酸緩沖液、氯化 鉀-氫氧化鈉緩沖液。
[0022] 在一個更優(yōu)選的實施方案中所述pH5. 0?7. 0的的緩沖液選自pH5. 0的乙酸-乙 酸鈉緩沖液、PH5. 5的乙酸-EDTA緩沖液、pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH6. 5的 Tris-鹽酸緩沖液、pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0023] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的多元醇選自丙二醇、甘油、山 梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇。
[0024] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的多元醇濃度范圍在40%? 60% v/v。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的多元醇濃度范圍在 45%?55% v/v。在一個還要優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的多元醇為 45 %?55% v/v的甘油。
[0025] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物組合物中的藥用防腐劑選自但不限于苯 酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸鹽類、對羥基苯甲酸酯類、苯甲醇、苯乙醇或其組合，藥 用防腐劑的濃度范圍在〇. 1%?3% w/v。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述液體藥物 組合物中的藥用防腐劑為〇. 1 %?〇. 5% w/v的苯酚。在另一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中， 所述液體藥物組合物中的藥用防腐劑為〇. 1 %?〇. 2% w/v的山梨酸鉀。
[0026] 從長期穩(wěn)定性試驗可以得知，本發(fā)明的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物 具有很高的穩(wěn)定性，在2?8°C條件下能穩(wěn)定保存24個月以上。
[0027] 該液體藥物組合物可應(yīng)用于治療或診斷由動物毛皮屑變應(yīng)原引發(fā)的過敏性疾病。 所述的液體藥物組合物可以制備成各種醫(yī)學(xué)上可接受的液體劑型，包括但不限于：口服劑、 皮下注射劑、舌下含服劑、氣霧劑、鼻腔劑、皮膚點刺劑。

【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物，其特征在 于，包含治療有效量或診斷有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖 液、濃度范圍在〇. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇以及 藥用防腐劑。此處的"包含……"是指該液體藥物組合物中還可以含有任何其它組分，這些 組分可以以任何含量存在，只要以該含量存在的該組分是人體可接受的，并對本發(fā)明的液 體藥物組合物中活性成分的生物活性沒有實質(zhì)性的影響即可。同理，后文中的"包括如下步 驟"是指該項實施步驟除了所列出的必要步驟外，還可以有任何其它的幫助或促進(jìn)該項實 施方案完成的操作步驟。
[0029] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物是由治療有效量或診斷有效量 的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖液、濃度范圍在0. 1 %?2. 0% w/ V的氨基己酸、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇以及藥用防腐劑所組成的。
[0030] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物包含治療有效量或診斷有效 量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖液、濃度范圍在0. 1%?2. 0% w/v的氨基己酸、0. 1%?2. 0% w/v的NaCl、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇以及藥 用防腐劑。
[0031] 在一個更加優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物是由治療有效量或診斷 有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖液、濃度范圍在0. 1%? 2. 0% w/v的氨基己酸、0· 1%?2. 0% w/v的NaCl、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇 以及藥用防腐劑所組成的。
[0032] 在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，液體藥物組合物中含有濃度范圍在0.5 %? I. 0% w/v的NaCl。在一個更進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，液體藥物組合物中NaCl濃度為 0. 5% w/v〇
[0033] 需要特別說明的是，對于本發(fā)明藥物組合物中變應(yīng)原的劑量濃度并沒有太多限 制，只要其能夠有效治療（即治療有效量）、或者有效診斷（即診斷有效量）即可。
[0034] 術(shù)語"治療有效量"是指本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)用于特異性免疫治療（脫敏治療） 時的濃度（劑量）。根據(jù)特異性免疫治療（脫敏治療）的要求，本發(fā)明的藥物組合物可以 制備成多個劑量濃度的制劑，先從低劑量濃度給藥，劑量再由小到大逐漸遞增，至最佳維持 劑量濃度。近年來，也出現(xiàn)了以單一劑量持續(xù)給藥的脫敏治療方案。因此，術(shù)語"治療有效 量"是指以單一劑量或者遞增劑量服用一次或者反復(fù)服用可以導(dǎo)致例如適應(yīng)性免疫應(yīng)答并 因此使患者脫敏的劑量。當(dāng)然，對于不同過敏程度的病人，其最佳的治療劑量可能不同，本 領(lǐng)域技術(shù)人員通過有限次的試驗即可確定該濃度。一般而言，"治療有效量"的動物毛皮屑 變應(yīng)原（浸提液）總蛋白濃度優(yōu)選為〇· 01 μ g/ml?10mg/ml，更優(yōu)選為0· 1 μ g/ml?Img/ ml。"治療有效量"的動物毛皮屑變應(yīng)原（單一變應(yīng)原）濃度優(yōu)選為0. 001 μ g/ml?lmg/ ml,更優(yōu)選為 0· 01 μ g/ml ?100 μ g/ml。
[0035] 術(shù)語"診斷有效量"是指本發(fā)明的液體藥物組合物應(yīng)用于皮膚點刺診斷時的濃度 (劑量）。一般而言，"診斷有效量"的動物毛皮屑變應(yīng)原（浸提液）總蛋白濃度優(yōu)選為1 μ g/ ml?10mg/ml，更優(yōu)選為10μ g/ml?lmg/ml。"診斷有效量"的動物毛皮屑變應(yīng)原（單一 變應(yīng)原）濃度優(yōu)選為〇. 1 μ g/ml?lmg/ml，更優(yōu)選為1 μ g/ml?100 μ g/ml。最佳的診斷 濃度，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過有限次的試驗也可以方便地確定。
[0036] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑變應(yīng)原來源于以下動物：貓毛皮屑 變應(yīng)原、狗毛皮屑變應(yīng)原、馬毛皮屑變應(yīng)原、牛毛皮屑變應(yīng)原、兔毛皮屑變應(yīng)原、鼠毛皮屑變 應(yīng)原。所述的變應(yīng)原可以是通過商業(yè)途徑購買的，也可以是采用現(xiàn)有的任何不使變應(yīng)原蛋 白成分失活或降解的提取方法提取的，還可以通過基因工程手段獲得任何種類的具有生物 活性（變應(yīng)原活性）的"重組變應(yīng)原"（單一變應(yīng)原蛋白）。
[0037] 在一個更加優(yōu)選的實施方案中，所述貓毛皮屑變應(yīng)原選自：中華田園貓（包括貍 花貓、三花貓、白貓、黑貓、黑白花貓、黃貓）毛皮屑變應(yīng)原、美國短毛貓毛皮屑變應(yīng)原、俄國 藍(lán)貓毛皮屑變應(yīng)原、英國貓毛皮屑變應(yīng)原、波斯貓毛皮屑變應(yīng)原、蘇格蘭折耳貓毛皮屑變應(yīng) 原。
[0038] 在另一個更加優(yōu)選的實施方案中，所述狗毛皮屑變應(yīng)原選自：中華田園犬毛皮屑 變應(yīng)原、邊境牧羊犬毛皮屑變應(yīng)原、德國牧羊犬毛皮屑變應(yīng)原、中國沙皮犬毛皮屑變應(yīng)原、 阿拉斯加雪橇犬毛皮屑變應(yīng)原、薩摩耶毛皮屑變應(yīng)原、拉布拉多尋回犬毛皮屑變應(yīng)原。
[0039] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑變應(yīng)原是動物毛皮屑變應(yīng)原浸提 液。它是將動物毛皮屑用不導(dǎo)致變應(yīng)原嚴(yán)重降解或失活的去離子水或緩沖液浸提獲得。進(jìn) 行動物毛皮屑變應(yīng)原浸提前，應(yīng)先將毛皮屑材料進(jìn)行粉碎。為保證變應(yīng)原蛋白的活性，粉碎 過程優(yōu)選在低溫下進(jìn)行。粉碎可選用液氮粉碎方法。
[0040] 在一個優(yōu)選的實施方案中，動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液可以通過將動物毛皮屑脫 月旨、干燥、浸提、濃縮而獲得。其中，脫脂所使用的有機(jī)溶劑選自但不限于：乙醚、丙酮、無水 乙醇、甲苯。浸提時所使用的緩沖液可以選自但不限于：PH7. 6的磷酸鹽緩沖液、pH8. 0的 硼酸鹽緩沖液、PH8. 2的磷酸鹽緩沖液、pH8. 5的硼酸鹽緩沖液、pH8. 9的Tris-鹽酸緩沖液 等。實驗證實，當(dāng)緩沖液的pH為pH7. 5?10. 0,浸提的效果較好。在一個較佳的實施方案 中，選用的是PH8. 2的磷酸鹽緩沖液。
[0041] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的浸提過程可在低溫下（優(yōu)選2?8°C )進(jìn)行。 低溫下進(jìn)行浸提可以保護(hù)蛋白的活性，減少蛋白失活的比例，同時避免浸提過程中微生物 繁殖、減少毛皮屑自身酶系的作用。在一個還要優(yōu)選的實施方案中，所述的浸提液中可加入 0· 1%?5% NaCl (更佳 0.5%?2%，最佳 1% )。
[0042] 濃縮方法包括但不限于：超濾、透析。所選用膜的截流孔徑可以根據(jù)需要確定，要 求在盡可能保留變應(yīng)原活性的前提下除去無活性的小分子色素等雜質(zhì)。同時，在濃縮過程 中，可以使用所述液體藥物組合物中的緩沖液替代原浸提緩沖液。
[0043] 在一個具體的實施方案中，提取動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液包括如下步驟：
[0044] 脫脂及干燥：可連續(xù)用有機(jī)溶劑（如丙酮）浸泡干燥的動物毛皮屑（優(yōu)選的，脫脂 前先將動物毛皮屑進(jìn)行粉碎，更優(yōu)選為液氮粉碎），每次按質(zhì)量體積比1 : 5?1 : 50加 入丙酮，脫脂2?6次，每次1?24小時（優(yōu)選1?12小時，更佳1?6小時），至脫脂后 的有機(jī)溶劑（如丙酮）為無色，將脫脂后的固體物自然干燥至無有機(jī)溶劑自有氣味后稱重。 實驗室操作應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)完成，中試采用真空濃縮提取罐。
[0045] 浸提：使經(jīng)脫脂干燥后的動物毛皮屑與ρΗ7· 5?10. 0 (優(yōu)選pH8. 0?9. 0)的緩 沖液以一定比例（較佳1 : 5?I : 50w/v，更佳I : 10?I : 40w/v，還要佳1 : 20? I : 30w/v)提取（優(yōu)選在低溫條件下進(jìn)行，更優(yōu)選為2?8°C條件下進(jìn)行），充分接觸浸提 1?72小時（優(yōu)選進(jìn)行10?70小時，更優(yōu)選48?60小時），離心或/并過濾，收集粗浸 提液。
[0046] 濃縮：選用超濾作為濃縮方法，將上述得到得到的粗浸提液使用截流分子量為 3?20kD (優(yōu)選5kD)的超濾膜進(jìn)行超濾，反復(fù)加入pH5. 0?7. 0的緩沖液（即所述液體藥 物組合物中的緩沖液）更換緩沖體系。超濾可除去小分子色素等雜質(zhì)，最終使粗浸提液體 積濃縮至原體積的1/5?1/200 (優(yōu)選1/10?1/150)，得到動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液。在 一個優(yōu)選的實施方案中，超濾重復(fù)多次（更優(yōu)選進(jìn)行2?5次）。
[0047] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑變應(yīng)原是單一成分的動物毛皮屑 變應(yīng)原蛋白或其組合。動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白選自但不限于：Can fl、Fel dl、Equ cl、Equ c2、Bos d2、Bos d5、Ory cl、Mus ml、Rat nl〇
[0048] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的動物毛皮屑單一成分的變應(yīng)原蛋白是通過重組 載體表達(dá)蛋白得到的，重組載體表達(dá)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，是將目的基因克隆 到特定的表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)入原核或真核生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，通過提取、分離、純化、復(fù) 性而得到單一成分的蛋白的技術(shù)。在本發(fā)明中，可以使用任何能夠成功分離出具有變應(yīng)原 活性的單一成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白的重組載體技術(shù)。
[0049] 在一個實施方案中，所選用的重組載體表達(dá)包含以下步驟：克隆、構(gòu)建載體、表達(dá)、 純化、重組蛋白復(fù)性。在一個具體的實施方案中，重組載體表達(dá)方法包含以下步驟：
[0050] 1)克隆動物變應(yīng)原蛋白基因并構(gòu)建融合表達(dá)的質(zhì)粒載體：融合表達(dá)是指將目的 基因和標(biāo)簽蛋白（tag)基因拼接在一起并克隆到載體上并同時表達(dá)，表達(dá)后可以通過識別 和篩選標(biāo)簽蛋白的方式使得目的蛋白被分離和純化出來。通過文獻(xiàn)調(diào)研或NCBI網(wǎng)站上的 序列搜索得到特定的動物變應(yīng)原蛋白cDNA序列，將該序列加上tag，克隆后連接到原核表 達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化入用于表達(dá)蛋白的大腸桿菌中；其中，所使用的tag可以選自但不限于： His-tag、T7_tag、HSV-tag、S-tag、HA-tag、Flag-tag、Myc-tag 等多種。表達(dá)載體可以選自 但不限于：pET系列、pQE系列等。表達(dá)菌株可以選自但不限于：BL21、M25等。
[0051] 2)蛋白表達(dá)：誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；誘導(dǎo)方式選自但不限于：IPTG誘導(dǎo)、高溫誘導(dǎo)、阿拉 伯糖誘導(dǎo)。
[0052] 3)蛋白純化：離心菌體并溶于濃度范圍在一定濃度的PBS緩沖液（優(yōu)選10? 50mM)中，破碎大腸桿菌細(xì)胞收集蛋白包涵體。將收集到的溶液通過特殊的可以特異性結(jié)合 tag的結(jié)合柱（例如連上的tag為His-tag，則使用的結(jié)合柱為鎳柱）。洗滌以除去包涵體 上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸。洗滌后，通過加入強(qiáng)的變性劑使包涵體溶解，洗滌溶液可 以是但不限于：2M尿素與ImM EDTA溶于50mM PBS的洗脫液。變性劑選自但不限于：4? 8M的尿素、2?6M的鹽酸胍。
[0053] 4)蛋白的復(fù)性：復(fù)性方式選自但不限于：稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性等。
[0054] 在上述步驟中，標(biāo)簽蛋白，表達(dá)載體，表達(dá)菌株、IPTG、EDTA、Tris均為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的實驗材料?？寺?、轉(zhuǎn)化、稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的技術(shù)。
[0055] 在另一個具體的實施方案中，參考專利US 7, 667, 009 B2,重組載體表達(dá)包含以下 步驟：
[0056] 1)克隆動物變應(yīng)原蛋白基因并構(gòu)建質(zhì)粒載體；2)蛋白表達(dá)：誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；3)洗 滌和回收包涵體；4)溶解包涵體，然后復(fù)性；5)通過超濾膜濾過小分子，收集變應(yīng)原蛋白； 6)用弱陰離子交換收集非吸收片斷中的蛋白；7)疏水凝膠層析收集吸收片斷里的變應(yīng)原； 8)用強(qiáng)陰離子交換回收變應(yīng)原蛋白。詳細(xì)步驟可以在參考的專利說明書中查到。
[0057] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所選的單一成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白獲得 的方法是天然動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白純化。參考L.Mattsson的文章 Molecular and immunological characterization of Can f 4 ：a dog dander allergen cross-reactive with a 23 kDa odorant-binding protein in cow dander(Clinical&Experimental Allergy，Volume 40，Issue 8，pages 1276-1287，August 2010)及專利 US 5747047A 中 的蛋白純化方法，包括如下步驟：粗提動物毛皮屑蛋白、過分子篩、離子交換層析，更優(yōu)選的 可以進(jìn)一步將純化的蛋白溶液進(jìn)行反向色譜以獲得純度更高的變應(yīng)原蛋白。其中，粗提動 物毛皮屑變應(yīng)原所用的緩沖液以及過分子篩后所溶于的緩沖液選自但不限于：生理鹽水、 pH5. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH7. 5的磷酸 氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH8. 2的coca' s 液、pH8. 9的Tris-鹽酸緩沖液等。在一個較佳的實施方案中，選用的是pH8. 0的磷酸氫二 鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。以上所述的分子篩，離子交換層析，反向色譜均是該領(lǐng)域技術(shù)人員 所熟知的技術(shù)，其中分子篩所使用的大小，離子交換層析中洗脫所用的鹽溶液濃度及梯度， 反向色譜所選用的洗脫液等具體方式均可以因?qū)嶒瀸ο蟮牟煌此杓兓牡鞍椎男?質(zhì)及大小不同）而進(jìn)行調(diào)整，只要這些參數(shù)的選擇有利于特定蛋白的純化，則均可以被采 用。
[0058] 在一個具體的實施方案中，制備該單一成分的動物變應(yīng)原蛋白的方法包括如下步 驟：
[0059] 1)粗提動物毛皮屑蛋白：將動物毛皮屑在緩沖液中破碎收集后，用纖維脂膜過濾 器過濾。
[0060] 2)過分子篩：根據(jù)不同蛋白的分子量大小，選擇不同大小的分子篩。將篩到的一 定大小的蛋白收集后，利用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽后溶于緩沖液中。
[0061] 3)離子交換層析：將上一步過分子篩收集到的蛋白溶液進(jìn)一步進(jìn)行離子交換層 析，并用一定濃度范圍（優(yōu)選濃度范圍在〇?lrnol/L)的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，人工收集各 峰流出液。再根據(jù)洗脫結(jié)果重新用遞進(jìn)式洗脫，將各峰進(jìn)一步拉開。收集正確的峰處的流 出液。進(jìn)行透析以將溶液置換成PH5. 0?7. 0的緩沖液（即前述的液體藥物組合物中的緩 沖液），得到純化后的動物變應(yīng)原蛋白。在一個優(yōu)化的實施方案中，可在透析前先將離子交 換層析分離出的蛋白溶液進(jìn)行反向色譜以分離出純度更高的變應(yīng)原。
[0062] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中所含有的氨基己酸濃度范圍 在0. 3 %?1. 0% w/v。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，液體藥物組合物中所含有的氨基 己酸濃度為〇. 65% w/v。
[0063] 本發(fā)明中所述的"緩沖液"是本【技術(shù)領(lǐng)域】人員所熟知的，包括但不限于：甘氨 酸-鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化 鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-EDTA緩沖液、鄰 苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二 氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼 砂-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液、氯化 鉀-鹽酸緩沖液、氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過市售獲得以上緩 沖液，也可根據(jù)需要配制一定PH值的緩沖液。除非另有所述，本發(fā)明中所述的"pH值"都是 在25 °C條件下所測的pH值。
[0064] 術(shù)語"緩沖有效量"是指所述緩沖液的濃度足以使所述液體藥物組合物的pH維持 在一個特定pH值（優(yōu)選pH5.0?7.0) ±0.5 (更佳±0.3,還要佳±0.2,最佳±0. 1)個pH 單位內(nèi)。例如但不限于,ρΗ6· 0 ± 0· 2 (即ρΗ5· 8?6. 2)，或者ρΗ5· 0 ± 0· 3 (即ρΗ4· 7?5. 3) 等。具體所述緩沖液的濃度與緩沖液的種類、PH值、整個藥物組合物的具體組成等因素有 關(guān)，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)有限次的常規(guī)實驗來方便地確定。一般，所述的液體藥物組 合物中的緩沖液的濃度范圍在5mmol/L?500mmol/L，更優(yōu)選為20?200mmol/L。
[0065] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中的緩沖液的pH的范圍為 pH5. 0?6. 5。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中的緩沖液的pH選自 ρΗ5· 0, ρΗ5· 5, ρΗ6· 0, ρΗ6· 5, ρΗ7· 0。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述的緩沖液選自 pH5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液、ρΗ5. 5的乙酸-EDTA緩沖液、pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸 緩沖液、ΡΗ6. 5的Tris-鹽酸緩沖液、pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0066] 多元醇的作用是賦予變應(yīng)原藥物適宜的滲透張力。在一個實施方案中，所述的液 體藥物組合物中的多元醇選自但不限于丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇，多元 醇的濃度范圍在30%?70% ν/ν。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中多 元醇的濃度范圍在40%?60% ν/ν。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組 合物中的多元醇的濃度范圍在45%?55% ν/ν。在一個更進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述 的液體藥物組合物中的多元醇為45%?55% ν/ν的甘油。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所 述液體藥物組合物中的多元醇為50% ν/ν的甘油。
[0067] 藥用防腐劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它的作用是抑制病原微生物的生長。在 一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物中的藥用防腐劑選自但不限于苯酚、硫柳 汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸鹽類、對羥基苯甲酸酯類、苯甲醇、苯乙醇或其組合。一般，藥用 防腐劑的濃度范圍在〇. 1%?3% w/v。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥物組合物 中的藥用防腐劑為〇. 1 %?0.5% w/v的苯酚。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的液體藥 物組合物中的藥用防腐劑為0. 1 %?0. 2% w/v的山梨酸鉀。在一個更優(yōu)選的實施方案中， 所述的液體藥物組合物中的藥用防腐劑為〇. 4% w/v的苯酚。
[0068] 制備上述液體藥物組合物毛皮屑包括如下步驟：將治療有效量的動物毛皮屑變應(yīng) 原、緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖液、濃度范圍在0. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、多元 醇以及藥用防腐劑混合。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括將〇. 1%?2. 0% w/v 的NaCl加入混合。
[0069] 在一個具體的實施方案中，制備該藥物組合物包含如下步驟：
[0070] 1)將得到的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白（可以選自動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液或單一 成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白或其組合）進(jìn)行檢測，檢測項目包括：總蛋白濃度，主要變應(yīng) 原蛋白濃度。
[0071] 藥物組合物中的總蛋白濃度可以通過Brandford蛋白濃度測定法或BCA蛋白濃度 測定法測定得到。藥物組合物中主要變應(yīng)原蛋白的濃度通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)方法測 定得到。Brandford蛋白濃度測定法、BCA蛋白濃度測定法、ELISA檢測法都是本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的技術(shù)。
[0072] 2)將制備得到的動物毛皮屑變應(yīng)原（可以選自動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液或單一 成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白或其組合）用緩沖有效量的pH5. 0?7. 0的緩沖液混合稀 釋；再加入濃度范圍在0. 1%?2. 0% w/v的氨基己酸、多元醇以及藥用防腐劑（更優(yōu)選的 再加入0. 1 %?2. 0 % w/v的NaCl)。進(jìn)一步優(yōu)選地，可以將得到的藥物組合物進(jìn)行過濾除 菌。所述過濾除菌用的濾膜選自孔徑為3 μ m、0. 8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m的濾膜或其組合。 若使用不同孔徑濾膜組合，則按照孔徑由大至小的順序原則進(jìn)行使用。將藥物組合物進(jìn)行 過濾除菌，有利于該藥物組合物的長期保存。
[0073] 從長期穩(wěn)定性試驗可以得知，本發(fā)明的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物 具有很高的穩(wěn)定性，在2?8°C條件下能穩(wěn)定保存24個月以上。
[0074] 本發(fā)明所述的液體藥物組合物可用于診斷由動物毛皮屑引起的過敏性疾病。所述 的診斷可以是皮膚點刺試驗，其方法為，將含有診斷有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原的藥物滴 于患者前臂，再用點刺針輕輕刺入皮膚表層。如患者對該變應(yīng)原過敏，則會于十五分鐘內(nèi)在 點刺部位出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)與紅暈。
[0075] 本發(fā)明所述的液體藥物組合物可用于由動物毛皮屑引起的過敏性疾病的特異性 免疫治療（脫敏治療）。分別配制濃度由低到高的動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物，給 藥濃度逐漸遞增，至維持濃度長期治療，使患者對所述變應(yīng)原脫敏，從而達(dá)到治療的目的。
[0076] 下面將結(jié)合實施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實施例只是為 了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。
[0077] 實施例一：制備含有貓毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物
[0078] 選擇貓毛皮屑變應(yīng)原浸提物作為變應(yīng)原，制備穩(wěn)定的液體藥物組合物，其具體步 驟如下：
[0079] 1、粉碎：液氮粉碎中華田園貓毛皮屑原材料；
[0080] 2、脫脂：按質(zhì)量體積比約I : 10加入丙酮脫脂，攪拌約2小時，過濾，棄丙酮溶液， 脫脂共3次。至脫脂液目測基本無色。脫脂粉末干燥不少于36小時，至無丙酮味。
[0081] 3、浸提：2?8°C，以I : 20(w/v)的浸提比例加入含有L 0% NaCl的50mM ρΗ8· 2 的磷酸鹽緩沖液，浸提48?60小時。離心及逐級過濾，直至0. 22 μ m濾膜濾過順暢。
[0082] 4、濃縮：將步驟3得到的粗浸提液分成a、b、c、d四組，2?8°C，使用孔徑為5kD 的超濾裝置超濾，a組在超濾過程中連續(xù)加入200mM的pH5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液代替 原浸提緩沖液，b組在超濾過程中連續(xù)加入50mM的pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液代 替原浸提緩沖液，c組在超濾過程中連續(xù)加入50mM的pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 代替原浸提緩沖液。d組在超濾過程中連續(xù)加入生理鹽水代替原浸提緩沖液。超濾過程使 得溶液濃縮至原體積的約1/30。
[0083] 5、將步驟4得到的四組濃縮液使用每組對應(yīng)的溶液（緩沖液或生理鹽水）稀釋4 倍，得到貓毛皮屑浸提液，然后各組分別按照以下步驟進(jìn)行配制：
[0084] a組：每600mL貓毛皮屑浸提液（ρΗ5· 0)中加入20g NaCl、Ig氨基己酸、400mL甘 油、4g苯酚，混勻；
[0085] b組：每500mL貓毛皮屑浸提液（pH6. 0)中加入IOg NaCl、6. 5g氨基己酸、500mL 甘油、4g苯酚，混勻；
[0086] c組：每500mL貓毛皮屑浸提液（ρΗ6· 0)中加入IOg NaCl、500mL甘油、4g苯酚，混 勻；
[0087] d組：每500mL貓毛皮屑浸提液（生理鹽水）中加入500mL甘油、4g苯酚，混勻；
[0088] 6、用0. 22 μ m孔徑的濾器過濾除菌。
[0089] 實施例二：含有貓毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物在2_8°C條件下的長期穩(wěn)定性 試驗
[0090] 按照本發(fā)明實施例一中a、b、c、d四種配比分別制備得到四組含有貓毛皮屑變應(yīng) 原的液體藥物組合物，將其于2-8 °C條件下放置，分別于第0個月、3個月、6個月、9個月、12 個月、24個月末進(jìn)行檢測。通過Brandford法檢測總蛋白濃度、ELISA法檢測主要變應(yīng)原蛋 白Fel d 1濃度。結(jié)果如表1所示：
[0091] 表 1
[0092]
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種穩(wěn)定的含有動物毛皮屑變應(yīng)原的液體藥物組合物，其特征在于，該液體藥物組 合物包含治療有效量或診斷有效量的動物毛皮屑變應(yīng)原、緩沖有效量的PH5. 0?7. 0的緩 沖液、濃度范圍在〇. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、濃度范圍在30%?70% v/v的多元醇以 及藥用防腐劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體藥物組合物，其特征在于，該液體藥物組合物還包含濃 度范圍在〇? 1%?2. 0% w/v的NaCl。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述動物毛皮屑變應(yīng)原選 自貓毛皮屑變應(yīng)原、狗毛皮屑變應(yīng)原、馬毛皮屑變應(yīng)原、牛毛皮屑變應(yīng)原、兔毛皮屑變應(yīng)原、 鼠毛皮屑變應(yīng)原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述動物毛皮屑變應(yīng)原為 動物毛皮屑變應(yīng)原浸提液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述動物毛皮屑變應(yīng)原為 單一成分的動物毛皮屑變應(yīng)原蛋白或其組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，氨基己酸濃度范圍在 CU^nLO^w/v。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述緩沖液的pH值范圍 為 pH5. 0 ?6. 5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述多元醇選自丙二醇、 甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述藥用防腐劑選自苯 酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸鹽類、對羥基苯甲酸酯類、苯甲醇、苯乙醇或其組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液體藥物組合物，其特征在于，所述液體藥物組合物的 劑型選自：口服劑、皮下注射劑、舌下含服劑、氣霧劑、鼻腔劑、皮膚點刺劑。
【文檔編號】A61K39/35GK104491858SQ201410719332
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】李勤 申請人:浙江我武生物科技股份有限公司